Цяперашні адрас: OX11 0DE, Вялікабрытанія, будынак Diamond, навукова-інавацыйны парк Харвел, Дыеткот, Оксфардшыр, Вялікабрытанія, Diamond Light Source Co., Ltd., Цэнтр электроннай біялагічнай візуалізацыі.
Святлазбіральны комплекс рэакцыйнага цэнтра 1 (RC-LH1) з'яўляецца асноўным фотасінтэтычным кампанентам пурпурных фотатрофных бактэрый. Мы прадставілі дзве крыяэлектронна-мікраскапічныя структуры комплексу RC-LH1 з Rhodopseudomonas palustris. Структура комплексу RC-LH114-W з разрозненнем 2,65 Å складаецца з 14 субадзінак LH1-пятлі, якія атачаюць RC, які перапынены бялком W, у той час як комплекс без бялку W цалкам мае RC-кампазіцыю, акружаную RC. Замкнёная пятля LH1 з 16 субадзінак. Параўнанне гэтых структур дае ўяўленне аб дынаміцы хінону ў комплексе RC-LH1, уключаючы раней не вызначаныя канфармацыйныя змены пры звязванні хінону ў сайце QB RC, а таксама аб размяшчэнні дапаможных участкаў звязвання хінону, якія дапамагаюць перадаваць іх RC. Унікальная структура бялку W прадухіляе замыканне пятлі LH1, тым самым ствараючы канал для паскарэння абмену хінон/хіналон.
Энергія, якая забяспечваецца фотасінтэзам, можа падтрымліваць практычна ўсё жыццё на Зямлі і мае вялікі патэнцыял для сонечнай біятэхналогіі. Спрыяючы глабальнаму фотасінтэзу, пурпурныя фотатрофныя бактэрыі таксама дэманструюць розныя энергетычныя рэжымы і метабалічныя здольнасці. Яны могуць пазбягаць фотасінтэзу і расці як гетэратрофныя бактэрыі ў цемры, могуць фіксаваць азот і вуглякіслы газ, выпрацоўваць вадарод і раскладаць араматычныя злучэнні (1-3). Каб забяспечыць энергіяй гэтыя працэсы, святло павінна хутка і эфектыўна пераўтварацца ў хімічную энергію. Гэты працэс пачынаецца, калі комплекс антэн, які ўлоўлівае святло, паглынае святло і перадае захопленую энергію ў рэакцыйны цэнтр (RC), тым самым запускаючы падзел зарадаў (4-7). Асноўная адзінка фотасінтэзу ў пурпурных фотатрофных бактэрый складаецца з RC тыпу 2, акружанага комплексам, які ўлоўлівае святло 1 (LH1), які ўтварае асноўны комплекс RC-LH1. LH1 утвораны масівам выгнутых гетэрадымераў αβ, кожны з якіх звязвае дзве малекулы бактэрыяльнага хларафіла (BChl) a і адзін або два каратыноіды (8-12). Найпрасцейшая антэна LH1 складаецца з 16 ці 17 αβ гетэрадымераў, якія акружаюць RC (9-13) у замкнёнай пятлі, але ў іншых асноўных комплексах трансмембранныя пептыды парушаюць бесперапыннасць навакольнага LH1, тым самым спрыяючы дыфузіі хінолу/хінону паміж RC і комплексам цытахрому bc1 (11, 13-15). Фіялетавая фотатрофная расліна Rhodopseudomonas (Rps.) з'яўляецца мадэльным арганізмам, які можа разумець перанос энергіі і электронаў, які падтрымлівае фотасінтэз. Першая крыштальная структура Rps. Мадэллю комплексу palustris RC-LH1 з'яўляецца RC, акружаны 15 гетэрадымернымі пятлямі LH1, якія перапыняюцца невядомым бялком пад назвай «Protein W» (14). Protein-W быў пасля ідэнтыфікаваны як RPA4402, які ўяўляе сабой неахарактарызаваны бялок 10,5 кДа з трыма прадказанымі трансмембраннымі спіралямі (TMH) (16). Мы прапануем перайменаваць ген rpa4402, які кадуе бялок W, у pufW, каб адпавядаць наменклатуры, якая выкарыстоўваецца для генаў, якія кадуюць субадзінкі RC-L, M (pufL, pufM) і LH1α, β (pufA, pufB). Цікава, што бялок W прысутнічае толькі прыкладна ў 10% RC-LH1, што сведчыць аб тым, што Rps. palustris утварае два розныя комплексы RC-LH1. Тут мы паведамляем пра крыя-ЭМ (cryo-EM) структуры высокага разрознення двух асноўных комплексаў, адзін з бялком W і 14 αβ гетэрадымерамі, другі без бялку W і замкнёнай 16-гетэрадымернай пятлёй LH1. Наша структура ўяўляе сабой крок наперад у разуменні комплексу RC-LH1 Rps. palustris, паколькі мы прааналізавалі аднародную папуляцыю кожнага варыянта і маем дастатковую разрозненне, каб выразна прызначыць кожны пептыд і звязаныя пігменты, а таксама роднасныя ліпіды і хіноны. Параўнанне гэтых структур паказвае, што тры бялкі TMH-W, якія да гэтага часу не былі знойдзены ні ў адным іншым комплексе RC-LH1, генеруюць хінонавы канал для паскарэння абмену хінон/хінолон. Быў ідэнтыфікаваны шэраг кансерватыўных участкаў звязвання ліпідаў і хінонаў, і мы выявілі новую канфармацыйную змену пасля спалучэння хінону і RC, якая можа падыходзіць для RC фотасістэмы II (PSII) кіслародна насычаных фотатрофных арганізмаў. Нашы высновы даюць новае разуменне кінетыкі звязвання і абмену хінон/хінолон у асноўным комплексе RC-LH1 пурпурных фотатрофных бактэрый.
Каб палегчыць дэталёвае вывучэнне двух комплексаў, выяўленых у Rps. palustris, мы вылучылі кожны RC-LH1 біяхімічнымі метадамі. Комплекс з дэфіцытам бялку W (далей ΔpufW) быў ачышчаны ад штама, у якога адсутнічае ген pufW (16), і можа быць атрыманы толькі адзін комплекс RC-LH1. Комплекс, які змяшчае бялок W, выпрацоўваецца штамам. Бялок W гэтага штама мадыфікаваны 10-кратнай меткай His на сваім C-канцы, так што комплекс, які змяшчае бялок W, можа эфектыўна спалучацца з найбольш адсутным бялком W шляхам імабілізацыі металу. Комплекс эфектыўна аддзяляецца (16) з дапамогай афіннай храматаграфіі (IMAC).
Як паказана на малюнку 1, абодва комплексы ўтрымліваюць трохпадраздзяленне RC (RC-L, RC-M і RC-H), акружанае антэнай LH1. Структура 2,80 Å комплексу без бялку W паказвае 16 αβ гетэрадымераў, якія ўтвараюць замкнёную пятлю LH1, цалкам акружаючую RC, далей — комплекс RC-LH116. Структура 2,65 Å комплексу, які змяшчае бялок W, мае 14-гетэрадымер LH1, перапынены бялком W, далей — RC-LH114-W.
(A і B) Павярхоўнае прадстаўленне злучэння. (C і D) Звязаныя пігменты, выяўленыя ў выглядзе палачак. (E і F) Комплексы, якія назіраюцца з цытаплазматычнай паверхні, маюць пептыды і субадзінкі LH1, прадстаўленыя ў малюнках, і пранумараваны па гадзіннікавай стрэлцы ад прамежку бялок-W [у адпаведнасці з нумарацыяй Rba. комплекс sphaeroides (13)]. Для LH1-α колер бялковай субадзінкі жоўты; для LH1-β колер бялковай субадзінкі сіні; для бялку-W бялок чырвоны; для RC-H ён блакітны; для RC-L ён аранжавы; для RC-M, пурпурны. Кафактары прадстаўлены палачкамі, зялёны колер прадстаўляе малекулы BChl і BPh a, фіялетавы — каратыноіды, а жоўты — малекулы UQ10. (G і H) Павялічаны выгляд прамежку бялок-W у эквівалентнай вобласці комплексу RC-LH114-W (G) і комплексу RC-LH116 (H). Кафактары паказаны ў выглядзе запаўнення прасторы, хелатны хінон паказаны сінім колерам. Шчыліна бялок-W выдзелена сіняй пункцірнай лініяй у (G), а невялікія адтуліны, дзе хінон/хінолол дыфузуе па кольцы LH116, выдзелены чорнай пункцірнай лініяй у (H).
На малюнку 1 (A і B) паказаны RC, акружаны адкрытымі або замкнёнымі масівамі гетэрадымераў LH1αβ, кожны з якіх звязвае два BChl і адзін каратыноід (малюнак 1, C і D). Папярэднія даследаванні паказалі, што Rps з'яўляецца комплексам LH1. У біясінтэтычным шляху ксантыну спіруліны гэтыя віды ўтрымліваюць змешаныя папуляцыі каратыноідаў (17). Аднак спірапіраксанцін з'яўляецца дамінантным каратыноідам, і яго шчыльнасць здавальняючая. Таму мы вырашылі мадэляваць спіраксанцін ва ўсіх месцах звязвання LH1. Альфа- і бэта-паліпептыды - гэта адзінкавыя TMH з кароткімі вонкавымі абласцямі мембраны (малюнак 1, A, B, E і F). Нягледзячы на ​​тое, што шчыльнасць 17 рэшткаў на C-канцы не назіралася, альфа-паліпептыд быў расшчаплены ад Met1 да Ala46 у абодвух комплексах. β-паліпептыд быў адноўлены ад Gly4 да Tyr52 у RC-LH116 і ад Ser5 да Tyr52 у RC-LH114-W. Шчыльнасць 3 ці 4 N-канцавых або 13 C-канцавых рэшткаў не назіралася (малюнак S1). Мас-спектрометрычны аналіз змешанага комплексу RC-LH1, падрыхтаванага з штама дзікага тыпу, паказаў, што адсутная вобласць з'яўляецца вынікам гетэралагічнага расшчаплення гэтых пептыдаў (малюнкі S1 і S2). Таксама назіралася N-канцавое фарміляванне α-Met1 (f). Аналіз паказаў, што α-пептыд складаецца з рэшткаў fMet1 да Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, а β-пептыд складаецца з рэшткаў Ser2 да Ala53, што добра адпавядае карце шчыльнасці нізкатэмпературнай ЭМ.
