Артыкул з'яўляецца часткай даследчай тэмы «Перадавыя тэхналогіі біярэмедыяцыі і працэсы перапрацоўкі сінтэтычных арганічных злучэнняў (СОЗ)». Глядзець усе 14 артыкулаў
Нізкамалекулярныя поліцыклічныя араматычныя вуглевадароды (ПАВ), такія як нафталін і замешчаныя нафталіны (метылнафталін, нафтавая кіслата, 1-нафтыл-N-метылкарбамат і г.д.), шырока выкарыстоўваюцца ў розных галінах прамысловасці і з'яўляюцца генатаксічнымі, мутагеннымі і/або канцэрагеннымі для арганізмаў. Гэтыя сінтэтычныя арганічныя злучэнні (САР) або ксенабіётыкі лічацца прыярытэтнымі забруджвальнікамі і ўяўляюць сур'ёзную пагрозу для глабальнага навакольнага асяроддзя і здароўя насельніцтва. Інтэнсіўнасць дзейнасці чалавека (напрыклад, газіфікацыя вугалю, перапрацоўка нафты, выкіды транспартных сродкаў і сельскагаспадарчае прымяненне) вызначае канцэнтрацыю, лёс і транспарт гэтых усюдыісных і ўстойлівых злучэнняў. Акрамя фізічных і хімічных метадаў апрацоўкі/выдалення, зялёныя і экалагічна чыстыя тэхналогіі, такія як біярэмедыяцыя, якія выкарыстоўваюць мікраарганізмы, здольныя цалкам раскладаць ФАР або ператвараць іх у нетаксічныя пабочныя прадукты, сталі бяспечнай, эканамічна эфектыўнай і перспектыўнай альтэрнатывай. Розныя віды бактэрый, якія адносяцца да тыпаў Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia і Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus і Paenibacillus) і Actinobacteria (Rhodococcus і Arthrobacter) у глебавай мікрабіёце, прадэманстравалі здольнасць раскладаць розныя арганічныя злучэнні. Метабалічныя даследаванні, геноміка і метагеномны аналіз дапамагаюць нам зразумець катабалічную складанасць і разнастайнасць, прысутныя ў гэтых простых формах жыцця, што можа быць далей выкарыстана для эфектыўнай біядэградацыі. Доўгатэрміновае існаванне ПАВ прывяло да з'яўлення новых фенатыпаў дэградацыі праз гарызантальны перанос генаў з выкарыстаннем генетычных элементаў, такіх як плазміды, транспазоны, бактэрыяфагі, геномныя астраўкі і інтэгратыўныя кан'югацыйныя элементы. Сістэмная біялогія і генная інжынерыя пэўных ізалятаў або мадэльных супольнасцей (кансорцыумаў) могуць забяспечыць комплексную, хуткую і эфектыўную біярэмедыяцыю гэтых ПАВ дзякуючы сінергетычным эфектам. У гэтым аглядзе мы засяродзімся на розных метабалічных шляхах і разнастайнасці, генетычным складзе і разнастайнасці, а таксама клетачных рэакцыях/адаптацыях бактэрый, якія дэградуюць нафталін і замешчаныя нафталін. Гэта дасць экалагічную інфармацыю для палявых ужыванняў і аптымізацыі штамаў для эфектыўнай біярэмедыяцыі.
Хуткае развіццё галін прамысловасці (нафтахіміі, сельскай гаспадаркі, фармацэўтыкі, тэкстыльных фарбавальнікаў, касметыкі і г.д.) спрыяла глабальнаму эканамічнаму дабрабыту і павышэнню ўзроўню жыцця. Гэта экспанентнае развіццё прывяло да вытворчасці вялікай колькасці сінтэтычных арганічных злучэнняў (САР), якія выкарыстоўваюцца для вытворчасці розных прадуктаў. Да гэтых чужародных злучэнняў або САР адносяцца поліцыклічныя араматычныя вуглевадароды (ПАВ), пестыцыды, гербіцыды, пластыфікатары, фарбавальнікі, фармацэўтычныя прэпараты, арганафасфаты, антыпірэны, лятучыя арганічныя растваральнікі і г.д. Яны выкідваюцца ў атмасферу, водныя і наземныя экасістэмы, дзе аказваюць шматмернае ўздзеянне, выклікаючы шкодны ўплыў на розныя біяформы праз змяненне фізіка-хімічных уласцівасцей і структуры супольнасцей (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Шматлікія араматычныя забруджвальнікі аказваюць моцнае і разбуральнае ўздзеянне на многія некранутыя экасістэмы/гарачыя кропкі біяразнастайнасці (напрыклад, каралавыя рыфы, арктычныя/антарктычныя ледавіковыя шчыты, высакагорныя азёры, глыбакаводныя адклады і г.д.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Нядаўнія геамікрабіялагічныя даследаванні паказалі, што адклад сінтэтычных арганічных рэчываў (напрыклад, араматычных забруджвальнікаў) і іх вытворных на паверхнях штучных збудаванняў (забудоўванага асяроддзя) (напрыклад, аб'ектаў культурнай спадчыны і помнікаў з граніту, каменя, дрэва і металу) паскарае іх дэградацыю (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Дзейнасць чалавека можа ўзмацніць і пагоршыць біялагічную дэградацыю помнікаў і будынкаў з-за забруджвання паветра і змены клімату (Liu et al. 2020). Гэтыя арганічныя забруджвальнікі рэагуюць з вадзяной парай у атмасферы і асядаюць на канструкцыі, выклікаючы фізічную і хімічную дэградацыю матэрыялу. Біядэградацыя шырока прызнана як непажаданыя змены знешняга выгляду і ўласцівасцей матэрыялаў, выкліканыя жывымі арганізмамі, якія ўплываюць на іх захаванне (Pochon and Jaton, 1967). Далейшае мікробнае дзеянне (метабалізм) гэтых злучэнняў можа знізіць структурную цэласнасць, эфектыўнасць захавання і культурную каштоўнасць (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). З іншага боку, у некаторых выпадках мікробная адаптацыя і рэакцыя на гэтыя структуры аказаліся карыснымі, паколькі яны ўтвараюць біяплёнкі і іншыя ахоўныя скарынкі, якія зніжаюць хуткасць гніення/раскладання (Martino, 2016). Такім чынам, распрацоўка эфектыўных доўгатэрміновых устойлівых стратэгій захавання каменных, металічных і драўляных помнікаў патрабуе глыбокага разумення ключавых працэсаў, якія ўдзельнічаюць у гэтым працэсе. У параўнанні з прыроднымі працэсамі (геалагічныя працэсы, лясныя пажары, вывяржэнні вулканаў, рэакцыі раслін і бактэрый), дзейнасць чалавека прыводзіць да выкіду вялікіх аб'ёмаў поліцыклічных араматычных вуглевадародаў (ПАВ) і іншага арганічнага вугляроду (АРВ) у экасістэмы. Многія ПАВ, якія выкарыстоўваюцца ў сельскай гаспадарцы (інсектыцыды і пестыцыды, такія як ДДТ, атразін, карбарыл, пентахлорфенол і г.д.), прамысловасці (сырая нафта, нафтавыя шламы/адходы, пластмасы, атрыманыя з нафты, ПХБ, пластыфікатары, мыйныя сродкі, дэзінфікуючыя сродкі, фуміганты, араматызатары і кансерванты), сродках асабістай гігіены (сонцаахоўныя крэмы, дэзінфікуючыя сродкі, сродкі ад насякомых і поліцыклічныя мускусы) і боепрыпасах (выбуховыя рэчывы, такія як 2,4,6-ТНТ), з'яўляюцца патэнцыйнымі ксенабіётыкамі, якія могуць паўплываць на здароўе планеты (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Гэты спіс можна пашырыць, уключыўшы злучэнні, атрыманыя з нафты (мазут, змазкі, асфальтены), біяпластыкі з высокай малекулярнай масай і іённыя вадкасці (Amde et al., 2015). У табліцы 1 пералічаны розныя араматычныя забруджвальнікі і іх прымяненне ў розных галінах прамысловасці. У апошнія гады антрапагенныя выкіды лятучых арганічных злучэнняў, а таксама вуглякіслага газу і іншых парніковых газаў пачалі павялічвацца (Dvorak et al., 2017). Аднак антрапагенны ўплыў значна перавышае прыродны. Акрамя таго, мы выявілі, што шэраг арганічных рэчываў (СОК) захоўваецца ў многіх асяроддзях навакольнага асяроддзя і быў вызначаны як новыя забруджвальнікі з негатыўным уздзеяннем на біёмы (Малюнак 1). Экалагічныя агенцтвы, такія як Агенцтва па ахове навакольнага асяроддзя ЗША (USEPA), уключылі многія з гэтых забруджвальнікаў у свой спіс прыярытэтаў з-за іх цытатаксічных, генатаксічных, мутагенных і канцэрагенных уласцівасцей. Такім чынам, неабходныя строгія правілы ўтылізацыі і эфектыўныя стратэгіі апрацоўкі/выдалення адходаў з забруджаных экасістэм. Розныя фізічныя і хімічныя метады апрацоўкі, такія як піроліз, акісляльная тэрмічная апрацоўка, аэрацыя паветра, захороненне, спальванне і г.д., з'яўляюцца неэфектыўнымі і дарагімі і ствараюць каразійныя, таксічныя і цяжкаапрацоўваемыя пабочныя прадукты. З ростам глабальнай экалагічнай свядомасці мікраарганізмы, здольныя раскладаць гэтыя забруджвальнікі і іх вытворныя (напрыклад, галагенаваныя, нітра-, алкільныя і/або метыльныя), прыцягваюць усё большую ўвагу (Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Выкарыстанне гэтых мясцовых мікраарганізмаў-кандыдатаў асобна або ў змешаных культурах (калоніях) для выдалення араматычных забруджвальнікаў мае перавагі з пункту гледжання экалагічнай бяспекі, кошту, эфектыўнасці, дзейснасці і ўстойлівасці. Даследчыкі таксама вывучаюць інтэграцыю мікробных працэсаў з электрахімічнымі акісляльна-аднаўленчымі метадамі, а менавіта біяэлектрахімічнымі сістэмамі (БЭС), як перспектыўную тэхналогію для апрацоўкі/выдалення забруджвальнікаў (Huang et al., 2011). Тэхналогія BES прыцягвае ўсё большую ўвагу дзякуючы сваёй высокай эфектыўнасці, нізкай кошту, экалагічнай бяспецы, працы пры пакаёвай тэмпературы, біясумяшчальным матэрыялам і здольнасці здабываць каштоўныя пабочныя прадукты (напрыклад, электрычнасць, паліва і хімічныя рэчывы) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). З'яўленне высокапрадукцыйнага секвенавання геному і інструментаў/метадаў омікі дало багацце новай інфармацыі аб генетычнай рэгуляцыі, пратэоміцы і флуксоміцы рэакцый розных мікраарганізмаў-дэградатараў. Спалучэнне гэтых інструментаў з сістэмнай біялогіяй яшчэ больш пашырыла наша разуменне выбару і тонкай налады мэтавых катабалічных шляхоў у мікраарганізмаў (г.зн. метабалічнага дызайну) для дасягнення эфектыўнай і дзейснай біядэградацыі. Каб распрацаваць эфектыўныя стратэгіі біярэмедыяцыі з выкарыстаннем прыдатных мікраарганізмаў-кандыдатаў, нам неабходна разумець біяхімічны патэнцыял, метабалічную разнастайнасць, генетычны склад і экалогію (аўтаэкалогія/сінекалогія) мікраарганізмаў.