Каардынацыя α-His29 і β-His36 прымушае BChls размяшчацца тварам да твару; кожны гетэрадымер αβ збіраецца са сваімі суседзямі, утвараючы адкрытую пятлю (RC-LH114-W) або замкнёную пятлю (RC-LH116) вакол RC-эксітонна-звязанага пігментнага масіва (малюнак 1, C і D). У параўнанні з паласой 877 нм RC-LH114-W, чырвоны зрух паглынання RC-LH116 пры 880 нм складае 3 нм (малюнак 2A). Аднак спектр кругавога дыхаізму амаль аднолькавы (малюнак 2B), што сведчыць аб тым, што, хоць існуе відавочная розніца паміж адкрытымі і замкнёнымі пятлямі, лакальнае асяроддзе BChls вельмі падобнае. Чырвоны зрух паглынання можа быць вынікам зніжэння цеплавога руху і павышэння стабільнасці ў замкнёнай пятлі (18, 19), змены сувязі пігмента, выкліканай замкнёнай пятлёй (20, 21), або спалучэння гэтых двух эфектаў (11).
(A) Спектр паглынання ў ультрафіялетавым/бачным/блізкім інфрачырвоным дыяпазоне, пікі якога пазначаны адпаведнымі пігментамі і нармалізаваны адносна піка BPh пры 775 нм. (B) Спектр кругавога дыхаізму, нармалізаваны адносна паглынання BChl пры 805 нм. (C і D) Выбраныя ΔA-спектры з часава-разрозненых спектраў паглынання комплексу RC-LH114-W (C) і комплексу RC-LH116 (D). Для лепшага параўнання ўсе спектры нармалізаваны адносна ΔA ад −A пры 0,2 пс. (E) Хуткасць акіслення цытахрому с2 пасля апрамянення ў прысутнасці розных канцэнтрацый UQ2 (гл. малюнак S8 для неапрацаваных дадзеных). (F) У клетках, вырашчаных пры нізкай, сярэдняй або высокай інтэнсіўнасці святла (10, 30 або 300 мкМ/с адпаведна), субадзінкі бялку W і RC-L у ачышчаным комплексе і суадносіны падзеленых мембран. Вызначце ўзровень бялку з дапамогай электрафарэзу ў поліакрыламідным гелі з додецылам натрыю (SDS) і імунаферментнага аналізу (гл. малюнак S9 для неапрацаваных дадзеных). Вызначце суадносіны адносна ачышчанага комплексу RC-LH114-W. Стэхіаметрычнае суадносіны RC-L да бялку-W комплексу складае 1:1.
БХл у становішчы 1 у дэфармаванай пятлі αβ14 RC-LH114-W (малюнак 1, A, C і E) знаходзяцца бліжэй да першаснага донара RC (P) на 6,8 Å, чым эквівалентныя БХл у RC-LH116 (малюнак 1, B, D і F, а таксама малюнак S3); аднак кінетыка пераходнага паглынання двух комплексаў паказвае, што для RC-LH114-W і RC-LH116 канстанты часу перадачы энергіі ўзбуджэння ад LH1 да RC складаюць 40 ± 4 і 44 ± 3 пс (малюнак 2). , C і D, малюнак S4 і табліца S2). Таксама няма істотнай розніцы ў перадачы электронаў унутры RC (малюнак S5 і адпаведны дадатковы тэкст). Мы мяркуем, што блізкае адпаведнасць часу перадачы энергіі паміж LH1 і RC-P абумоўлена падобнай адлегласцю, вуглом і патэнцыяльнай энергіяй большасці БХл у дзвюх пятлях LH1. Здаецца, што вывучэнне энергетычнай карціны LH1 для дасягнення мінімальнай адлегласці не хутчэйшае, чым прамы перанос энергіі з неаптымальных участкаў да RC. Разамкнуты цыкл LH1 у RC-LH114-W таксама можа падвяргацца нязначнаму цеплавому руху пры нізкіх тэмпературах для структурнага аналізу, і пры пакаёвай тэмпературы назіраецца больш доўгая канфармацыя кольца αβ14 у параўнанні з адлегласцью пігментацыі βBChls у становішчы RC1.
Комплекс RC-LH116 змяшчае 32 BChl і 16 каратыноідаў, і яго агульная структура такая ж, як і ў атрыманых з Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Банк даных аб бялках (PDB) ID 5Y5S] (9), штама Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) і зялёных водарасцяў (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Пасля выраўноўвання назіраліся толькі невялікія адхіленні ў пазіцыях αβ гетэрадымераў, асабліва 1-5, 15 і 16 (малюнак S6). Прысутнасць бялку-W аказвае значны ўплыў на структуру LH1. Яго тры TMH злучаны кароткімі пятлямі, прычым N-канцавы знаходзіцца на баку прасвету комплексу, а C-канцавы — на цытаплазматычным баку (малюнкі 1A і 3, A-D). Бялок-W у значнай ступені гідрафобны (малюнак 3B), а TMH2 і TMH3 узаемадзейнічаюць з LH1αβ-14, утвараючы трансмембранную паверхню (малюнак 3, B і E-G). Паверхня ў асноўным складаецца з рэшткаў Phe, Leu і Val у трансмембраннай вобласці. Гэтыя рэшткі згрупаваны з гідрафобнымі амінакіслотамі і пігментамі αβ-14. Некаторыя палярныя рэшткі таксама спрыяюць узаемадзеянню, у тым ліку вадародная сувязь паміж W-Thr68 і β-Trp42 на паверхні комплекснай поласці (малюнак 3, F і G). На паверхні цытаплазмы Gln34 прылягае да кетагрупы каратыноідаў αβ-14. Акрамя таго, малекула n-дадэцылβ-d-мальтазіду (β-DDM) была раздзялена, і яе гідрафобны хвост працягнуўся да мяжы паміж бялком-W і αβ-14, прычым ліпідны хвост можа знаходзіцца ў целе. Мы таксама заўважылі, што C-канцавыя вобласці раздзялення бялку W і RCH вельмі блізкія, але не ў межах утварэння спецыфічных узаемадзеянняў (Малюнак 1, A і E). Аднак могуць быць узаемадзеянні ў нераздзяляльных C-канцавых амінакіслотах гэтых двух бялкоў, што можа забяспечыць механізм для рэкрутавання бялку W падчас зборкі комплексу RC-LH114-W.
(A) Бялок-W, які звернуты да мяжы з LH1αβ14 у мультфільме, мае стрыжаньчаты бакавы ланцуг (чырвоны), паказаны ў частцы дыяграмы электрастатычнага патэнцыялу (празрыстая шэрая паверхня з узроўнем контуру 0,13). (B) Бялок-W прадстаўлены гідрафобнай каляровай паверхняй. Палярныя і зараджаныя вобласці паказаны блакітным колерам, гідрафобныя вобласці - белым, а моцна гідрафобныя вобласці - аранжавым. (C і D) Бялок-W, паказаны ў мультфільме, яго арыентацыя такая ж, як у (A) (C), і павернуты на 180° (D). У залежнасці ад становішча ў паслядоўнасці, адрозныя рэшткі прымаюць вясёлкавую каляровую схему, дзе N-канцавы злучальнік сіні, а C-канцавы - чырвоны. (E) Бялок-W у тым жа выглядзе, што і ў (A), а рэшткі на мяжы бялку-W:LH1 прадстаўлены стрыжнямі з прымацаванымі пазнакамі. (F) Бялок-W павернуты на 90° адносна (E) і LH1αβ14 у мультфільме і адносна рэшткаў на мяжы ў слупку. Выступаючыя рэшткі бэта-паліпептыду пазначаны. Кафактар ​​паказаны ў выглядзе палоскі, колер якой адпавядае колеру малюнка 1, раскладзены β-DDM паказаны шэрым колерам, а кісларод паказаны чырвоным. (G) Выгляд на (F) павернуты на 180°, з бачным рэшткам пазначанага альфа-паліпептыду.
Бялок-W замяняе гетэрадымер αβ (15-ы на малюнку 1F), тым самым прадухіляючы замыканне пятлі і нахіл першых трох гетэрадымераў αβ. Было заўважана, што максімальны вугал нахілу першага гетэрадымера αβ-1 адносна нармалі плёнкі складаў ад 25° да 29° (малюнак 1, A і E), які быў утвораны нахілам αβ-1 ад 2° да 8° у RC A рэзкі кантраст-LH116 (малюнак 1, B і F). Другі і трэці гетэрадымеры нахілены пад вугламі ад 12° да 22° і ад 5° да 10° адпаведна. З-за стэрычных перашкод RC нахіл αβ-1 не ўключае другую пару αβ (што адпавядае 16-му αβ на малюнку 1F), утвараючы такім чынам відавочную шчыліну ў кольцы LH1 (малюнак 1, A і E). З-за адсутнасці двух гетэрадымераў αβ, што суправаджаецца стратай чатырох BChl і двух каратыноідаў, ні адзін з каратыноідаў не звязваецца са скручанай субадзінкай αβ-1, у выніку чаго ўтвараецца кольца LH114-W, якое змяшчае 13 каратыноідаў Vegetarian і 28 BChl. Ацэнкі лакальнага разрознення двух комплексаў у рэгіёнах αβ1-7 ніжэйшыя, чым для астатняй часткі пятлі LH1, што можа адлюстроўваць уласцівую пластычнасць субадзінкі LH1, прылеглай да сайта RC QB (малюнак 4).
Выявы RC-LH114-W (A і B) і RC-LH116 (C і D) паказаны з таго ж выгляду зверху/выгляду збоку (A і B) (A і C) і паверхні паражніны, як на мал. 1 (B і D). Каляровыя клавішы паказаны справа.
Адзіным іншым характэрным асноўным комплексам са стехіаметрычным суадносінамі 1:14 з'яўляецца дымер Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Аднак бялок W і PufX не маюць відавочнай гамалогіі і аказваюць значны ўплыў на адпаведныя структуры LH1. PufX — гэта адзіны TMH з N-канцавым цытаплазматычным даменам, які ўзаемадзейнічае з цытаплазматычным бокам субадзінкі RC-H (13) у становішчы, якое адпавядае Rps. palustris LH116αβ-16. PufX стварае канал для абмену хінон/хіналон паміж RC-LH1 і комплексам цытахрому bcl і прысутнічае ва ўсіх асноўных комплексах Rba. sphaeroides (13). Нягледзячы на ​​тое, што інтэрфейс манамер-манамер знаходзіцца ў Rba. Дымер сфероидов RC-LH1-PufX размешчаны ў пазіцыі звязвання бялку W у RC-LH114-W, і шчыліна, выкліканая PufX і бялком-W, знаходзіцца ў эквівалентнай пазіцыі (малюнак S7A). Шчыліна ў RC-LH114-W таксама супадае з гіпатэтычным хінонавым каналам (8) Pseudomonas rosea LH1, які ўтвораны пептыдамі, не звязанымі з бялком W або PufX (малюнак S7B). Акрамя таго, хінонавы канал у Blc. Смарагдава-зялёны LH1, утвораны шляхам выключэння адной γ-субадзінкі (7), размешчаны ў падобнай пазіцыі (малюнак S7C). Нягледзячы на ​​тое, што гэта апасродкавана рознымі бялкамі, з'яўленне гэтых хінонавых/хінолальных каналаў у агульнай пазіцыі ў комплексе RC-LH1, здаецца, з'яўляецца прыкладам канвергентнай эвалюцыі, што сведчыць аб тым, што шчыліна, створаная бялком W, можа выступаць у якасці хінонавага канала.
Шчыліна ў пятлі LH114-W дазваляе ўтвараць бесперапынную мембранную вобласць паміж унутранай прасторай комплексу RC-LH114-W і асноўнай мембранай (малюнак 1G), а не злучаць два дамены праз бялковую пору, як у бялках. Комплекс RC-LH116 падобны да замкнёнага ігольчастага комплексу Tch (22) (малюнак 1H). Паколькі дыфузія хінону праз мембрану хутчэйшая, чым дыфузія праз вузкі бялковы канал, адкрытая пятля LH114-W можа дазволіць хутчэйшую абарот RC, чым замкнёная пятля LH116, і дыфузія хінону ў RC можа быць больш абмежаванай. Каб праверыць, ці ўплывае бялок W на пераўтварэнне хінонаў праз RC, мы правялі аналіз акіслення цытахрому на пэўнай канцэнтрацыі ўбіхінону 2 (UQ2) (аналаг натуральнага UQ10 з больш кароткім ізапрэнавым хвастом) (малюнак 2E). Нягледзячы на ​​тое, што прысутнасць хелатнага хінону перашкаджае дакладнаму вызначэнню бачнай пастаяннай Міхаэліса (RC-LH114-W і RC-LH116 падыходзяць для 0,2±0,1 мкМ і 0,5±0,2 мкМ адпаведна), максімальная хуткасць RC-LH114-W (4,6±0,2 е-RC-1 с-1) на 28±5% большая, чым у RC-LH116 (3,6±0,1 е-RC-1 с-1).
Спачатку мы падлічылі, што бялок-W прысутнічае прыкладна ў 10% асноўнага комплексу (16); тут узровень запаўняльнасці клетак росту пры нізкім, сярэднім і высокім асвятленні складае 15±0,6%, 11±1% і 0,9±0,5% адпаведна (малюнак 2F). Колькаснае параўнанне мас-спектрометрыі паказала, што даданне гістыдынавай меткі не змяншае адносную колькасць бялку-W у параўнанні са штамамі дзікага тыпу (P = 0,59), таму гэтыя ўзроўні не з'яўляюцца артэфактам мадыфікаванага бялку-W (малюнак S10). Аднак гэтая нізкая запаўняльнасць бялку-W у комплексе RC-LH1 можа дазволіць некаторым RC пераключацца з паскоранай хуткасцю, тым самым змякчаючы больш павольны абмен хінон/хіналон у комплексе RC-LH116. Мы заўважылі, што ўзровень запаўняльнасці пры высокім асвятленні не адпавядае нядаўнім дадзеным транскрыптомікі, што сведчыць аб павелічэнні экспрэсіі гена pufW пры моцным асвятленні (малюнак S11) (23). Розніца паміж транскрыпцыяй pufW і ўключэннем бялку W у комплекс RC-LH1 з'яўляецца заблытанай і можа адлюстроўваць складаную рэгуляцыю бялку.
У RC-LH114-W выдзелена і мадэлюецца 6 малекул кардыяліпіну (CDL), 7 фасфатыдылхаліну (POPC), 1 фасфатыдылгліцэрын (POPG) і 29 малекул β-DDM: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG і 12 βDDM. RC-LH116 (малюнак 5, A і B). У гэтых двух структурах CDL амаль цалкам размешчаны на цытаплазматычным баку комплексу, у той час як POPC, POPG і β-DDM пераважна размешчаны на прасветным баку. Дзве малекулы ліпідаў і дэтэргентаў былі выдзелены ў вобласці αβ-1 да αβ-6 комплексу RC-LH114-W (малюнак 5A), а пяць былі выдзелены ў эквівалентнай вобласці RC-LH116 (малюнак 5B). Больш ліпідаў было выяўлена на іншым баку комплексу, у асноўным CDL, якія назапашваліся паміж RC і αβ-7 да αβ-13 (малюнак 5, A і B). Іншыя структурна разрозненыя ліпіды і дэтэргенты размешчаны па-за кольцам LH1, і добра разрозненыя ацыльныя ланцугі распасціраюцца паміж субадзінкамі LH1, папярэдне пазначанымі як β-DDM у RC-LH114-W і вызначанымі як β-DDM у RC A сумесь β-DDM і POPC-LH116. Падобныя пазіцыі хелатных ліпідаў і дэтэргентаў у нашай структуры паказваюць, што яны з'яўляюцца фізіялагічна значнымі сайтамі звязвання (малюнак S12A). Пазіцыі эквівалентных малекул у Tch таксама маюць добрую кансістэнцыю. Gentle і Trv. Штам 970 RC-LH1s (малюнак S12, B-E) (9, 12) і вадародныя рэшткі ліпіднай галоўкі паказалі даволі добрую захаванасць у выраўноўванні паслядоўнасці (малюнак S13), што паказвае на захаванасць CDL, які звязваецца з RC (24), гэтыя сайты могуць быць захаваны ў комплексе RC-LH1.
(A і B) Пептыды RC-LH114-W (A) і RC-LH116 (B) прадстаўлены малюнкамі, а пігменты — палачкамі, згодна з каляровай схемай на малюнку 1. Ліпіды паказаны чырвоным колерам, а дэтэргенты — шэрым. UQ, звязаны з сайтамі RC QA і QB, пазначаны жоўтым, а ізаляваны UQ — сінім. (C і D) Тыя ж віды, што і ў (A) і (B), ліпіды апушчаны. (E-G) Павялічаны від Q1(E), Q2(F) і Q3(G) з RC-LH116 з бакавымі ланцугамі, якія ўплываюць адзін на аднаго. Вадародныя сувязі паказаны чорнымі пункцірнымі лініямі.
У RC-LH116 як RC QA, так і QB UQ, якія ўдзельнічаюць у пераносе электронаў у працэсе падзелу зарадаў, раскладаюцца ў сваіх месцах звязвання. Аднак у RC-LH114-W хінон QB не быў вылучаны і будзе падрабязна абмеркаваны ніжэй. Акрамя хінонаў QA і QB, у структуры RC-LH114-W вылучаны дзве хелатныя малекулы UQ (размешчаныя паміж кольцамі RC і LH1) у адпаведнасці з іх добра вылучанымі галаўнымі групамі (размешчанымі ў Q1 і Q2 адпаведна). (Малюнак 5C). Дзве ізапрэнавыя адзінкі аднесены да Q1, і карта шчыльнасці вылучае поўныя 10 ізапрэнавых хвастоў Q2. У структуры RC-LH116 былі вылучаны тры хелатныя малекулы UQ10 (Q1-Q3, Малюнак 5D), і ўсе малекулы маюць выразную шчыльнасць па ўсім хвасце (Малюнак 5, D-G). У дзвюх структурах пазіцыі хінонавых галаўных груп Q1 і Q2 маюць выдатную кансістэнцыю (малюнак S12F), і яны ўзаемадзейнічаюць толькі з RC. Q1 размешчаны ля ўваходу ў W-шчыліну RC-LH114-W (малюнак 1G і 5, C, D і E), а Q2 размешчаны паблізу сайта звязвання QB (малюнак 5, C, D і F). Захаваныя рэшткі L-Trp143 і L-Trp269 вельмі блізкія да Q1 і Q2 і забяспечваюць патэнцыйныя π-стэкінгавыя ўзаемадзеянні (малюнак 5, E і F, і малюнак S12). L-Gln88, размешчаны на адлегласці 3,0 Å ад дыстальнага кіслароду Q1, забяспечвае моцную вадародную сувязь (малюнак 5E); гэты рэшту захаваны ва ўсіх RC, акрамя найбольш аддаленай сувязі (малюнак S13). L-Ser91 кансерватыўна замяшчаецца на Thr у большасці іншых RC (малюнак S13), знаходзіцца на адлегласці 3,8 Å ад метыльнага кіслароду Q1 і можа ўтвараць слабыя вадародныя сувязі (малюнак 5E). Q3, відаць, не мае спецыфічнага ўзаемадзеяння, але размешчаны ў гідрафобнай вобласці паміж субадзінкай RC-M і субадзінкай LH1-α з 5 па 6 (малюнак 5, D і G). Q1, Q2 і Q3 або бліжэйшыя хелатныя хіноны таксама былі выяўлены ў Tch. Gentle, Trv. Strain 970 і Blc. Структура ірысавай абалонкі (9, 10, 12) паказвае на кансерватыўны дапаможны сайт звязвання хінону ў комплексе RC-LH1 (малюнак S12G). Пяць раскладзеных UQ у RC-LH116 добра суадносяцца з 5,8±0,7 для кожнага комплексу, вызначанымі метадам высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі (ВЭЖХ), у той час як тры раскладзеныя UQ у RC-LH114-W ніжэйшыя за . Вымеранае значэнне 6,2±0,3 (мал. S14) паказвае на наяўнасць неразлажаных малекул UQ у структуры.