Мал. 1. Крыніцы і шляхі распаўсюджвання нізкамалекулярных ПАВ праз розныя асяроддзі навакольнага асяроддзя і розныя фактары, якія ўплываюць на біёту. Пункцірныя лініі паказваюць узаемадзеянне паміж элементамі экасістэмы.
У гэтым аглядзе мы паспрабавалі абагульніць дадзеныя аб дэградацыі простых ПАВ, такіх як нафталін і замешчаныя нафталіны, рознымі бактэрыяльнымі ізалятамі, ахопліваючы метабалічныя шляхі і разнастайнасць, ферменты, якія ўдзельнічаюць у дэградацыі, склад/змест і разнастайнасць генаў, клетачныя рэакцыі і розныя аспекты біярэмедыяцыі. Разуменне біяхімічнага і малекулярнага ўзроўняў дапаможа ў вызначэнні прыдатных штамаў гаспадароў і іх далейшай геннай інжынерыі для эфектыўнай біярэмедыяцыі такіх прыярытэтных забруджвальнікаў. Гэта дапаможа ў распрацоўцы стратэгій стварэння спецыфічных для месца бактэрыяльных кансорцыумаў для эфектыўнай біярэмедыяцыі.
Прысутнасць вялікай колькасці таксічных і небяспечных араматычных злучэнняў (якія задавальняюць правіла Хюккеля 4n + 2π электронаў, n = 1, 2, 3, …) уяўляе сур'ёзную пагрозу для розных асяроддзяў, такіх як паветра, глеба, адклады, а таксама паверхневыя і падземныя воды (Puglisi et al., 2007). Гэтыя злучэнні маюць адзінкавыя бензольныя кольцы (манацыклічныя) або некалькі бензольных кольцаў (поліцыклічныя), размешчаныя ў лінейнай, вуглавой або кластарнай форме, і праяўляюць стабільнасць (стабільнасць/няўстойлівасць) у навакольным асяроддзі з-за высокай адмоўнай рэзананснай энергіі і інертнасці (інертнасці), што можна растлумачыць іх гідрафобнасцю і адноўленым станам. Калі араматычнае кольца далей замяшчаецца метыльнымі (-CH3), карбаксільнымі (-COOH), гідраксільнымі (-OH) або сульфанатнымі (-HSO3) групамі, яно становіцца больш стабільным, мае больш моцнае сродства да макрамалекул і з'яўляецца біяакумулятыўным у біялагічных сістэмах (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Некаторыя нізкамалекулярныя поліцыклічныя араматычныя вуглевадароды (НМВАВ), такія як нафталін і яго вытворныя [метылнафталін, нафтавая кіслата, нафталінсульфанат і 1-нафтыл-N-метылкарбамат (карбарыл)], былі ўключаны Агенцтвам па ахове навакольнага асяроддзя ЗША ў спіс прыярытэтных арганічных забруджвальнікаў як генатаксічныя, мутагенныя і/або канцэрагенныя (Cerniglia, 1984). Выкід гэтага класа НМ-ПАВ у навакольнае асяроддзе можа прывесці да біяакумуляцыі гэтых злучэнняў на ўсіх узроўнях харчовага ланцуга, тым самым уплываючы на ​​здароўе экасістэм (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Крыніцы і шляхі траплення ПАВ у біёту ў асноўным ажыццяўляюцца праз міграцыю і ўзаемадзеянне паміж рознымі кампанентамі экасістэм, такімі як глеба, падземныя воды, паверхневыя воды, сельскагаспадарчыя культуры і атмасфера (Arey and Atkinson, 2003). На малюнку 1 паказана ўзаемадзеянне і размеркаванне розных нізкамалекулярных ПАВ у экасістэмах і іх шляхі траплення ў біёту/чалавека. ПАВ адкладаюцца на паверхнях у выніку забруджвання паветра і праз міграцыю (дрэйф) выкідаў транспартных сродкаў, прамысловых выхлапных газаў (газіфікацыя вугалю, спальванне і вытворчасць коксу) і іх адклад. Прамысловая дзейнасць, такая як вытворчасць сінтэтычных тэкстыльных вырабаў, фарбавальнікаў і фарбаў; кансервацыя драўніны; апрацоўка гумы; вытворчасць цэменту; вытворчасць пестыцыдаў; і сельскагаспадарчае прымяненне з'яўляюцца асноўнымі крыніцамі ПАВ у наземных і водных сістэмах (Bamforth and Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Даследаванні паказалі, што глебы ў прыгарадных і гарадскіх раёнах, паблізу аўтамагістралей і ў буйных гарадах больш успрымальныя да поліцыклічных араматычных вуглевадародаў (ПАВ) з-за выкідаў электрастанцый, ацяплення жылых памяшканняў, нагрузкі ад паветранага і дарожнага руху, а таксама будаўнічай дзейнасці (Suman et al., 2016). У працы (2008) было паказана, што ўзровень ПАВ у глебе паблізу дарог у Новым Арлеане, штат Луізіяна, ЗША, дасягаў 7189 мкг/кг, тады як на адкрытай прасторы ён складаў толькі 2404 мкг/кг. Падобным чынам, узровень ПАВ да 300 мкг/кг быў зафіксаваны ў раёнах паблізу месцаў газіфікацыі вугалю ў некалькіх гарадах ЗША (Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005). Паведамлялася, што глебы розных індыйскіх гарадоў, такіх як Дэлі (Sharma et al., 2008), Агра (Dubey et al., 2014), Мумбаі (Kulkarni and Venkataraman, 2000) і Вішакхапатнам (Kulkarni et al., 2014), утрымліваюць высокія канцэнтрацыі ПАВ. Араматычныя злучэнні лягчэй адсарбуюцца на часцінках глебы, арганічных рэчывах і гліністыя мінералы, становячыся такім чынам асноўнымі паглынальнікамі вугляроду ў экасістэмах (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Асноўнымі крыніцамі ПАВ у водных экасістэмах з'яўляюцца ападкі (вільготныя/сухія ападкі і вадзяная пара), гарадскі сцёк, скід сцёкавых вод, папаўненне грунтавых вод і г.д. (Srogi, 2007). Паводле ацэнак, каля 80% ПАВ у марскіх экасістэмах паступае з ападкаў, седыментацыі і скіду сцёкавых вод (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Больш высокія канцэнтрацыі ПАВ у паверхневых водах або фільтраце з месцаў знішчэння цвёрдых адходаў у рэшце рэшт прасочваюцца ў падземныя воды, што стварае сур'ёзную пагрозу для здароўя насельніцтва, паколькі больш за 70% насельніцтва Паўднёвай і Паўднёва-Усходняй Азіі п'е падземныя воды (Duttagupta et al., 2019). Нядаўняе даследаванне Duttagupta et al. (2020) аналізу рэк (32) і падземных вод (235) з Заходняй Бенгаліі, Індыя, паказала, што, паводле ацэнак, 53% гарадскіх жыхароў і 44% сельскіх жыхароў (усяго 20 мільёнаў жыхароў) могуць падвяргацца ўздзеянню нафталіну (4,9–10,6 мкг/л) і яго вытворных. Розныя мадэлі землекарыстання і павелічэнне здабычы падземных вод лічацца асноўнымі фактарамі, якія кантралююць вертыкальны транспарт (адвекцыю) нізкамалекулярных ПАВ у падземных водах. Было ўстаноўлена, што сельскагаспадарчы сцёк, скіды камунальных і прамысловых сцёкавых вод, а таксама скіды цвёрдых адходаў/смеццевых адходаў падвяргаюцца ўздзеянню ПАВ у рачных басейнах і падземных адкладах. Атмасферныя ападкі яшчэ больш пагаршаюць забруджванне ПАВ. Высокія канцэнтрацыі ПАВ і іх алкільных вытворных (усяго 51) былі зарэгістраваны ў рэках/вадаёмах па ўсім свеце, такіх як ракі Фрэйзер, Луан, Дэнса, Місуры, Анакостыя, Эбра і Дэлавэр (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). У адкладах басейна ракі Ганг найбольш значнымі былі нафталін і фенантрэн (выяўлены ў 70% проб) (Duttagupta et al., 2019). Больш за тое, даследаванні паказалі, што хлараванне пітной вады можа прывесці да ўтварэння больш таксічных аксігенаваных і хлараваных ПАВ (Manoli and Samara, 1999). ПАВ назапашваюцца ў збожжавых, садавіне і гародніне ў выніку паглынання раслінамі з забруджаных глеб, грунтавых вод і ападкаў (Fismes et al., 2002). Многія водныя арганізмы, такія як рыба, мідыі, малюскі і крэветкі, забруджваюцца ПАВ праз ужыванне забруджаных прадуктаў харчавання і марской вады, а таксама праз тканіны і скуру (Mackay and Fraser, 2000). Такія метады падрыхтоўкі/апрацоўкі, як грыль, запяканне, вэнджанне, смажанне, сушка, выпечка і прыгатаванне ежы на вуглях, таксама могуць прывесці да значнай колькасці ПАВ у ежы. Гэта ў значнай ступені залежыць ад выбару матэрыялу для вэнджання, утрымання фенольных/араматычных вуглевадародаў, працэдуры падрыхтоўкі, тыпу награвальніка, утрымання вільгаці, падачы кіслароду і тэмпературы гарэння (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Поліцыклічныя араматычныя вуглевадароды (ПАВ) таксама былі выяўлены ў малацэ ў розных канцэнтрацыях (0,75–2,1 мг/л) (Girelli et al., 2014). Назапашванне гэтых ПАВ у ежы таксама залежыць ад фізіка-хімічных уласцівасцей ежы, у той час як іх таксічныя эфекты звязаны з фізіялагічнымі функцыямі, метабалічнай актыўнасцю, паглынаннем, размеркаваннем і размеркаваннем у арганізме (Mechini et al., 2011).