Псеўдасіметрычныя L- і M-палептыды ўтрымліваюць па пяць TMH і ўтвараюць гетэрадымер, які спалучае адзін дымер BChl, два манамеры BChl, два манамеры бактэрыяфага (BPh) і адно негемавае жалеза і адну ці дзве малекулы UQ10. Дзякуючы наяўнасці вадародных сувязяў на тэрмінальнай кетонавай групе і яе вядомаму назапашванню ў Rps, каратыноіды ўключаюцца ў M-субадзінку, якая называецца цыс-3,4-дэгідраорадапін. Віды (25). Дамен вонкавай мембраны RC-H прымацаваны да мембраны адным TMH. Агульная структура RC падобная да трохсубадзінак RC роднасных відаў (такіх як Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Макрацыклы BChl і BPh, каратыноідны каркас і негемавае жалеза перакрываюцца ў дыяпазоне разрознення гэтых структур, як і галоўная група UQ10 у сайце QA і хінон QB у RC-LH116 (малюнак S15).
Наяўнасць дзвюх структур RC з рознымі ступенямі занятасці QB-сайтаў дае новую магчымасць вывучыць паслядоўныя канфармацыйныя змены, якія суправаджаюць звязванне QB-хінону. У комплексе RC-LH116 QB-хінон размешчаны ў цалкам звязаным «праксімальным» становішчы (26), але аддзяленне RC-LH114-W не мае QB-хінону. У RC-LH114-W няма QB-хінону, што дзіўна, бо комплекс актыўны, больш, чым комплекс RC-LH116 са структурна аддзеленым QB-хінонам. Нягледзячы на ​​тое, што два кольцы LH1 хелатна ўтвараюць каля шасці хінонаў, пяць структурна аддзеленыя ў закрытым кольцы RC-LH116, у той час як толькі тры структурна абмежаваныя ў адкрытым кольцы RC-LH114-W. Гэта павелічэнне структурнага разладу можа адлюстроўваць больш хуткае замяшчэнне QB-сайтаў RC-LH114-W, больш хуткую кінетыку хінону ў комплексе і павышаную верагоднасць перасячэння пятлі LH1. Мы мяркуем, што адсутнасць UQ у сайце QB RC-LH114-W можа быць вынікам больш складанага і больш актыўнага комплексу, і сайт QB RC-LH114-W быў неадкладна замарожаны ў абароце UQ. Канкрэтная стадыя (уваход у сайт QB быў зачынены) адлюстроўвае канфармацыю гэтай актыўнасці.
Без QB адбываецца суправаджальнае кручэнне L-Phe217 у становішча, несумяшчальнае са звязваннем UQ10, паколькі гэта выкліча прасторавае сутыкненне з першай ізапрэнавай адзінкай хваста (малюнак 6A). Акрамя таго, відавочныя асноўныя канфармацыйныя змены, асабліва спіраль de (кароткая спіраль у пятлі паміж TMH D і E), дзе L-Phe217 зрушваецца ў кішэню звязвання QB, і кручэнне L-Tyr223 (малюнак 6A), каб разарваць вадародную сувязь з каркасам M-Asp45 і закрыць уваход у сайт звязвання QB (малюнак 6B). Спіраль de паварочваецца ля сваёй асновы, Cα L-Ser209 зрушваецца на 0,33 Å, а L-Val221Cα зрушваецца на 3,52 Å. Няма назіраных змен у TMH D і E, якія накладваюцца ў абедзвюх структурах (малюнак 6A). Наколькі нам вядома, гэта першая структура ў натуральным RC, якая замыкае сайт QB. Параўнанне з поўнай (QB-звязанай) структурай паказвае, што перад тым, як хінон аднавіцца, неабходная канфармацыйная змена, каб ён увайшоў у склад хінону. L-Phe217 паварочваецца, утвараючы π-стэкінг-узаемадзеянне з галоўнай групай хінону, і спіраль зрушваецца вонкі, дазваляючы шкілету L-Gly222 і бакавым ланцугу L-Tyr223 утвараць сетку вадародных сувязей са стабільнай структурай вадародных сувязей (Малюнак 6, А і С).
(A) Перакрываючаяся галаграмная (L-ланцуг, аранжавы/M-ланцуг, пурпурны) і апо- (шэры) структура, на якой ключавыя рэшткі адлюстраваны ў выглядзе стрыжнепадобнага адлюстравання. UQ10 прадстаўлены жоўтай паласой. Пункцірная лінія паказвае вадародныя сувязі, якія ўтвараюцца ва ўсёй структуры. (B і C) Павярхоўнае адлюстраванне апаліпапратэіна і ўсёй кальцавой структуры, з вылучэннем кіслароду бакавога ланцуга L-Phe217 сінім колерам і L-Tyr223 чырвоным колерам адпаведна. L-субадзінка аранжавая; M- і H-субадзінкі не афарбаваныя. (D і E) Апаліпапратэін (D) і цэлыя (E) сайты RC QB [размаляваныя (A) адпаведна] і Thermophilus thermophilus PSII (зялёны, сіні з пластыкавым хінонам; PDB ID: 3WU2) Выраўноўванне (58).
Нечакана, хоць даступна некалькі структур QB-дэфіцытных RC без LH1, канфармацыйныя змены, якія назіраліся ў гэтым даследаванні, раней не паведамляліся. Да іх адносяцца структура з дэфіцытам QB з Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) і Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), усе з якіх амаль ідэнтычныя іх агульнай структуры QB. Уважлівае вывучэнне 3PRC паказала, што малекулы дэтэргента LDAO (лаўрылдыметыламінааксід) звязваюцца ля ўваходу ў пазіцыю QB, што можа перашкаджаць перагрупоўцы ў замкнёную канфармацыю. Нягледзячы на ​​тое, што LDAO не раскладаецца ў той жа пазіцыі ў 1EYS або 1OGV, гэтыя RC атрымліваюць з выкарыстаннем таго ж дэтэргента і таму могуць выклікаць той жа эфект. Крышталічная структура Rba. Sphaeroides RC, сумесна крышталізаваны з цытахромам с2 (PDB ID: 1L9B), таксама, відаць, мае закрыты сайт QB. Аднак у гэтым выпадку N-канцавая вобласць поліпептыда RC-M (якая ўзаемадзейнічае з сайтам звязвання QB праз H-сувязь рэшткаў Tyr на Q-спіралі) прымае ненатуральную канфармацыю, і канфармацыйная змена QB далей не даследуецца (30). Суцяшае тое, што мы не назіралі такой дэфармацыі поліпептыда M у структуры RC-LH114-W, якая амаль такая ж, як N-канцавая вобласць RC-LH116 RC. Варта таксама адзначыць, што пасля выдалення антэны LH1 на аснове дэтэргента, RC апаліпапратэіну ў PDB былі вырашаны, што ліквідавала ўнутраныя пулы хінону і ліпіды ў прамежку паміж RC і ўнутранай паверхняй навакольнага кольца LH1 (31, 32). RC застаецца функцыянальным, бо захоўвае ўсе кафактары, за выключэннем раскладальнага QB-хінону, які менш стабільны і часта губляецца падчас працэсу падрыхтоўкі (33). Акрамя таго, вядома, што выдаленне LH1 і натуральных цыклічных ліпідаў з RC можа паўплываць на функцыі, такія як скарачэнне тэрміну службы P+QB-стану з падзеленымі зарадамі (31, 34, 35). Такім чынам, мы мяркуем, што існаванне лакальнага кольца LH1, якое атачае RC, можа падтрымліваць «закрыты» сайт QB, тым самым захоўваючы лакальнае асяроддзе паблізу QB.
Нягледзячы на ​​тое, што апаліпапратэін (без хінону QB) і поўная структура ўяўляюць сабой толькі два здымкі абароту сайта QB, а не серыю падзей, ёсць прыкметы таго, што звязванне можа быць абмежавана, каб прадухіліць паўторнае звязванне гідрахінонам для інгібіравання інгібіравання субстрата. Узаемадзеянне хінолалу і хінону паблізу сайта QB апаліпапратэіна можа адрознівацца, што прыводзіць да яго адрыньвання RC. Даўно выказвалася меркаванне, што канфармацыйныя змены гуляюць ролю ў звязванні і аднаўленні хінонаў. Здольнасць замарожаных RC аднаўляць хіноны пасля адаптацыі да цемры парушаецца (36); рэнтгенаструктурны аналіз паказвае, што гэта пашкоджанне звязана з тым, што хіноны QB знаходзяцца ў «дыстальнай» канфармацыі прыкладна ў 4,5 Å ад актыўнага праксімальнага становішча (26, 37). Мы мяркуем, што гэтая дыстальная канфармацыя звязвання з'яўляецца здымкам прамежкавага стану паміж апаліпапратэінам і поўнай кальцавой структурай, які адбываецца пасля пачатковага ўзаемадзеяння з хінонам і адкрыцця сайта QB.