Таксічнасць і шкодны ўплыў поліцыклічных араматычных вуглевадародаў (ПАВ) вядомыя даўно (Cherniglia, 1984). Нізкамалекулярныя поліцыклічныя араматычныя вуглевадароды (НМ-ПАВ) (ад двух да трох кольцаў) могуць кавалентна звязвацца з рознымі макрамалекуламі, такімі як ДНК, РНК і бялкі, і з'яўляюцца канцэрагеннымі (Santarelli et al., 2008). З-за сваёй гідрафобнай прыроды яны падзеленыя ліпіднымі мембранамі. У арганізме чалавека монааксігеназы цытахрому P450 акісляюць ПАВ да эпаксідаў, некаторыя з якіх з'яўляюцца высокарэактыўнымі (напрыклад, эпаксід бейдыёлу) і могуць прывесці да трансфармацыі нармальных клетак у злаякасныя (Marston et al., 2001). Акрамя таго, прадукты трансфармацыі ПАВ, такія як хіноны, фенолы, эпаксіды, дыёлы і г.д., больш таксічныя, чым зыходныя злучэнні. Некаторыя ПАВ і іх метабалічныя прамежкавыя прадукты могуць уплываць на гармоны і розныя ферменты ў метабалізме, тым самым негатыўна ўплываючы на ​​рост, цэнтральную нервовую сістэму, рэпрадуктыўную і імунную сістэмы (Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Паведамлялася, што кароткачасовае ўздзеянне нізкамалекулярных ПАВ выклікае парушэнне функцыі лёгкіх і трамбоз у астматыкаў, а таксама павялічвае рызыку раку скуры, лёгкіх, мачавой бурбалкі і страўнікава-кішачнага гасцінца (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Даследаванні на жывёлах таксама паказалі, што ўздзеянне ПАВ можа мець негатыўныя наступствы для рэпрадуктыўнай функцыі і развіцця і можа выклікаць катаракту, пашкоджанне нырак і печані, а таксама жаўтуху. Было паказана, што розныя прадукты біятрансфармацыі ПАВ, такія як дыёлы, эпоксіды, хіноны і свабодныя радыкалы (катыёны), утвараюць аддукты ДНК. Было паказана, што стабільныя аддукты змяняюць механізм рэплікацыі ДНК, у той час як нестабільныя аддукты могуць дэпурынаваць ДНК (у асноўным да аденіну, а часам да гуаніну); абодва могуць генераваць памылкі, якія прыводзяць да мутацый (Schweigert et al. 2001). Акрамя таго, хіноны (бензо-/пан-) могуць генераваць актыўныя формы кіслароду (АФК), выклікаючы смяротнае пашкоджанне ДНК і іншых макрамалекул, тым самым уплываючы на ​​функцыю/жыццяздольнасць тканін (Ewa and Danuta 2017). Паведамлялася, што хранічнае ўздзеянне нізкіх канцэнтрацый пірэну, біфенілу і нафталіну выклікае рак у эксперыментальных жывёл (Diggs et al. 2012). З-за іх смяротнай таксічнасці ачыстка/выдаленне гэтых ПАВ з пашкоджаных/забруджаных участкаў з'яўляецца прыярытэтнай задачай.
Для выдалення ПАВ з забруджаных участкаў/навакольнага асяроддзя выкарыстоўваліся розныя фізічныя і хімічныя метады. Такія працэсы, як спальванне, дэхлараванне, УФ-акісленне, фіксацыя і экстракцыя растваральнікам, маюць шмат недахопаў, у тым ліку ўтварэнне таксічных пабочных прадуктаў, складанасць працэсу, праблемы бяспекі і рэгулявання, нізкую эфектыўнасць і высокі кошт. Аднак мікробная біядэградацыя (якая называецца біярэмедыяцыяй) — гэта перспектыўны альтэрнатыўны падыход, які прадугледжвае выкарыстанне мікраарганізмаў у выглядзе чыстых культур або калоній. У параўнанні з фізічнымі і хімічнымі метадамі, гэты працэс з'яўляецца экалагічна чыстым, неінвазіўным, эканамічна эфектыўным і ўстойлівым. Біярэмедыяцыя можа праводзіцца на пашкоджаным месцы (in situ) або на спецыяльна падрыхтаваным месцы (ex situ) і таму лічыцца больш устойлівым метадам рэмедыяцыі, чым традыцыйныя фізічныя і хімічныя метады (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Разуменне мікробных метабалічных этапаў, якія ўдзельнічаюць у раскладанні араматычных забруджвальнікаў, мае велізарныя навуковыя і эканамічныя наступствы для экалагічнай і экалагічнай устойлівасці. Паводле ацэнак, 2,1×10^18 грамаў вугляроду (C) захоўваецца ў адкладах і арганічных злучэннях (г.зн. нафце, прыродным газе і вуглі, г.зн. выкапнёвым паліве) па ўсім свеце, што ўносіць значны ўклад у глабальны цыкл вугляроду. Аднак хуткая індустрыялізацыя, здабыча выкапнёвага паліва і дзейнасць чалавека высільваюць гэтыя літасферныя рэзервуары вугляроду, штогод вызваляючы ў атмасферу каля 5,5×10^15 г арганічнага вугляроду (у выглядзе забруджвальнікаў) (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Большая частка гэтага арганічнага вугляроду трапляе ў наземныя і марскія экасістэмы праз седыментацыю, транспарт і сцёк. Акрамя таго, новыя сінтэтычныя забруджвальнікі, атрыманыя з выкапнёвага паліва, такія як пластмасы, пластыфікатары і стабілізатары пластыкаў (фталаты і іх ізамеры), сур'ёзна забруджваюць марскія, глебавыя і водныя экасістэмы і іх біёту, тым самым пагаршаючы глабальныя кліматычныя рызыкі. Розныя віды мікрапластыку, нанапластыку, фрагментаў пластыку і іх таксічных манамерных прадуктаў, атрыманых з поліэтылентэрэфталату (ПЭТ), назапашваліся ў Ціхім акіяне паміж Паўночнай Амерыкай і Паўднёва-Усходняй Азіяй, утвараючы «Вялікую ціхаакіянскую смеццевую пляму», шкодзячы марскому жыццю (Newell et al., 2020). Навуковыя даследаванні даказалі, што немагчыма выдаліць такія забруджвальнікі/адходы ніякімі фізічнымі або хімічнымі метадамі. У гэтым кантэксце найбольш карыснымі мікраарганізмамі з'яўляюцца тыя, якія здольныя акісляльна метабалізаваць забруджвальнікі ў вуглякіслы газ, хімічную энергію і іншыя нетаксічныя пабочныя прадукты, якія ў рэшце рэшт уступаюць у іншыя працэсы кругазвароту пажыўных рэчываў (H, O, N, S, P, Fe і г.д.). Такім чынам, разуменне мікробнай экафізіялогіі мінералізацыі араматычных забруджвальнікаў і яе экалагічнага кантролю мае вырашальнае значэнне для ацэнкі мікробнага вугляроднага цыклу, чыстага вугляроднага бюджэту і будучых кліматычных рызык. Улічваючы вострую неабходнасць выдалення такіх злучэнняў з навакольнага асяроддзя, з'явіліся розныя экалагічныя галіны прамысловасці, арыентаваныя на чыстыя тэхналогіі. Акрамя таго, выкарыстанне прамысловых адходаў/адходаў хімічных рэчываў, назапашаных у экасістэмах (г.зн. падыход «ад адходаў да багацця») лічыцца адным са слупоў цыркулярнай эканомікі і мэтаў устойлівага развіцця (Close et al., 2012). Такім чынам, разуменне метабалічных, ферментатыўных і генетычных аспектаў гэтых патэнцыйных кандыдатаў на дэградацыю мае першараднае значэнне для эфектыўнага выдалення і біярэмедыяцыі такіх араматычных забруджвальнікаў.