Рэдукцыйны катэтар II тыпу, які сустракаецца ў комплексе PSII некаторых фотатрофных бактэрый і цыянабактэрый, водарасцяў і раслін, мае структурную і функцыянальную захаванасць (38). Структурнае выраўноўванне, паказанае на малюнку 6 (D і E), падкрэслівае падабенства паміж рэдукцыйнымі катэтарамі PSII і сайтам QB бактэрыяльнага комплексу RC. Гэта параўнанне доўгі час з'яўлялася мадэллю для вывучэння цесна звязаных сістэм звязвання і аднаўлення хінонаў. Папярэднія публікацыі выказвалі здагадку, што канфармацыйныя змены суправаджаюцца аднаўленнем хінонаў PSII (39, 40). Такім чынам, улічваючы эвалюцыйную захаванасць RC, гэты раней не назіраны механізм звязвання можа быць таксама прыдатным да сайта QB RC PSII у кіслародам насычаных фотатрофамі раслін.
Штамы Rps ΔpufW (немаркіраваная дэлецыя pufW) і PufW-His (C-канцавы 10x His-маркіраваны бялок-W, экспрэсаваны з натуральнага локуса pufW). palustris CGA009 быў апісаны ў нашай папярэдняй працы (16). Гэтыя штамы і ізагенны бацькоўскі штам дзікага тыпу былі атрыманы з маразільнай камеры шляхам пасеву невялікай колькасці клетак на пласцінку PYE (кожная па 5 г/л) (захоўвалася ў LB пры -80 °C, якая змяшчае 50% (мас./аб.) гліцэрынавага) бялку, дрожджавага экстракта і сукцынатнага) агару [1,5% (мас./аб.)]. Пласцінку інкубавалі на працягу ночы ў цемры пры пакаёвай тэмпературы ў анаэробных умовах, а затым асвятлялі белым святлом (~50 мкмоль/м²/с), які забяспечваўся галагенавымі лямпачкамі OSRAM 116-W (RS Components, Вялікабрытанія), на працягу 3-5 дзён, пакуль не з'явілася адна калонія. Адну калонію выкарыстоўвалі для інакуляцыі 10 мл асяроддзя M22+ (41) з даданнем 0,1% (мас./аб.) казамінакіслот (далей — M22). Культуру вырошчвалі ва ўмовах нізкага ўтрымання кіслароду ў цемры пры тэмпературы 34°C з перамешваннем са хуткасцю 180 аб/мін на працягу 48 гадзін, а затым 70 мл культуры перамешвалі пры тых жа ўмовах на працягу 24 гадзін. Паўаэробную культуру аб'ёмам 1 мл выкарыстоўвалі для інакуляцыі 30 мл асяроддзя M22 у 30-мл універсальнай празрыстай шкляной бутэльцы з закручвальнай вечкам і апраменьвалі пры перамешванні (~50 мкмольм-2 с-1) на працягу 48 гадзін з дапамогай стэрыльнай магнітнай палачкі для перамешвання. Затым 30 мл культуры перамешвалі прыблізна 1 літрам культуры пры тых жа ўмовах, якая затым выкарыстоўвалася для інакуляцыі прыблізна 9 літраў культуры, асветленай пры ~200 мкмольм-2 с-1 на працягу 72 гадзін. Клеткі збіралі цэнтрыфугаваннем пры 7132 RCF на працягу 30 хвілін, рэсуспендавалі ў ~10 мл 20 мМ трыс-HCl (pH 8,0) і захоўвалі пры тэмпературы -20°C да неабходнасці.
Пасля размарозкі да рэсуспендаваных клетак дадайце некалькі крышталяў дэзоксірыбануклеазы I (Merck, Вялікабрытанія), лізацыму (Merck, Вялікабрытанія) і дзве таблеткі інгібітара пратэазы галаэнзіму Roche (Merck, Вялікабрытанія). У французскай ячэйцы пад ціскам 20 000 фунтаў на квадратны дюйм (Aminco, ЗША) клеткі разбуралі ад 8 да 12 разоў. Пасля выдалення непашкоджаных клетак і нерастваральных рэшткаў шляхам цэнтрыфугавання пры 18 500 RCF на працягу 15 хвілін пры 4°C мембрану абарочвалі з пігментаванага лізату шляхам цэнтрыфугавання пры 113 000 RCF на працягу 2 гадзін пры 43 000°C. Адкіньце растваральную фракцыю і рэсуспендуйце афарбаваную мембрану ў 100-200 мл 20 мМ трыс-HCl (pH 8,0) і гамагенізуйце да знікнення бачных агрэгатаў. Суспендаваную мембрану інкубавалі ў 20 мМ трыс-HCl (pH 8,0) (Anatrace, ЗША), які змяшчае 2% (мас./аб.) β-DDM, на працягу 1 гадзіны ў цемры пры 4°C пры лёгкім памешванні. Затым цэнтрыфугавалі пры 70°C для растварэння 150 000 RCF пры 4°C на працягу 1 гадзіны і выдалення рэшткаў нерастваральных рэчываў.
Растваральную мембрану штама ΔpufW нанеслі на 50 мл калонку з іонаабменнай сефарозай DEAE з трыма аб'ёмамі калонкі (CV) буфера для звязвання [20 мМ трыс-HCl (pH 8,0), які змяшчае 0,03% (мас./аб.) β-DDM]. Прамылі калонку двума буферамі для звязвання CV, а затым двума буферамі для звязвання, якія змяшчаюць 50 мМ NaCl. Комплекс RC-LH116 элюіравалі лінейным градыентам ад 150 да 300 мМ NaCl (у буферы для звязвання) пры 1,75 CV, а астатні комплекс для звязвання элюіравалі буферам для звязвання, які змяшчае 300 мМ NaCl, пры 0,5 CV. Знялі спектр паглынання ў дыяпазоне ад 250 да 1000 нм, падтрымлівалі фракцыю з каэфіцыентам паглынання (A880/A280) большым за 1 пры 880-280 нм, двойчы развялі ў буферы для звязвання і зноў выкарыстоўвалі тую ж працэдуру на калонцы DEAE пры ачыстцы. Разводзяць фракцыі з суадносінамі A880/A280 вышэй за 1,7 і A880/A805 вышэй за 3,0, праводзяць трэці раўнд іённага абмену і захоўваюць фракцыі з суадносінамі A880/A280 вышэй за 2,2 і A880/A805 вышэй за 5,0. Часткова ачышчаны комплекс канцэнтруюць да ~2 мл у цэнтрабежным фільтры Amicon 100 000 з малекулярнай масай адсячэння (MWCO) (Merck, Вялікабрытанія) і наносяць на калонку для выключэння па памеры Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, ЗША), якая змяшчае 200 мМ буфер NaCl, а затым элюююць у тым жа буферы пры 1,5 CV. Збярыце спектры паглынання фракцыі выключэння памеру і канцэнтруйце спектры паглынання з суадносінамі A880/A280 больш за 2,4 і A880/A805 больш за 5,8 да 100 A880, і неадкладна выкарыстоўвайце іх для падрыхтоўкі або захоўвання сеткі крыя-ПЭМ. Захоўвайце пры тэмпературы -80°C да неабходнасці.
Растваральную мембрану са штама PufW-His нанеслі на 20 мл калонку HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 мМ tris-HCl (pH 8,0), якая змяшчае 200 мМ NaCl і 0,03% (мас./мас.)) у буферы IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Калонку прамылі пяццю CV буфера IMAC, а затым пяццю CV буфера IMAC, які змяшчае 10 мМ гістыдыну. Асноўны комплекс элюіравалі з калонкі пяццю буферамі IMAC, якія змяшчаюць 100 мМ гістыдыну. Фракцыю, якая змяшчае комплекс RC-LH114-W, канцэнтравалі да ~10 мл у рэзервуары з мешалкай, абсталяваным фільтрам Amicon 100 000 MWCO (Merck, Вялікабрытанія), разводзілі ў 20 разоў буферам для звязвання, а затым дадавалі да 25 мл. У калонцы DEAE Sepharose загадзя выкарыстоўвалі чатыры CV, звязаныя з буферам. Прамыйце калонку чатырма буферамі для звязвання CV, затым элююйце комплекс на васьмі CV з лінейным градыентам ад 0 да 100 мМ NaCl (у буферы для звязвання), а астатнія чатыры CV, якія змяшчаюць 100 мМ буфер для звязвання. Рэшткавыя комплексы, элюяваныя на хларыдзе натрыю ў спалучэнні з фракцыямі з суадносінамі A880/A280 вышэй за 2,4 і A880/A805 вышэй за 4,6, канцэнтруйце да ~2 мл у цэнтрабежным фільтры Amicon 100 000 MWCO і запоўніце 1,5 CV IMAC загадзя ўраўнаважанай буферам калонцы Superdex 200 16/600 для выключэння памеру, а затым элююйце ў тым жа буферы праз 1,5 CV. Збіраюць спектры паглынання фракцый з выключэннем памеру і канцэнтруюць спектры паглынання з суадносінамі A880/A280 больш за 2,1 і A880/A805 больш за 4,6 да 100 A880, якія адразу ж выкарыстоўваюць для падрыхтоўкі замарожанай сеткі TEM або захоўваюць пры тэмпературы -80°C да неабходнасці.
Для падрыхтоўкі нізкатэмпературных ПЭМ-сетак выкарыстоўваўся иммерсионный маразільнік Leica EM GP. Комплекс разводзілі ў буферы IMAC да A880 50, а затым 5 мкл наносілі на толькі што разраджаную тлеючым разрадам медную сетку QUANTIFOIL 1.2/1.3 з вугляродным пакрыццём (Agar Scientific, Вялікабрытанія). Інкубавалі сетку пры тэмпературы 20°C і адноснай вільготнасці 60% на працягу 30 секунд, затым высушылі яе на працягу 3 секунд, а затым загартоўвалі ў вадкім этане пры тэмпературы -176°C.
Дадзеныя комплексу RC-LH114-W былі запісаны на eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) з дапамогай мікраскопа Titan Krios, які працуе пры паскаральным напружанні 300 кВ, з намінальным павелічэннем 130 000× і энергіяй 20 эВ. Выберыце зазор 20 эВ для запісу малюнкаў у рэжыме падліку. Памер калібраванага пікселя складае 1,048 Å, а магутнасць дозы — 3,83 е-Å-2с-1. Фільм быў сабраны за 11 секунд і падзелены на 40 частак. Для перафакусоўкі мікраскопа выкарыстоўвалася пакрытая вугляродам вобласць, а затым тры фільмы на адтуліну. Усяго было сабрана 3130 фільмаў са значэннямі расфакусоўкі ад -1 да -3 мкм.
Дадзеныя для комплексу RC-LH116 былі сабраны з дапамогай таго ж мікраскопа ў Лабараторыі біяструктур Астэрберы (Універсітэт Лідса, Вялікабрытанія). Дадзеныя былі сабраны ў рэжыме падліку з павелічэннем 130 k, а памер пікселя быў адкалібраваны да 1,065 Å з дозай 4,6 e-Å-2s-1. Фільм быў запісаны за 12 секунд і падзелены на 48 частак. Усяго было сабрана 3359 фільмаў са значэннямі расфакусоўкі ад -1 да -3 мкм.
Уся апрацоўка дадзеных выконваецца ў канвееры Relion 3.0 (42). Выкарыстоўвайце Motioncorr 2 (43) для карэкцыі руху прамяня з дапамогай дозавага ўзважвання, а затым выкарыстоўвайце CTFFIND 4.1 (44) для вызначэння параметра CTF (функцыя перадачы кантрасту). Тыповыя мікрафотаздымкі пасля гэтых пачатковых этапаў апрацоўкі паказаны на малюнку 2. S16. Шаблон аўтаматычнага выбару генеруецца шляхам ручнога выбару каля 250 пікселяў з 1000 часціц у 250-піксельным кадры і адсутнасці эталоннай двухмернай (2D) класіфікацыі, тым самым адхіляючы тыя класіфікацыі, якія адпавядаюць забруджванню ўзору або не маюць прыкметных характарыстык. Затым быў выкананы аўтаматычны выбар на ўсіх мікрафотаздымках, і RC-LH114-W склаў 849 359 часціц, а комплекс RC-LH116 — 476 547 часціц. Усе выбраныя часціцы прайшлі два раўнды неэталоннай 2D-класіфікацыі, і пасля кожнага цыклу часціцы, якія адпавядаюць вугляроднай вобласці, забруджванню ўзору, адсутнасці відавочных асаблівасцей або моцна перакрываюцца часціцы, адхіляюцца, у выніку чаго 772 033 (90,9%) і 359 678 (75,5%) часціцы выкарыстоўваюцца для 3D-класіфікацыі RC-LH114-W і RC-LH116 адпаведна. Пачатковая 3D-эталонная мадэль была створана з выкарыстаннем метаду стахастычнага градыентнага спуску. Выкарыстоўваючы пачатковую мадэль у якасці эталона, выбраныя часціцы класіфікуюцца па чатырох катэгорыях у 3D. Выкарыстоўваючы мадэль у гэтай катэгорыі ў якасці эталона, выканайце 3D-удакладненне часціц у найбольшай катэгорыі, затым выкарыстоўвайце пачатковы нізкачастотны фільтр 15 Å, каб пакрыць вобласць растваральніка, дадайце 6 пікселяў мяккіх краёў і пасляапрацуйце пікселі, каб выправіць перадаткавую функцыю мадуляцыі піка Гатана K2 верхняга дэтэктара. Для набору дадзеных RC-LH114-W гэтая пачатковая мадэль была зменена шляхам выдалення моцнай шчыльнасці на краях маскі (адлучанай ад шчыльнасці асноўнага комплексу ў UCSF Chimera). Атрыманыя мадэлі (разрозненні RC-LH114-W і RC-LH116 складаюць 3,91 і 4,16 Å адпаведна) выкарыстоўваюцца ў якасці арыенціру для другога раўнда 3D-класіфікацыі. Выкарыстаныя часціцы згрупаваны ў пачатковы 3D-клас і не ўтрымліваюць моцнай карэляцыі з наваколлем. Перакрыццё або адсутнасць відавочных структурных асаблівасцей. Пасля другога раўнда 3D-класіфікацыі была выбрана катэгорыя з найвышэйшым разрозненнем [Для RC-LH114-W адна катэгорыя складае 377 703 часціцы (44,5%), для RC-LH116 ёсць дзве катэгорыі, агульнай колькасцю 260 752 часціцы (54,7%), дзе яны аднолькавыя толькі пры выраўноўванні пасля пачатковага павароту з невялікай розніцай]. Абраныя часціцы паўторна экстрагуюцца ў 400-піксельнай скрынцы і ўдасканальваюцца з дапамогай 3D-удасканалення. Маска растваральніка генеруецца з выкарыстаннем пачатковага нізкачастотнага фільтра 15 Å, пашырэння карты на 3 пікселі і мяккай маскі на 3 пікселі. Выкарыстоўваючы ўдасканаленне CTF для кожнай часціцы, карэкцыю руху для кожнай часціцы і другі раўнд удасканалення CTF для кожнай часціцы, пасля кожнага кроку выконваецца 3D-удасканаленне, маскіроўка растваральнікам і пасляапрацоўка для далейшага ўдасканалення атрыманай тэкстуры. Выкарыстоўваючы парогавае значэнне FSC (каэфіцыент карэляцыі абалонкі Фур'е) 0,143, раздзяляльнасць канчатковых мадэляў RC-LH114-W і RC-LH116 складае 2,65 і 2,80 Å адпаведна. Крывая FSC канчатковай мадэлі паказана на малюнку 2. S17.
Усе бялковыя паслядоўнасці спампаваныя з UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Для пабудовы гамалагічнай мадэлі RC, якая змяшчае бялковыя паслядоўнасці RC-L, RC-M і RC-H, а крышталічная структура Rba. sphaeroides RC выкарыстоўвалася ў якасці шаблону (PDB ID: 5LSE) (46). Выкарыстайце інструмент «падбор карты» ў UCSF Chimera, каб падганяць згенераваную мадэль да карты (47), палепшыць структуру бялку і дадаць кафактар ​​[4×BChl a (назва рэшткаў бібліятэкі манамераў = BCL), 2×BPh a (BPH), адзін ці два віды UQ10 (U10), адно негемавае жалеза (Fe) і адзін 3,4-дыгідрагексакарбанілхалін (QAK)] з дапамогай Coot (48). Паколькі QAK недаступны ў бібліятэцы манамераў, ён быў параметраваны з дапамогай інструмента eLBOW у PHENIX (49).
Далей была пабудавана субадзінка LH1. Спачатку для аўтаматычнай пабудовы часткі паслядоўнасці LH1 з выкарыстаннем карты і паслядоўнасцей бялкоў LH1-α і LH1-β у якасці ўваходных дадзеных выкарыстоўваўся інструмент аўтаматычнай пабудовы ў PHENIX (49). Выберыце найбольш поўную субадзінку LH1, выміце яе і загрузіце ў Coot, уручную дадайце ў яе адсутную паслядоўнасць і ўручную ўдакладніце ўсю структуру перад даданнем двух BCl a (BCL) і спірылаксанціну (CRT) [у адпаведнасці з адпаведным Rps. Шчыльнасць комплексу LH1 і вядомым утрыманнем каратыноідаў. Віды (17)]. Скапіруйце поўную субадзінку LH1 і выкарыстоўвайце інструмент стыкоўкі карты UCSF Chimera для стыкоўкі ў суседняй немадэльнай вобласці шчыльнасці LH1, а затым удакладніце яе ў Coot; паўтарайце працэс, пакуль не будуць змадэляваны ўсе субадзінкі LH1. Для структуры RC-LH114-W, шляхам вылучэння неразмеркаванай шчыльнасці ў Coot, бялок сегментуецца ад астатніх небялковых кампанентаў на карце USCF Chimera, і інструмент Autobuild выкарыстоўваецца для стварэння пачатковай мадэлі і мадэлявання астатніх субадзінак (бялок-W). У PHENIX (49). Дадайце любыя адсутныя паслядоўнасці да атрыманай мадэлі ў Coot (48), а затым уручную ўдакладніце ўсю субадзінку. Астатняя неразмеркаваная шчыльнасць адпавядае камбінацыі ліпідаў (ідэнтыфікатар бібліятэкі манамераў PDB CDL = CDL, POPC = 6PL і POPG = PGT), дэтэргента β-DDM (LMT) і малекул UQ10 (U10). Выкарыстоўвайце аптымізацыю PHENIX (49) і ручную аптымізацыю ў Coot (48), каб удасканаліць поўную пачатковую мадэль, пакуль статыстыка мадэлі і візуальная якасць падганяння не змогуць быць далей палепшаны. Нарэшце, выкарыстоўвайце LocScale (50), каб зрабіць лакальную карту больш выразнай, а затым выканайце некалькі іншых цыклаў мадэлявання неразмеркаванай шчыльнасці і аўтаматычную і ручную аптымізацыю.
Адпаведныя пептыды, кофактары і іншыя ліпіды і хіноны, застыкаваныя ў межах іх адпаведных шчыльнасцей, паказаны на малюнках 1 і 2. S18–S23. Статыстычная інфармацыя канчатковай мадэлі паказана ў табліцы S1.
Калі не пазначана іншае, спектры паглынання ў УФ/бачным/бліжнім ІЧ-дыяпазоне былі сабраны на спектрафатометры Cary60 (Agilent, ЗША) з інтэрвалам 1 нм ад 250 нм да 1000 нм і часам інтэгравання 0,1 с.
Развядзіце ўзор у кварцавай кювеце з даўжынёй дыяпазону 2 мм да A880, роўнага 1, і збярыце спектр паглынання ў дыяпазоне ад 400 да 1000 нм. Кругавыя дыхраічныя спектры былі сабраны на спектрапалярыметры Jasco 810 (Jasco, Японія) з інтэрвалам 1 нм у дыяпазоне ад 400 нм да 950 нм пры хуткасці сканавання 20 нм/мін.