Сярод шматлікіх араматычных забруджвальнікаў мы звяртаем асаблівую ўвагу на нізкамалекулярныя ПАВ, такія як нафталін і замешчаныя нафталіны. Гэтыя злучэнні з'яўляюцца асноўнымі кампанентамі паліва, атрыманага з нафты, тэкстыльных фарбавальнікаў, спажывецкіх тавараў, пестыцыдаў (нафталіну і сродкаў ад насякомых), пластыфікатараў і танінаў, і таму шырока распаўсюджаныя ў многіх экасістэмах (Preuss et al., 2003). Нядаўнія даследаванні падкрэсліваюць назапашванне канцэнтрацый нафталіну ў ваданосных адкладах, падземных водах і падземных глебах, зонах вадозы і рэчышчах рэк, што сведчыць аб яго біяакумуляцыі ў навакольным асяроддзі (Duttagupta et al., 2019, 2020). У табліцы 2 падсумаваны фізіка-хімічныя ўласцівасці, прымяненне і ўплыў на здароўе нафталіну і яго вытворных. У параўнанні з іншымі высокамалекулярнымі ПАВ, нафталін і яго вытворныя менш гідрафобныя, больш растваральныя ў вадзе і шырока распаўсюджаныя ў экасістэмах, таму яны часта выкарыстоўваюцца ў якасці мадэльных субстратаў для вывучэння метабалізму, генетыкі і метабалічнай разнастайнасці ПАВ. Вялікая колькасць мікраарганізмаў здольная метабалізаваць нафталін і яго вытворныя, і даступная поўная інфармацыя аб іх метабалічных шляхах, ферментах і рэгуляторных асаблівасцях (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Акрамя таго, нафталін і яго вытворныя вызначаны ў якасці прататыпаў злучэнняў для ацэнкі забруджвання навакольнага асяроддзя з-за іх высокай распаўсюджанасці і біядаступнасці. Агенцтва па ахове навакольнага асяроддзя ЗША ацэньвае, што сярэдні ўзровень нафталіну складае 5,19 мкг на кубічны метр з цыгарэтнага дыму, у асноўным з-за няпоўнага згарання, і ад 7,8 да 46 мкг з пабочнага дыму, у той час як уздзеянне крэазоту і нафталіну ў 100-10 000 разоў вышэй (Preuss et al. 2003). У прыватнасці, было выяўлена, што нафталін валодае відаспецыфічнай, рэгіянальнай і полавай рэспіраторнай таксічнасцю і канцэрагеннасцю. На падставе даследаванняў на жывёлах Міжнароднае агенцтва па даследаванні раку (IARC) класіфікавала нафталін як «магчымы канцероген для чалавека» (група 2B)1. Уздзеянне замешчаных нафталінаў, у асноўным шляхам інгаляцыі або парэнтэральнага (перорального) увядзення, выклікае пашкоджанне лёгачнай тканіны і павялічвае частату пухлін лёгкіх у пацукоў і мышэй (Нацыянальная праграма па таксікалогіі 2). Вострыя наступствы ўключаюць млоснасць, ваніты, боль у жываце, дыярэю, галаўны боль, спутанность свядомасці, багатае потаадлучэнне, ліхаманку, тахікардыю і г.д. З іншага боку, інсектыцыд шырокага спектру дзеяння на аснове карбамата карбарыл (1-нафтыл N-метылкарбамат) аказваецца таксічным для водных беспазваночных, амфібій, меданосных пчол і людзей і, як было паказана, інгібіруе ацэтылхалінестэразу, выклікаючы параліч (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). Такім чынам, разуменне механізмаў мікробнай дэградацыі, генетычнай рэгуляцыі, ферментатыўных і клетачных рэакцый мае вырашальнае значэнне для распрацоўкі стратэгій біярэмедыяцыі ў забруджаным асяроддзі.
Табліца 2. Падрабязная інфармацыя пра фізіка-хімічныя ўласцівасці, выкарыстанне, метады ідэнтыфікацыі і звязаныя з імі захворванні нафталіну і яго вытворных.
У забруджаных нішах гідрафобныя і ліпафільныя араматычныя забруджвальнікі могуць выклікаць розныя клетачныя эфекты на мікрабіём (супольнасць) навакольнага асяроддзя, такія як змены цякучасці мембран, пранікальнасці мембран, ацёк ліпіднага біслоя, парушэнне перадачы энергіі (ланцуг транспарту электронаў/рухаючая сіла пратонаў) і актыўнасць мембранна-асацыяваных бялкоў (Sikkema et al., 1995). Акрамя таго, некаторыя растваральныя прамежкавыя прадукты, такія як катэхолы і хіноны, генеруюць актыўныя формы кіслароду (ROS) і ўтвараюць аддукты з ДНК і бялкамі (Penning et al., 1999). Такім чынам, багацце такіх злучэнняў у экасістэмах аказвае селектыўны ціск на мікробныя супольнасці, каб яны сталі эфектыўнымі дэградатарамі на розных фізіялагічных узроўнях, уключаючы паглынанне/транспарт, унутрыклетачную трансфармацыю, асіміляцыю/ўтылізацыю і компартменталізацыю.
Пошук у базе дадзеных рыбасом Project-II (RDP-II) паказаў, што з асяроддзяў або культур узбагачэння, забруджаных нафталінам або яго вытворнымі, было выдзелена ў агульнай складанасці 926 відаў бактэрый. Найбольшая колькасць прадстаўнікоў была ў групе Proteobacteria (n = 755), за ёй ішлі Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) і некласіфікаваныя бактэрыі (8) (Малюнак 2). Прадстаўнікі γ-Proteobacteria (Pseudomonadales і Xanthomonadales) дамінавалі ва ўсіх грам-адмоўных групах з высокім утрыманнем G+C (54%), у той час як Clostridiales і Bacillales (30%) былі грам-станоўчымі групамі з нізкім утрыманнем G+C. Паведамлялася, што Pseudomonas (найбольшая колькасць, 338 відаў) здольныя раскладаць нафталін і яго метыльныя вытворныя ў розных забруджаных экасістэмах (вугальная смала, нафта, сырая нафта, шлам, разлівы нафты, сцёкавыя воды, арганічныя адходы і звалкі), а таксама ў некранутых экасістэмах (глеба, рэкі, адклады і падземныя воды) (Малюнак 2). Больш за тое, даследаванні па ўзбагачэнні і метагеномны аналіз некаторых з гэтых рэгіёнаў паказалі, што некультываваныя віды Legionella і Clostridium могуць мець здольнасць да раскладання, што сведчыць аб неабходнасці культывавання гэтых бактэрый для вывучэння новых шляхоў і метабалічнай разнастайнасці.
Мал. 2. Таксанамічная разнастайнасць і экалагічнае размеркаванне бактэрыяльных прадстаўнікоў у асяроддзях, забруджаных нафталінам і яго вытворнымі.
Сярод розных мікраарганізмаў, якія раскладаюць араматычныя вуглевадароды, большасць здольныя раскладаць нафталін як адзіную крыніцу вугляроду і энергіі. Паслядоўнасць падзей, звязаных з метабалізмам нафталіну, была апісана для Pseudomonas sp. (штамы: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 і CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 і іншыя штамы (ND6 і AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Метабалізм ініцыюецца шматкампанентнай дыаксігеназай [нафталіндыаксігеназа (NDO), дыаксігеназа, якая гідраксіліруе кольца], якая каталізуе акісленне аднаго з араматычных кольцаў нафталіну з выкарыстаннем малекулярнага кіслароду ў якасці іншага субстрата, ператвараючы нафталін у цыс-нафталіндыёл (Малюнак 3). Цыс-дыгідрадыёл пераўтвараецца ў 1,2-дыгідраксінафаталін дэгідрагеназай. Расшчапляльны кольца фермент... Дыаксігеназа, 1,2-дыгідраксінафталіндыяксігеназа (12DHNDO), пераўтварае 1,2-дыгідраксінафталін у 2-гідраксіхрамен-2-карбонавую кіслату. Ферментатыўная цыс-транс-ізамерызацыя ўтварае транс-о-гідраксібензілідэнпіруват, які расшчапляецца гідратазай-альдалазай да саліцылавага альдэгіду і пірувату. Арганічная кіслата піруват была першым злучэннем C3, атрыманым з вугляроднага шкілета нафталіну і накіраваным у цэнтральны вугляродны шлях. Акрамя таго, NAD+-залежная саліцылальдэгіддэгідрагеназа пераўтварае саліцылальдэгід у саліцылавую кіслату. Метабалізм на гэтай стадыі называецца «верхнім шляхам» дэградацыі нафталіну. Гэты шлях вельмі распаўсюджаны ў большасці бактэрый, якія дэградуюць нафталін. Аднак ёсць некалькі выключэнняў; напрыклад, у тэрмафільнай Bacillus hamburgii 2 дэградацыя нафталіну ініцыюецца нафталін-2,3-дыяксігеназай з утварэннем 2,3-дыгідраксінафталін (Annweiler et al., 2000).
Малюнак 3. Шляхі дэградацыі нафталіну, метылнафталіну, нафтаевай кіслаты і карбарылу. Абведзеныя лічбы абазначаюць ферменты, якія адказваюць за паслядоўнае пераўтварэнне нафталіну і яго вытворных у наступныя прадукты. 1 — нафталіндыаксігеназа (NDO); 2, цыс-дыгідрадыёлдэгідрагеназа; 3, 1,2-дыгідраксінафталіндыаксігеназа; 4, ізамераза 2-гідраксіхрамен-2-карбаксальнай кіслаты; 5, транс-O-гідраксібензілідэнпіруватгідратаза-альдалаза; 6, саліцылальдэгіддэгідрагеназа; 7, саліцылат-1-гідраксілаза; 8, катэхол-2,3-дыаксігеназа (C23DO); 9, 2-гідраксімуканат-семіальдэгіддэгідрагеназа; 10, 2-оксопент-4-енаатгідратаза; 11, 4-гідраксі-2-оксопентанат-альдалаза; 12, ацэтальдэгіддэгідрагеназа; 13, катэхол-1,2-дыаксігеназа (C12DO); 14, муканатцыклаізамераза; 15, муканалактон дэльта-ізамераза; 16, β-кетаадыпатэналактонгідралаза; 17, β-кетаадыпатсукцыніл-КоА-трансфераза; 18, β-кетаадыпат-КоА-тыялаза; 19, сукцыніл-КоА: ацэтыл-КоА-сукцынілтрансфераза; 20, саліцылат-5-гідраксілаза; 21 – гентызат-1,2-дыаксігеназа (GDO); 22, малеілпіруватізамераза; 23, фумарылпіруватгідралаза; 24, метылнафталінгідраксілаза (NDO); 25, гідраксіметылнафталіндэгідрагеназа; 26, нафтальдэгіддэгідрагеназа; 27, 3-фармілсаліцылавая кіслатааксідаза; 28, гідраксізафталатдэкарбаксілаза; 29, карбарылгідралаза (CH); 30, 1-нафтол-2-гідраксілаза.