Малярны каэфіцыент экстынкцыі вызначаецца шляхам развядзення асноўнага комплексу да A880 прыблізна 50. Развядзіце аб'ём 10 мкл у 990 мкл буфера для звязвання або метанолу і неадкладна збярыце спектр паглынання, каб мінімізаваць дэградацыю BChl. Змест BChl у кожным узоры метанолу разлічвалі па каэфіцыенце экстынкцыі пры 771 нм, які складае 54,8 мМ-1 см-1, і вызначалі каэфіцыент экстынкцыі (51). Падзяліце вымераную канцэнтрацыю BChl на 32 (RC-LH114-W) або 36 (RC-LH116), каб вызначыць канцэнтрацыю асноўнага комплексу, якая затым выкарыстоўваецца для вызначэння спектру паглынання таго ж узору, сабранага ў буферы. Каэфіцыент экстынкцыі. Для кожнага ўзору праводзілі тры паўторныя вымярэнні, і для разліку выкарыстоўвалі сярэднюю паглынанне максімуму BChl Qy. Каэфіцыент экстанцыі RC-LH114-W, вымераны пры 878 нм, складае 3280±140 мМ-1 см-1, у той час як каэфіцыент экстанцыі RC-LH116, вымераны пры 880 нм, складае 3800±30 мМ-1 см-1.
UQ10 быў колькасна вызначаны ў адпаведнасці з метадам (52). Карацей кажучы, ВЭЖХ з адваротнай фазай (RP-HPLC) была праведзена з выкарыстаннем сістэмы ВЭЖХ Agilent 1200. Растварыце каля 0,02 нмоль RC-LH116 або RC-LH114-W у 50 мкл метанолу:хлараформу 50:50, які змяшчае 0,02% (мас./аб.) хларыду жалеза, і ўвядзіце папярэдне ўраўнаважаны Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 мм. Растварыце ў 1 мл-1 мін-1 пры 40°C у растваральніку для ВЭЖХ (80:20 метанол:2-прапанол) на калонцы ×25 см. Правядзіце ізакратычную элюцыю ў растваральніку для ВЭЖХ, каб кантраляваць паглынанне пры 275 нм (UQ10), 450 нм (каратыноіды) і 780 нм (BChl) на працягу 1 гадзіны. Пік на храматаграме пры 275 нм на 25,5 хвілінах быў інтэграваны, і ён не ўтрымліваў ніякіх іншых выяўляльных злучэнняў. Інтэграваная плошча выкарыстоўваецца для разліку малярнай колькасці экстрагаванага UQ10 з выкарыстаннем калібравальнай крывой, разлічанай па ўвядзенні чыстых стандартаў ад 0 да 5,8 нмоль (малюнак S14). Кожны ўзор быў прааналізаваны ў трох паўторах, і паведамленая памылка адпавядае стандартнаму адхіленню сярэдняга значэння.
Раствор, які змяшчае комплекс RC-LH1 з максімальным паглынаннем Qy 0,1, быў падрыхтаваны з 30 мкМ адноўленага цытахрому с2 з сэрца коні (Merck, Вялікабрытанія) і ад 0 да 50 мкМ MUQ2 (Merck, Вялікабрытанія). Тры ўзоры па 1 мл былі падрыхтаваны пры кожнай канцэнтрацыі UQ2 і інкубаваны на працягу ночы ў цемры пры 4°C для забеспячэння поўнай адаптацыі да цемры перад вымярэннем. Раствор быў загружаны ў модульны спектрафатометр OLIS RSM1000, абсталяваны кратамі з полымем 300 нм/лінейкай 500, уваходнымі шчылінамі 1,24 мм, сярэдняй шчылінамі 0,12 мм і выходнымі шчылінамі 0,6 мм. На ўваходзе фотаэлемента ўзору і эталоннага фотапамнажальніка размяшчаецца фільтр даўжынёй 600 нм для выключэння ўзбуджальнага святла. Паглынанне кантралявалася пры 550 нм з часам інтэграцыі 0,15 с. Узбуджальнае святло выпраменьваецца святлодыёдам M880F2 (Thorlabs Ltd., Вялікабрытанія) з даўжынёй хвалі 880 нм (Thorlabs Ltd., Вялікабрытанія) праз валаконна-аптычны кабель з інтэнсіўнасцю 90% праз кантролер DC2200 (Thorlabs Ltd., Вялікабрытанія) і паступае да крыніцы святла пад вуглом 90°. Вымяральны прамень накіраваны супраць люстэрка, каб вярнуць любое святло, якое першапачаткова не было паглынута ўзорам. Кантралюйце паглынанне за 10 секунд да асвятлення на 50 секунд. Затым паглынанне дадаткова кантралюецца на працягу 60 секунд у цемры, каб ацаніць ступень, у якой хінолол спантанна аднаўляе цытахром с23+ (гл. малюнак S8 для неапрацаваных дадзеных).
Дадзеныя былі апрацаваны шляхам апраксімацыі лінейнай пачатковай хуткасці ў межах ад 0,5 да 10 с (у залежнасці ад канцэнтрацыі UQ2) і сярэдняга значэння хуткасцей усіх трох узораў пры кожнай канцэнтрацыі UQ2. Канцэнтрацыя RC-LH1, разлічаная па адпаведным каэфіцыенце паглынання, была выкарыстана для пераўтварэння хуткасці ў каталітычную эфектыўнасць, пабудаваную ў Origin Pro 2019 (OriginLab, ЗША), і апраксімаваная з мадэллю Міхаэліса-Ментэн для вызначэння бачных значэнняў Km і Kcat.
Для вымярэнняў пераходнага паглынання ўзор RC-LH1 быў разведзены да ~2 мкМ у буферы IMAC, які змяшчае 50 мМ аскарбату натрыю (Merck, ЗША) і 0,4 мМ тэрбуціну (Merck, ЗША). Аскарбінавая кіслата выкарыстоўваецца ў якасці ахвярнага донара электронаў, а тэрт-бутаклафен - у якасці інгібітара QB, каб гарантаваць, што асноўны донар RC застанецца адноўленым (г.зн. не фотаакісленым) на працягу ўсяго працэсу вымярэння. Прыблізна 3 мл узору дадаецца ў спецыяльную круцільную ячэйку (дыяметрам каля 0,1 м, 350 аб/мін) з даўжынёй аптычнага шляху 2 мм, каб гарантаваць, што ўзор на лазерным шляху мае дастаткова часу для адаптацыі да цемры паміж імпульсамі ўзбуджэння. Выкарыстоўвайце лазерныя імпульсы ~100 фс для ўзмацнення лазернай сістэмы Ti: Sapphire (Spectra Physics, ЗША) для ўзбуджэння ўзору пры 880 нм з частатой паўтарэння 1 кГц (20 нДж для бліжняга інфрачырвонага дыяпазону або 100 нДж для бачнага). Перад зборам дадзеных падвяргайце ўзор уздзеянню ўзбуджальнага святла каля 30 хвілін. Уздзеянне прывядзе да інактывацыі квазірэгулятара (магчыма, зніжэння квазірэгулятара адзін ці два разы). Але майце на ўвазе, што гэты працэс зварачальны, таму што пасля працяглага перыяду адаптацыі да цемры RC павольна вернецца да квазірэгулятарнай актыўнасці. Для вымярэння спектраў пераходных працэсаў з часам затрымкі ад -10 да 7000 пс выкарыстоўваўся спектрометр Helios (Ultrafast Systems, ЗША). Выкарыстоўвайце праграмнае забеспячэнне Surface Xplorer (Ultrafast Systems, ЗША), каб разгрупаваць наборы дадзеных, а затым аб'яднаць іх і стандартызаваць. Выкарыстоўвайце праграмны пакет CarpetView (Light Conversion Ltd., Літва), каб атрымаць дыферэнцыяльныя спектры, звязаныя з распадам, з дапамогай аб'яднанага набору дадзеных або выкарыстоўвайце функцыю, якая згортвае некалькі экспанент з адказам прыбора, каб адпавядаць спектральнай эвалюцыі для адной даўжыні хвалі ў Origin (OriginLab, ЗША).
Як ужо згадвалася вышэй (53), была падрыхтавана фотасінтэтычная плёнка, якая змяшчае комплекс LH1, у якім адсутнічаюць як RC, так і перыферычная антэна LH2. Мембрана была разведзена ў 20 мМ трыс-растварэнні (pH 8,0), а затым загружана ў кварцавую кювету з аптычным шляхам 2 мм. Для ўзбуджэння ўзору выкарыстоўваўся лазерны імпульс магутнасцю 30 нДж пры даўжыні хвалі 540 нм з часам затрымкі ад -10 да 7000 пс. Апрацоўка набору дадзеных апісана для ўзору Rps.pal.