У залежнасці ад арганізма і яго генетычнага складу, атрыманая саліцылавая кіслата далей метаболізуецца альбо па катэхолавым шляху з выкарыстаннем саліцылат-1-гідраксілазы (S1H), альбо па гентызатным шляху з выкарыстаннем саліцылат-5-гідраксілазы (S5H) (Малюнак 3). Паколькі саліцылавая кіслата з'яўляецца асноўным прамежкавым прадуктам у метабалізме нафталіну (верхні шлях), этапы ад саліцылавай кіслаты да прамежкавага прадукту TCA часта называюць ніжнім шляхам, а гены арганізаваны ў адзін аперон. Звычайна можна ўбачыць, што гены ў верхнім апероне шляху (nah) і ніжнім шляху (sal) рэгулююцца агульнымі рэгуляторнымі фактарамі; напрыклад, NahR і саліцылавая кіслата дзейнічаюць як індуктары, дазваляючы абодвум аперонам цалкам метабалізаваць нафталін (Phale et al., 2019, 2020).
Акрамя таго, катэхол цыклічна расшчапляецца да 2-гідраксімуканат-семіальдэгіду праз мета-шлях катэхол-2,3-дыаксігеназай (C23DO) (Yen et al., 1988) і далей гідралізуецца 2-гідраксімуканат-семіальдэгідгідралазай з утварэннем 2-гідраксіпент-2,4-дыенавай кіслаты. Затым 2-гідраксіпент-2,4-дыенаат пераўтвараецца ў піруват і ацэтальдэгід гідратазай (2-оксопент-4-еноатгідратаза) і альдалазай (4-гідраксі-2-оксопентанаат-альдалаза), а затым уваходзіць у цэнтральны вугляродны шлях (малюнак 3). Акрамя таго, катэхол цыклічна расшчапляецца да цыс,цыс-муканата праз орта-шлях катэхол-1,2-аксігеназай (C12DO). Муканатцыклаізамераза, муканалактонізамамераза і β-кетаадыпат-нолактонгідралаза пераўтвараюць цыс,цыс-муканат у 3-оксаадыпат, які ўваходзіць у цэнтральны вугляродны шлях праз сукцыніл-КоА і ацэтыл-КоА (Nozaki et al., 1968) (Малюнак 3).
У гентызатным (2,5-дыгідраксібензаатным) шляху араматычнае кольца расшчапляецца гентызат-1,2-дыаксігеназай (GDO) з утварэннем малеілпірувату. Гэты прадукт можа быць непасрэдна гідралізаваны да пірувату і малату, або можа быць ізамерызаваны з утварэннем фумарылпірувату, які затым можа быць гідралізаваны да пірувату і фумарату (Larkin and Day, 1986). Выбар альтэрнатыўнага шляху назіраўся як у грам-адмоўных, так і ў грам-станоўчых бактэрый на біяхімічным і генетычным узроўнях (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Грам-адмоўныя бактэрыі (Pseudomonas) аддаюць перавагу выкарыстоўваць саліцылавую кіслату, якая з'яўляецца індуктарам метабалізму нафталіну, дэкарбаксілюючы яе да катэхолу з дапамогай саліцылат-1-гідраксілазы (Gibson and Subramanian, 1984). З іншага боку, у грамстаноўчых бактэрый (Rhodococcus) саліцылат-5-гідраксілаза пераўтварае саліцылавую кіслату ў гентызінавую кіслату, тады як саліцылавая кіслата не аказвае індуктыўнага эфекту на транскрыпцыю генаў нафталіну (Grund et al., 1992) (малюнак 3).
Паведамлялася, што такія віды, як Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas і Mycobacterium, могуць раскладаць монаметылнафталін або дыметылнафталін (Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Сярод іх шлях дэградацыі 1-метылнафталіну і 2-метылнафталіну Pseudomonas sp. CSV86 быў выразна вывучаны на біяхімічным і ферментатыўным узроўнях (Mahajan et al., 1994). 1-метылнафталін метаболізуецца двума шляхамі. Спачатку араматычнае кольца гідраксілюецца (незамешчанае кольца метылнафталіну) з утварэннем цыс-1,2-дыгідраксі-1,2-дыгідра-8-метылнафталіну, які далей акісляецца да метылсаліцылату і метылкатэхіну, а затым пасля разрыву кольца ўваходзіць у цэнтральны вугляродны шлях (Малюнак 3). Гэты шлях называецца «шляхам крыніцы вугляроду». У другім «шляху дэтаксікацыі» метыльная група можа быць гідраксілявана NDO з утварэннем 1-гідраксіметылнафталіну, які далей акісляецца да 1-нафтаевай кіслаты і выводзіцца ў культуральнае асяроддзе як тупіковы прадукт. Даследаванні паказалі, што штам CSV86 не здольны расці на 1- і 2-нафтаевай кіслаце як адзінай крыніцы вугляроду і энергіі, што пацвярджае яго шлях дэтаксікацыі (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). У 2-метылнафталіне метыльная група падвяргаецца гідраксіляванню гідраксілазай з утварэннем 2-гідраксіметылнафталіну. Акрамя таго, незамешчанае кольца нафталінавага кольца падвяргаецца гідраксіляванню з утварэннем дыгідрадыёлу, які акісляецца да 4-гідраксіметылкатэхолу ў серыі ферментатыўных рэакцый і ўваходзіць у цэнтральны вугляродны шлях праз шлях расшчаплення мета-кольца. Падобным чынам, паведамлялася, што S. paucimobilis 2322 выкарыстоўвае NDO для гідраксілявання 2-метылнафталіну, які далей акісляецца з утварэннем метылсаліцылату і метылкатэхолу (Dutta et al., 1998).
Нафтавыя кіслоты (замешчаныя/незамешчаныя) з'яўляюцца пабочнымі прадуктамі дэтоксікацыі/біятрансфармацыі, якія ўтвараюцца падчас дэградацыі метылнафталіну, фенантрэну і антрацэну і вызваляюцца ў адпрацаванае культуральнае асяроддзе. Паведамлялася, што глебавы ізалят Stenotrophomonas maltophilia CSV89 здольны метабалізаваць 1-нафтавую кіслату як крыніцу вугляроду (Phale et al., 1995). Метабалізм пачынаецца з дыгідраксілявання араматычнага кольца з утварэннем 1,2-дыгідраксі-8-карбаксінафталіну. Атрыманы дыёл акісляецца да катэхолу праз 2-гідраксі-3-карбаксібензілідэнпіруват, 3-фармалісаліцылавую кіслату, 2-гідраксізафталевую кіслату і саліцылавую кіслату і ўваходзіць у цэнтральны вугляродны шлях праз шлях расшчаплення мета-кольца (Малюнак 3).
Карбарыл — гэта пестыцыд групы нафтылкарбамату. З часоў «зялёнай рэвалюцыі» ў Індыі ў 1970-х гадах выкарыстанне хімічных угнаенняў і пестыцыдаў прывяло да павелічэння выкідаў поліцыклічных араматычных вуглевадародаў (ПАВ) з сельскагаспадарчых дыфузійных крыніц (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Паводле ацэнак, 55% (85 722 000 гектараў) ад агульнай плошчы ворных зямель у Індыі апрацоўваецца хімічнымі пестыцыдамі. За апошнія пяць гадоў (2015–2020) сельскагаспадарчы сектар Індыі штогод выкарыстоўваў у сярэднім ад 55 000 да 60 000 тон пестыцыдаў (Дэпартамент кааператываў і дабрабыту фермераў, Міністэрства сельскай гаспадаркі, Урад Індыі, жнівень 2020 г.). На паўночных і цэнтральных раўнінах Ганга (штаты з найбольшай колькасцю насельніцтва і шчыльнасцю насельніцтва) шырока распаўсюджана выкарыстанне пестыцыдаў на сельскагаспадарчых культурах, прычым пераважаюць інсектыцыды. Карбарыл (1-нафтыл-N-метылкарбамат) — гэта карбаматны інсектыцыд шырокага спектру дзеяння ад умерана да высокатаксічнага, які выкарыстоўваецца ў сельскай гаспадарцы Індыі ў сярэднім 100–110 тон. Ён звычайна прадаецца пад гандлёвай назвай Sevin і выкарыстоўваецца для барацьбы з насякомымі (тлямі, агністымі мурашкамі, блохамі, кляшчамі, павукамі і многімі іншымі шкоднікамі на адкрытым паветры), якія паражаюць розныя культуры (кукурузу, сою, бавоўну, садавіну і гародніну). Некаторыя мікраарганізмы, такія як Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus і Arthrobacter, таксама могуць выкарыстоўвацца для барацьбы з іншымі шкоднікамі. Паведамлялася, што RC100 можа раскладаць карбарыл (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Шлях раскладання карбарылу быў шырока вывучаны на біяхімічным, ферментатыўным і генетычным узроўнях у глебавых ізалятах Pseudomonas sp. Штамы C4, C5 і C6 (Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (мал. 3). Метабалічны шлях пачынаецца з гідролізу эфірнай сувязі карбарылгідралазай (CH) з утварэннем 1-нафтолу, метыламіну і вуглякіслага газу. Затым 1-нафтол пераўтвараецца ў 1,2-дыгідраксінафталін пад дзеяннем 1-нафтогідраксілазы (1-NH), які далей метаболізуецца праз цэнтральны вугляродны шлях праз саліцылат і гентызат. Паведамлялася, што некаторыя бактэрыі, якія дэградуюць карбарыл, метабалізуюць яго да саліцылавай кіслаты праз расшчапленне орта-кольца катэхолу (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). Прыкметна, што бактэрыі, якія дэградуюць нафталін, у асноўным метабалізуюць саліцылавую кіслату праз катэхол, тады як бактэрыі, якія дэградуюць карбарыл, аддаюць перавагу метабалізаваць саліцылавую кіслату праз гентызатны шлях.
Вытворныя нафталінсульфонавай кіслаты/дысульфонавай кіслаты і нафтыламінсульфонавай кіслаты могуць выкарыстоўвацца ў якасці прамежкавых прадуктаў у вытворчасці азафарбавальнікаў, змочвальных агентаў, дыспергатараў і г.д. Нягледзячы на ​​нізкую таксічнасць гэтых злучэнняў для чалавека, ацэнкі цытатаксічнасці паказалі, што яны смяротныя для рыб, дафній і водарасцяў (Greim et al., 1994). Паведамлялася, што прадстаўнікі роду Pseudomonas (штамы A3, C22) ініцыююць метабалізм шляхам падвойнага гідраксілявання араматычнага кольца, якое змяшчае сульфонавую кіслату, з утварэннем дыгідрадыёлу, які далей пераўтвараецца ў 1,2-дыгідраксінафталін шляхам спантаннага расшчаплення сульфітнай групы (Brilon et al., 1981). Атрыманы 1,2-дыгідраксінафталін катабалізуецца праз класічны нафталінавы шлях, г.зн. катэхолавы або гентызатны шлях (малюнак 4). Было паказана, што амінанафталінсульфонавая кіслата і гідраксінафталінсульфонавая кіслата могуць быць цалкам дэградаваны змешанымі бактэрыяльнымі кансорцыумамі з камплементарнымі катабалічнымі шляхамі (Nortemann et al., 1986). Было паказана, што адзін з членаў кансорцыума дэсульфурызуе амінанафталінсульфонавую кіслату або гідраксінафталінсульфонавую кіслату шляхам 1,2-дыаксігенацыі, у той час як амінасаліцылат або гідраксісаліцылат вызваляецца ў культуральнае асяроддзе ў якасці тупіковага метабаліту і пасля паглынаецца іншымі членамі кансорцыума. Нафталіндысульфонавая кіслата адносна палярная, але дрэнна біяраскладальная і таму можа метаболізавацца рознымі шляхамі. Першае дэсульфурызаванне адбываецца падчас рэгіяселектыўнага дыгідраксілявання араматычнага кольца і сульфонакіслотнай групы; другое дэсульфурызаванне адбываецца падчас гідраксілявання 5-сульфасаліцылавай кіслаты саліцылавай кіслатой-5-гідраксілазай з утварэннем гентызінавай кіслаты, якая ўваходзіць у цэнтральны вугляродны шлях (Brilon et al., 1981) (Малюнак 4). Ферменты, якія адказваюць за дэградацыю нафталіну, таксама адказваюць за метабалізм сульфанату нафталіну (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Малюнак 4. Метабалічныя шляхі дэградацыі нафталінсульфанату. Лічбы ўнутры колаў абазначаюць ферменты, адказныя за метабалізм нафтылсульфанату, падобныя/ідэнтычныя ферментам, апісаным на мал. 3.
Нізкамалекулярныя ПАВ (НМ-ПАВ) з'яўляюцца аднаўляльнымі, гідрафобнымі і дрэнна растваральнымі, таму не схільныя да натуральнага раскладання/дэградацыі. Аднак аэробныя мікраарганізмы здольныя акісляць іх, паглынаючы малекулярны кісларод (O2). Гэтыя ферменты ў асноўным адносяцца да класа аксідарэдуктаз і могуць выконваць розныя рэакцыі, такія як гідраксіляванне араматычнага кольца (мона- або дыгідраксіляванне), дэгідрагенацыя і разрыў араматычнага кольца. Прадукты, атрыманыя ў выніку гэтых рэакцый, знаходзяцца ў больш высокай ступені акіслення і лягчэй метаболізуюцца праз цэнтральны вугляродны шлях (Phale et al., 2020). Паведамлялася, што ферменты ў шляху дэградацыі індуцыбельныя. Актыўнасць гэтых ферментаў вельмі нізкая або нязначная, калі клеткі вырошчваюцца на простых крыніцах вугляроду, такіх як глюкоза або арганічныя кіслоты. У табліцы 3 падсумаваны розныя ферменты (аксігеназы, гідралазы, дэгідрагеназы, аксідазы і г.д.), якія ўдзельнічаюць у метабалізме нафталіну і яго вытворных.
Табліца 3. Біяхімічныя характарыстыкі ферментаў, якія адказваюць за дэградацыю нафталіну і яго вытворных.
Радыёізатопныя даследаванні (18O2) паказалі, што ўключэнне малекулярнага O2 у араматычныя кольцы аксігеназамі з'яўляецца найважнейшым этапам у актывацыі далейшай біядэградацыі злучэння (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Уключэнне аднаго атама кіслароду (O) з малекулярнага кіслароду (O2) у субстрат ініцыюецца альбо эндагеннымі, альбо экзагеннымі монааксігеназамі (таксама званымі гідраксілазамі). Іншы атам кіслароду аднаўляецца да вады. Экзагенныя монааксігеназы аднаўляюць флавін з дапамогай NADH або NADPH, тады як у эндаманааксігеназах флавін аднаўляецца субстратам. Пазіцыя гідраксілявання прыводзіць да разнастайнасці ўтварэння прадуктаў. Напрыклад, саліцылат-1-гідраксілаза гідраксілюе саліцылавую кіслату ў становішчы C1, утвараючы катэхол. З іншага боку, шматкампанентная саліцылат-5-гідраксілаза (якая змяшчае субадзінкі рэдуктазы, ферэдаксіну і аксігеназы) гідраксілюе саліцылавую кіслату ў становішчы C5, утвараючы гентызінавую кіслату (Yamamoto et al., 1965).
Дыаксігеназы ўключаюць два атамы O2 у субстрат. У залежнасці ад прадуктаў, якія ўтвараюцца, яны падзяляюцца на дыаксігеназы, якія гідраксіліруюць кальцо, і дыаксігеназы, якія расшчапляюць кальцо. Дыаксігеназы, якія расшчапляюць кальцо, пераўтвараюць араматычныя субстраты ў цыс-дыгідрадыёлы (напрыклад, нафталін) і шырока распаўсюджаны сярод бактэрый. На сённяшні дзень паказана, што арганізмы, якія змяшчаюць дыаксігеназы, якія гідраксіліруюць кальцо, здольныя расці на розных крыніцах араматычнага вугляроду, і гэтыя ферменты класіфікуюцца як NDO (нафталін), талуолдыаксігеназа (TDO, талуол) і біфенілдыаксігеназа (BPDO, біфеніл). Як NDO, так і BPDO могуць каталізаваць падвойнае акісленне і гідраксіляванне бакавых ланцугоў розных поліцыклічных араматычных вуглевадародаў (талуолу, нітраталуолу, ксілолу, этылбензолу, нафталіну, біфенілу, флуарэну, індолу, метылнафталіну, нафталінсульфаната, фенантрэну, антрацэну, ацэтафенону і г.д.) (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO — гэта шматкампанентная сістэма, якая складаецца з аксідарэдуктазы, ферэдаксіну і кампанента аксігеназы, які змяшчае актыўны цэнтр (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Каталітычная адзінка NDO складаецца з вялікай α-субадзінкі і малой β-субадзінкі, размешчаных у канфігурацыі α3β3. НДО належыць да вялікага сямейства аксігеназ, і яго α-субадзінка змяшчае сайт Рыске [2Fe-2S] і монануклеарнае негемавае жалеза, якое вызначае спецыфічнасць субстрата НДО (Parales et al., 1998). Як правіла, у адным каталітычным цыкле два электроны ад аднаўлення нуклеатыду пірыдыну пераносяцца на іон Fe(II) у актыўным цэнтры праз рэдуктазу, ферэдаксін і сайт Рыске. Аднаўляльныя эквіваленты актывуюць малекулярны кісларод, што з'яўляецца неабходнай умовай для дыгідраксілявання субстрата (Ferraro et al., 2005). На сённяшні дзень толькі некалькі НДО былі ачышчаны і падрабязна ахарактарызаваны з розных штамаў, і генетычны кантроль шляхоў, якія ўдзельнічаюць у дэградацыі нафталіну, быў падрабязна вывучаны (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Дыаксігеназы, якія расшчапляюць кальцо (энзімы, якія расшчапляюць энда- або орта-кальцо, і ферменты, якія расшчапляюць экзадыёл- або мета-кальцо), дзейнічаюць на гідраксіляваныя араматычныя злучэнні. Напрыклад, дыаксігеназа, якая расшчапляе орта-кальцо, — гэта катэхол-1,2-дыаксігеназа, тады як дыаксігеназа, якая расшчапляе мета-кальцо, — гэта катэхол-2,3-дыаксігеназа (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Акрамя розных аксігеназ, існуюць таксама розныя дэгідрагеназы, якія адказваюць за дэгідрагенацыю араматычных дыгідрыядыёлаў, спіртоў і альдэгідаў і выкарыстоўваюць NAD+/NADP+ у якасці акцэптараў электронаў, якія з'яўляюцца аднымі з важных ферментаў, што ўдзельнічаюць у метабалізме (Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Такія ферменты, як гідралазы (эстеразы, амідазы), з'яўляюцца другім важным класам ферментаў, якія выкарыстоўваюць ваду для расшчаплення кавалентных сувязяў і праяўляюць шырокую субстратную спецыфічнасць. Карбарылгідралаза і іншыя гідралазы лічацца кампанентамі перыплазмы (трансмембраны) у прадстаўнікоў грам-адмоўных бактэрый (Kamini et al., 2018). Карбарыл мае як амідную, так і эфірную сувязь; таму ён можа быць гідралізаваны альбо эстэразай, альбо амідазай з утварэннем 1-нафтолу. Паведамлялася, што карбарыл у штаме Rhizobium rhizobium AC10023 і штаме Arthrobacter RC100 функцыянуе як эстэраза і амідаза адпаведна. Карбарыл у штаме Arthrobacter RC100 таксама функцыянуе як амідаза. Было паказана, што RC100 гідралізуе чатыры інсектыцыды класа N-метылкарбаматаў, такія як карбарыл, метаміл, мефенамінавая кіслата і XMC (Hayaatsu et al., 2001). Паведамлялася, што CH у Pseudomonas sp. C5pp можа ўздзейнічаць на карбарыл (100% актыўнасць) і 1-нафтылацэтат (36% актыўнасць), але не на 1-нафтылацэтамід, што сведчыць аб тым, што ён з'яўляецца эстэразай (Trivedi et al., 2016).