Мембрану асадзілі шляхам цэнтрыфугавання пры 150 000 RCF на працягу 2 гадзін пры 4°C, а затым яе паглынанне пры 880 нм рэсуспендавалі ў 20 мМ трыс-HCl (pH 8,0) і 200 мМ NaCl. Растварылі мембрану, павольна памешваючы, у 2% (w/v) β-DDM на працягу 1 гадзіны ў цемры пры 4°C. Узор развялі ў 100 мМ карбанату трыэтыламонію (pH 8,0) (TEAB; Merck, Вялікабрытанія) да канцэнтрацыі бялку 2,5 мг/мл (аналіз Bio-Rad). Далейшая апрацоўка праводзілася па раней апублікаваным метадзе (54), пачынаючы з развядзення 50 мкг бялку ў 50 мкл TEAB, які змяшчае 1% (w/v) лаўрату натрыю (Merck, Вялікабрытанія). Пасля апрацоўкі ультрагукам на працягу 60 секунд яго аднаўлялі з дапамогай 5 мМ трыс(2-карбаксіэтыл)фасфіну (Merck, Вялікабрытанія) пры тэмпературы 37°C на працягу 30 хвілін. Для S-алкіліравання ўзор інкубавалі з 10 мМ метыл-S-метылтыяметансульфанату (Merck, Вялікабрытанія) і дадавалі яго з 200 мМ маткавага раствора ізапрапанолу на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Пратэалітычнае пераварванне праводзілі шляхам дадання 2 мкг сумесі трыпсін/эндапратэіназы Lys-C (Promega, Вялікабрытанія) і інкубавалі пры 37°C на працягу 3 гадзін. Лаўратнае павярхоўна-актыўнае рэчыва экстрагавалі шляхам дадання 50 мкл этылацэтату і 10 мкл 10% (аб./аб.) трыфторацэтатнай кіслаты (TFA; Thermo Fisher Scientific, Вялікабрытанія) і перамешвання на віхравой платформе на працягу 60 секунд. Падзел фаз палягчалі цэнтрыфугаваннем пры 15 700 RCF на працягу 5 хвілін. Згодна з пратаколам вытворцы, для стараннага адсмоктвання і абяссальвання ніжняй фазы, якая змяшчае пептыд, выкарыстоўвалася спін-калонка C18 (Thermo Fisher Scientific, Вялікабрытанія). Пасля высушвання вакуумным цэнтрыфугаваннем узор растваралі ў 0,5% TFA і 3% ацэтанітрыле, і 500 нг аналізавалі з дапамогай нанапаточнай RP-храматаграфіі ў спалучэнні з мас-спектрометрыяй з выкарыстаннем сістэмных параметраў, падрабязна апісаных раней.
Выкарыстоўвайце MaxQuant версіі 1.5.3.30 (56) для ідэнтыфікацыі і колькаснага вызначэння бялкоў, каб знайсці базу дадзеных пратэома Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Дадзеныя пратэомікі мас-спектрометрыі былі размешчаны ў ProteomeXchange Alliance праз партнёрскі рэпазітар PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) пад ідэнтыфікатарам набору дадзеных PXD020402.
Для аналізу з дапамогай ВПХ у спалучэнні з мас-спектрометрыяй з іанізацыяй з электрараспыленнем комплекс RC-LH1 быў падрыхтаваны з Rps дзікага тыпу. Выкарыстоўваючы раней апублікаваны метад (16), канцэнтрацыя бялку, атрыманага ў клетках palustris, склала 2 мг/мл у 20 мМ Hepes (pH 7,8), 100 мМ NaCl і 0,03% (мас./аб.) β- (аналіз Bio-Rad) DDM. Згодна з пратаколам вытворцы, выкарыстоўвайце набор для 2D-ачысткі (GE Healthcare, ЗША) для экстракцыі 10 мкг бялку метадам асаджэння і растварайце асадак у 20 мкл 60% (аб./аб.) мурашынай кіслаты (FA), 20% (аб./аб.) ацэтанітрылу і 20% (аб./аб.) вады. Пяць мікралітраў былі прааналізаваны з дапамогай ВПХ (Dionex RSLC) у спалучэнні з мас-спектрометрыяй (Maxis UHR-TOF, Bruker). Выкарыстоўвайце калонку MabPac 1,2×100 мм (Thermo Fisher Scientific, Вялікабрытанія) для падзелу пры тэмпературы 60°C і хуткасці 100 мкл/мін-1 з градыентам ад 85% (аб./аб.) растваральніка А [0,1% (аб./аб.) FA і 0,02% (аб./аб.) воднага раствора TFA] да 85% (аб./аб.) растваральніка B [0,1% (аб./аб.) FA і 0,02% (аб./аб.) у 90% (аб./аб.) ацэтанітрылу TFA]. Выкарыстоўваючы стандартную крыніцу электрараспыляльнай іанізацыі і параметры па змаўчанні на працягу больш за 60 хвілін, мас-спектрометр атрымлівае ад 100 да 2750 m/z (суадносіны масы да зараду). З дапамогай інструмента FindPept партала біяінфарматычных рэсурсаў ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) адлюструйце мас-спектр на субадзінках комплексу.
Клеткі вырошчвалі на працягу 72 гадзін пры 100 мл NF-нізкага (10 мкМм-2 с-1), сярэдняга (30 мкМм-2 с-1) або высокага (300 мкМм-2 с-1) асвятлення. Асяроддзе M22 (асяроддзе M22, у якім сульфат амонію адсутнічае, а сукцынат натрыю заменены ацэтатам натрыю) у 100-мілілітровай бутэльцы з закручвальнай вечкам (23). У пяці 30-секундных цыклах шкляныя шарыкі памерам 0,1 мікрона дадавалі ў аб'ёмным суадносінах 1:1 для лізісу клетак і астуджалі на лёдзе на працягу 5 хвілін. Нерастваральныя рэчывы, непашкоджаныя клеткі і шкляныя шарыкі выдалялі цэнтрыфугаваннем пры 16 000 RCF на працягу 10 хвілін у настольнай мікрацэнтрыфузе. Мембрану аддзялялі ў ротары Ti 70.1 са 100 000 RCF у 20 мМ трыс-HCl (pH 8,0) з градыентам цукрозы 40/15% (мас./мас.) на працягу 10 гадзін.
Як апісана ў нашай папярэдняй працы, імунадэтэкцыя His-меткі на PufW (16). Карацей кажучы, ачышчаны асноўны комплекс (11,8 нМ) або мембрана, якая змяшчае такую ​​ж канцэнтрацыю RC (вызначаецца шляхам акіслення з адніманне спектру зменшанай рознасці і супастаўленнем нагрузкі на афарбаваным гелі) у буферы для загрузкі 2x SDS (Merck, Вялікабрытанія), разведзеным удвая. Бялкі былі падзелены на паўторным 12% біс-трыс-гелі NuPage (Thermo Fisher Scientific, Вялікабрытанія). Гель быў афарбаваны Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Вялікабрытанія) для загрузкі і візуалізацыі субадзінкі RC-L. Бялок на другім гелі быў перанесены на актываваную метанолам полівінілідэнфтарыдную (PVDF) мембрану (Thermo Fisher Scientific, Вялікабрытанія) для імунаферментнага аналізу. Мембрану PVDF блакавалі ў 50 мМ трыс-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 0,2% (аб./аб.) Tween-20 і 5% (мас./аб.) абястлушчаным сухім малацэ, а затым інкубавалі з першаснымі антыцеламі супраць His (у буферы для развядзення антыцелаў [50 мМ трыс-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl і 0,05% (аб./аб.) Tween-20] у 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ЗША) на працягу 4 гадзін. Пасля трохразовага прамывання па 5 хвілін у буферы для антыцелаў мембрану змяшалі з другаснымі антыцеламі супраць мышэй на аснове пераксідазы хрэна (Sigma-Aldrich, Вялікабрытанія) (разведзенымі ў суадносінах 1:10 000 у буферы для антыцелаў). Інкубавалі для выяўлення (праз 5 хвілін пасля трох прамыванняў у буферы для антыцелаў) з выкарыстаннем хемілюмінесцэнтнага субстрата WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Італія) і Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Вялікабрытанія).
Апрацоўка выявы ў ImageJ (57) ажыццяўляецца шляхам пабудовы размеркавання інтэнсіўнасці кожнага афарбаванага геля або паласы імунаферментнага аналізу, інтэгравання плошчы пад пікам і разліку суадносін інтэнсіўнасці RC-L (афарбаваны гель) і бялку-W (імунаферментны аналіз). Гэтыя суадносіны былі пераўтвораны ў малярныя суадносіны, мяркуючы, што суадносіны RC-L да бялку-W у чыстым узоры RC-LH114-W складаюць 1:1, і адпаведнай нармалізацыі ўсяго набору дадзеных.
Дадатковыя матэрыялы да гэтага артыкула можна знайсці па спасылцы http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Гэты артыкул знаходзіцца ў адкрытым доступе і распаўсюджваецца ў адпаведнасці з умовамі ліцэнзіі Creative Commons Attribution License. Артыкул дазваляе неабмежаванае выкарыстанне, распаўсюджванне і прайграванне на любым носьбіце пры ўмове належнага цытавання арыгінальнай працы.
Заўвага: Мы просім вас падаць свой адрас электроннай пошты толькі для таго, каб чалавек, якога вы рэкамендуеце для старонкі, ведаў, што вы хочаце, каб ён бачыў ліст, і што гэта не спам. Мы не будзем фіксаваць ніякіх адрасоў электроннай пошты.
Гэтае пытанне выкарыстоўваецца для праверкі таго, ці з'яўляецеся вы наведвальнікам, і для прадухілення аўтаматычнай рассылкі спаму.
Дэвід Дж. К. Суэйнсберы, Пак Цянь, Філіп Дж. Джэксан, Кейтлін М. Фэрыс, Дарыюш М. Недзведскі, Элізабэт К. Марцін, Дэвід А. Фармер, Лорна А. Мэлоун, Рэбека Ф. Томпсан, Ніл А. Рэнсан, Дэніэл П. Каніф, Марк Дж. Дзікман, Дзьюі Холтэн, Крысцін Кірмайер, Эндру Хічкок, К. Ніл Хантэр
Высокаразрозная структура комплексу светлавой пасткі 1 у рэакцыйным цэнтры дае новае разуменне дынамікі хінону.
Дэвід Дж. К. Суэйнсберы, Пак Цянь, Філіп Дж. Джэксан, Кейтлін М. Фэрыс, Дарыюш М. Недзведскі, Элізабэт К. Марцін, Дэвід А. Фармер, Лорна А. Мэлоун, Рэбека Ф. Томпсан, Ніл А. Рэнсан, Дэніэл П. Каніф, Марк Дж. Дзікман, Дзьюі Холтэн, Крысцін Кірмайер, Эндру Хічкок, К. Ніл Хантэр
Высокаразрозная структура комплексу светлавой пасткі 1 у рэакцыйным цэнтры дае новае разуменне дынамікі хінону.
©2021 Амерыканская асацыяцыя садзейнічання развіццю навукі. усе правы абаронены. AAAS з'яўляецца партнёрам HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.