Біяхімічныя даследаванні, заканамернасці рэгуляцыі ферментаў і генетычны аналіз паказалі, што гены дэградацыі нафталіну складаюцца з двух індуцыбельных рэгуляторных адзінак або «аперонаў»: nah («шлях вышэйшага па плыні», які пераўтварае нафталін у саліцылавую кіслату) і sal («шлях ніжэйшага па плыні», які пераўтварае саліцылавую кіслату ў цэнтральны вугляродны шлях праз катэхол). Саліцылавая кіслата і яе аналагі могуць выступаць у якасці індуктараў (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). У прысутнасці глюкозы або арганічных кіслот аперон рэпрэсуецца. На малюнку 5 паказана поўная генетычная арганізацыя дэградацыі нафталіну (у форме аперона). Было апісана некалькі названых варыянтаў/форм гена nah (ndo/pah/dox), якія маюць высокую гамалогію паслядоўнасці (90%) сярод усіх відаў Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Гены шляху вышэйшага па плыні нафталіну звычайна былі размешчаны ў кансенсусным парадку, як паказана на малюнку 5A. Паведамлялася, што іншы ген, nahQ, таксама ўдзельнічае ў метабалізме нафталіну і звычайна размяшчаецца паміж nahC і nahE, але яго сапраўдная функцыя застаецца невысветленай. Падобным чынам, ген nahY, адказны за адчувальны да нафталіну хемотаксис, быў знойдзены ў дыстальным канцы nah-аперона ў некаторых прадстаўнікоў. У Ralstonia sp. ген U2, які кадуе глутатыён-S-трансферазу (gsh), быў размешчаны паміж nahAa і nahAb, але не ўплываў на характарыстыкі ўтылізацыі нафталіну (Zylstra et al., 1997).
Малюнак 5. Генетычная арганізацыя і разнастайнасць, якія назіраюцца падчас дэградацыі нафталіну сярод бактэрыяльных відаў; (А) Верхні шлях нафталіну, метабалізм нафталіну да саліцылавай кіслаты; (Б) Ніжні шлях нафталіну, саліцылавая кіслата праз катэхол да цэнтральнага вугляроднага шляху; (В) саліцылавая кіслата праз гентызат да цэнтральнага вугляроднага шляху.
«Ніжэйшы шлях» (sal-апераон) звычайна складаецца з nahGTHINLMOKJ і пераўтварае саліцылат у піруват і ацэтальдэгід праз шлях расшчаплення катэхол-метарынгу. Ген nahG (які кадуе саліцылатгідраксілазу) быў захаваны на праксімальным канцы аперана (мал. 5B). У параўнанні з іншымі штамамі, якія дэградуюць нафталін, у P. putida CSV86 апераны nah і sal тандэмныя і вельмі цесна звязаныя (каля 7,5 кб). У некаторых грамотріцательных бактэрый, такіх як Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 і P. putida AK5, нафталін метаболізуецца як цэнтральны вугляродны метабаліт праз гентызатны шлях (у выглядзе аперана sgp/nag). Генная касета звычайна прадстаўлена ў выглядзе nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, дзе nagR (які кадуе рэгулятар тыпу LysR) размешчаны ў верхнім канцы (малюнак 5C).
Карбарыл уваходзіць у цэнтральны вугляродны цыкл праз метабалізм 1-нафтолу, 1,2-дыгідраксінафталіну, саліцылавай кіслаты і гентызінавай кіслаты (малюнак 3). На падставе генетычных і метабалічных даследаванняў было прапанавана падзяліць гэты шлях на «верхні» (пераўтварэнне карбарылу ў саліцылавую кіслату), «сярэдні» (пераўтварэнне саліцылавай кіслаты ў гентызінавую кіслату) і «ніжні» (пераўтварэнне гентызінавай кіслаты ў прамежкавыя прадукты цэнтральнага вугляроднага шляху) (Singh et al., 2013). Геномны аналіз C5pp (суперкантыг А, 76,3 кб) паказаў, што ген mcbACBDEF удзельнічае ў пераўтварэнні карбарылу ў саліцылавую кіслату, затым mcbIJKL — у пераўтварэнні саліцылавай кіслаты ў гентызінавую кіслату, а mcbOQP — у пераўтварэнні гентызінавай кіслаты ў цэнтральныя вугляродныя прамежкавыя прадукты (фумарат і піруват, Trivedi et al., 2016) (Малюнак 6).
Паведамлялася, што ферменты, якія ўдзельнічаюць у дэградацыі араматычных вуглевадародаў (у тым ліку нафталіну і саліцылавай кіслаты), могуць індукавацца адпаведнымі злучэннямі і інгібіравацца простымі крыніцамі вугляроду, такімі як глюкоза або арганічныя кіслоты (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Сярод розных метабалічных шляхоў нафталіну і яго вытворных, рэгуляторныя асаблівасці нафталіну і карбарылу былі да пэўнай ступені вывучаны. Для нафталіну гены як у папярэдніх, так і ў наступных шляхах рэгулююцца NahR, транс-дзейнічаючым станоўчым рэгулятарам тыпу LysR. Ён неабходны для індукцыі гена nah саліцылавай кіслатой і яго наступнай экспрэсіі на высокім узроўні (Yen and Gunsalus, 1982). Акрамя таго, даследаванні паказалі, што інтэгратыўны фактар ​​гаспадара (IHF) і XylR (сігма 54-залежны транскрыпцыйны рэгулятар) таксама маюць вырашальнае значэнне для транскрыпцыйнай актывацыі генаў у метабалізме нафталіну (Ramos et al., 1997). Даследаванні паказалі, што ферменты шляху раскрыцця мета-кольца катэхолу, а менавіта катэхол-2,3-дыяксігеназа, індукуюцца ў прысутнасці нафталіну і/або саліцылавай кіслаты (Basu et al., 2006). Даследаванні паказалі, што ферменты шляху раскрыцця орта-кольца катэхолу, а менавіта катэхол-1,2-дыяксігеназа, індукуюцца ў прысутнасці бензойнай кіслаты і цыс,цыс-муканата (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
У штаме C5pp пяць генаў, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR і mcbS, кадуюць рэгулятары, якія належаць да сямейства транскрыпцыйных рэгулятараў LysR/TetR, адказных за кантроль дэградацыі карбарылу. Было ўстаноўлена, што гамалагічны ген mcbG найбольш цесна звязаны з рэгулятарам тыпу LysR PhnS (58% ідэнтычнасць амінакіслот), які ўдзельнічае ў метабалізме фенантрэну ў Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Было ўстаноўлена, што ген mcbH удзельнічае ў прамежкавым шляху (пераўтварэнне саліцылавай кіслаты ў гентызінавую кіслату) і належыць да транскрыпцыйнага рэгулятара тыпу LysR NagR/DntR/NahR у Pseudomonas і Burkholderia. Паведамлялася, што прадстаўнікі гэтага сямейства распазнаюць саліцылавую кіслату як спецыфічную эфектарную малекулу для індукцыі генаў дэградацыі. З іншага боку, у ніжэйшым шляху (метабаліты гентызатна-цэнтральнага вугляроднага шляху) былі выяўлены тры гены, mcbN, mcbR і mcbS, якія належаць да транскрыпцыйных рэгулятараў тыпу LysR і TetR.
У пракарыёт гарызантальныя працэсы пераносу генаў (набыццё, абмен або перанос) праз плазміды, транспазоны, прафагі, геномныя астраўкі і інтэгратыўныя кан'югатыўныя элементы (ICE) з'яўляюцца асноўнымі прычынамі пластычнасці ў бактэрыяльных геномах, што прыводзіць да атрымання або страты пэўных функцый/рыс. Гэта дазваляе бактэрыям хутка адаптавацца да розных умоў навакольнага асяроддзя, забяспечваючы патэнцыйныя адаптыўныя метабалічныя перавагі для гаспадара, такія як дэградацыя араматычных злучэнняў. Метабалічныя змены часта дасягаюцца шляхам тонкай налады аперонаў дэградацыі, іх рэгуляторных механізмаў і спецыфічнасці ферментаў, што спрыяе дэградацыі больш шырокага спектру араматычных злучэнняў (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Было выяўлена, што генныя касеты для дэградацыі нафталіну размешчаны на розных мабільных элементах, такіх як плазміды (кан'югатыўныя і некан'югатыўныя), транспазоны, геномы, ICE і камбінацыі розных відаў бактэрый (малюнак 5). У Pseudomonas G7 nah- і sal-апераны плазміды NAH7 транскрыбуюцца ў аднолькавай арыентацыі і з'яўляюцца часткай дэфектнага транспазона, для мабілізацыі якога патрабуецца транспазаза Tn4653 (Sota et al., 2006). У штаме Pseudomonas NCIB9816-4 ген быў знойдзены на кан'югатыўнай плазмідзе pDTG1 у выглядзе двух аперанаў (прыблізна на адлегласці 15 кб адзін ад аднаго), якія былі транскрыбаваны ў процілеглых кірунках (Dennis and Zylstra, 2004). У штаме Pseudomonas putida AK5 некан'югатыўная плазміда pAK5 кадуе фермент, адказны за дэградацыю нафталіну праз гентызатны шлях (Izmalkova et al., 2013). У штаме Pseudomonas PMD-1 nah-апераны размешчаны на храмасоме, тады як sal-апераны — на кан'югатыўнай плазмідзе pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Аднак у Pseudomonas stutzeri AN10 усе гены дэградацыі нафталіну (апероны nah і sal) размешчаны на храмасоме і, верагодна, рэкрутуюцца праз падзеі транспазіцыі, рэкамбінацыі і перабудовы (Bosch et al., 2000). У Pseudomonas sp. CSV86 апероны nah і sal размешчаны ў геноме ў выглядзе ICE (ICECSV86). Структура абаронена тРНК-гліцыну (tRNAGly), за якой ідуць прамыя паўторы, якія паказваюць на месцы рэкамбінацыі/прымацавання (attR і attL), і фагападобнай інтэгразай, размешчанай на абодвух канцах тРНК-гліцыну, такім чынам структурна падобнай да элемента ICEclc (ICEclcB13 у Pseudomonas knackmusii для дэградацыі хлоркатэхолу). Паведамлялася, што гены на ICE могуць быць перададзены шляхам кан'югацыі з надзвычай нізкай частатой пераносу (10-8), тым самым перадаючы ўласцівасці дэградацыі рэцыпіенту (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Большасць генаў, адказных за дэградацыю карбарылу, размешчаны на плазмідах. Arthrobacter sp. RC100 змяшчае тры плазміды (pRC1, pRC2 і pRC300), з якіх дзве кан'югацыйныя плазміды, pRC1 і pRC2, кадуюць ферменты, якія пераўтвараюць карбарыл у гентызат. З іншага боку, ферменты, якія ўдзельнічаюць у пераўтварэнні гентызату ў цэнтральныя вугляродныя метабаліты, размешчаны на храмасоме (Hayaatsu et al., 1999). Бактэрыі роду Rhizobium. Штам AC100, які выкарыстоўваецца для пераўтварэння карбарылу ў 1-нафтол, змяшчае плазміду pAC200, якая нясе ген cehA, які кадуе CH, як частку транспозона Tnceh, акружанага паслядоўнасцямі, падобнымі на інсерцыйныя элементы (istA і istB) (Hashimoto et al., 2002). У штаме Sphingomonas CF06 ген дэградацыі карбарылу, як мяркуецца, прысутнічае ў пяці плазмідах: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 і pCF05. Гамалогія ДНК гэтых плазмід высокая, што сведчыць аб існаванні падзеі дуплікацыі генаў (Feng et al., 1997). У сімбіёнце, які дэградуе карбарыл і складаецца з двух відаў Pseudomonas, штам 50581 змяшчае кан'югатыўную плазміду pCD1 (50 kb), якая кадуе ген карбарылгідралазы mcd, тады як кан'югатыўная плазміда ў штаме 50552 кадуе фермент, які дэградуе 1-нафтол (Chapalamadugu і Chaudhry, 1991). У штаме Achromobacter WM111 ген фурадангідралазы mcd размешчаны на плазмідзе памерам 100 kb (pPDL11). Было паказана, што гэты ген прысутнічае на розных плазмідах (100, 105, 115 або 124 кб) у розных бактэрый з розных геаграфічных рэгіёнаў (Parekh et al., 1995). У Pseudomonas sp. C5pp усе гены, адказныя за дэградацыю карбарылу, размешчаны ў геноме, які ахоплівае 76,3 кб паслядоўнасці (Trivedi et al., 2016). Аналіз геному (6,15 Мб) выявіў наяўнасць 42 MGE і 36 GEI, з якіх 17 MGE былі размешчаны ў суперкантыгу A (76,3 кб) з сярэднім асіметрычным утрыманнем G+C (54–60 моль%), што сведчыць аб магчымых гарызантальных падзеях пераносу генаў (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 мае падобнае размяшчэнне генаў, якія дэградуюць карбарыл, але гэтыя гены размешчаны на плазмідзе (Zhu et al., 2019).
Акрамя метабалічнай эфектыўнасці на біяхімічным і геномным узроўнях, мікраарганізмы таксама праяўляюць іншыя ўласцівасці або рэакцыі, такія як хематаксіс, уласцівасці мадыфікацыі паверхні клетак, компартменталізацыя, пераважнае выкарыстанне, вытворчасць біяпавярхоўна-актыўных рэчываў і г.д., якія дапамагаюць ім больш эфектыўна метабалізаваць араматычныя забруджвальнікі ў забруджаным асяроддзі (малюнак 7).
Малюнак 7. Розныя стратэгіі клеткавага рэагавання ідэальных бактэрый, якія дэградуюць араматычныя вуглевадароды, для эфектыўнай біядэградацыі забруджвальных рэчываў.
Хемотаксічныя рэакцыі лічацца фактарамі, якія ўзмацняюць дэградацыю арганічных забруджвальнікаў у гетэрагенна забруджаных экасістэмах. (2002) паказалі, што хемотаксіс Pseudomonas sp. G7 да нафталіну павялічвае хуткасць дэградацыі нафталіну ў водных сістэмах. Штам дзікага тыпу G7 дэградаваў нафталін значна хутчэй, чым мутантны штам з дэфіцытам хемотаксісу. Было выяўлена, што бялок NahY (538 амінакіслот з мембраннай тапалогіяй) котранскрыбуецца з генамі шляху метаклаважу на плазмідзе NAH7, і, як і пераўтваральнікі хемотаксісу, гэты бялок, відаць, функцыянуе як хеморэцэптар для дэградацыі нафталіну (Grimm and Harwood 1997). Іншае даследаванне Ханзеля і інш. (2009) паказала, што бялок з'яўляецца хемотаксічным, але хуткасць яго дэградацыі высокая. (2011) прадэманстравалі хемотаксічную рэакцыю Pseudomonas (P. putida) на газападобны нафталін, прычым дыфузія ў газавай фазе прывяла да пастаяннага патоку нафталіну да клетак, што кантралявала хемотаксічную рэакцыю клетак. Даследчыкі выкарысталі гэтую хематаксічную паводзіны для стварэння мікробаў, якія б паскаралі хуткасць дэградацыі. Даследаванні паказалі, што хемасенсорныя шляхі таксама рэгулююць іншыя клеткавыя функцыі, такія як дзяленне клетак, рэгуляцыя клеткавага цыклу і ўтварэнне біяплёнкі, тым самым дапамагаючы кантраляваць хуткасць дэградацыі. Аднак выкарыстанне гэтай уласцівасці (хематаксісу) для эфектыўнай дэградацыі абцяжарана некалькімі вузкімі месцамі. Асноўнымі перашкодамі з'яўляюцца: (а) розныя паралагічныя рэцэптары распазнаюць адны і тыя ж злучэнні/ліганды; (б) існаванне альтэрнатыўных рэцэптараў, г.зн. энергетычнага трапізму; (в) значныя адрозненні ў паслядоўнасці ў сэнсарных даменах аднаго і таго ж сямейства рэцэптараў; і (г) адсутнасць інфармацыі аб асноўных бактэрыяльных сэнсарных бялках (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Часам біядэградацыя араматычных вуглевадародаў прыводзіць да ўтварэння некалькіх метабалітаў/прамежкавых прадуктаў, якія могуць быць хематаксічнымі для адной групы бактэрый, але адштурхоўваць іншых, што яшчэ больш ускладняе працэс. Каб вызначыць узаемадзеянне лігандаў (араматычных вуглевадародаў) з хімічнымі рэцэптарамі, мы сканструявалі гібрыдныя сэнсарныя бялкі (PcaY, McfR і NahY) шляхам аб'яднання сэнсарных і сігнальных даменаў Pseudomonas putida і Escherichia coli, якія накіраваны на рэцэптары араматычных кіслот, прамежкавых прадуктаў TCA і нафталіну адпаведна (Luu et al., 2019).
Пад уплывам нафталіну і іншых поліцыклічных араматычных вуглевадародаў (ПАВ) структура бактэрыяльнай мембраны і цэласнасць мікраарганізмаў перажываюць значныя змены. Даследаванні паказалі, што нафталін перашкаджае ўзаемадзеянню ацыльнага ланцуга праз гідрафобныя ўзаемадзеянні, тым самым павялічваючы набраканне і цякучасць мембраны (Sikkema et al., 1995). Каб супрацьстаяць гэтаму шкоднаму эфекту, бактэрыі рэгулююць цякучасць мембраны, змяняючы суадносіны і склад тоўстых кіслот паміж іза/антэіза разгалінаванымі тоўстымі кіслотамі і ізамерызуючы цыс-ненасычаныя тоўстыя кіслоты ў адпаведныя транс-ізамеры (Heipieper and de Bont, 1994). У Pseudomonas stutzeri, вырашчанай пасля апрацоўкі нафталінам, суадносіны насычаных і ненасычаных тоўстых кіслот павялічылася з 1,1 да 2,1, тады як у Pseudomonas JS150 гэта суадносіны павялічылася з 7,5 да 12,0 (Mrozik et al., 2004). Пры вырошчванні на нафталіне клеткі Achromobacter KAs 3–5 праяўлялі агрэгацыю клетак вакол крышталяў нафталіну і зніжэнне зарада паверхні клетак (з -22,5 да -2,5 мВ), што суправаджалася цытаплазматычнай кандэнсацыяй і вакуолізацыяй, што сведчыць аб зменах у структуры клетак і ўласцівасцях паверхні клетак (Mohapatra et al., 2019). Нягледзячы на ​​тое, што змены ў клетках/паверхні непасрэдна звязаны з лепшым паглынаннем араматычных забруджвальнікаў, адпаведныя стратэгіі біяінжынерыі не былі цалкам аптымізаваны. Маніпуляцыі формай клетак рэдка выкарыстоўваліся для аптымізацыі біялагічных працэсаў (Volke and Nikel, 2018). Дэлецыя генаў, якія ўплываюць на дзяленне клетак, выклікае змены ў марфалогіі клетак. Дэлецыя генаў, якія ўплываюць на дзяленне клетак, выклікае змены ў марфалогіі клетак. У Bacillus subtilis было паказана, што бялок клеткавай перагародкі SepF удзельнічае ў фарміраванні перагародкі і неабходны для наступных этапаў дзялення клетак, але ён не з'яўляецца неабходным генам. Дэлецыя генаў, якія кадуюць пептыд-глікан-гідралазы ў Bacillus subtilis, прывяла да падаўжэння клетак, павелічэння ўдзельнай хуткасці росту і паляпшэння здольнасці выпрацоўваць ферменты (Cui et al., 2018).
Для дасягнення эфектыўнай дэградацыі штамаў Pseudomonas C5pp і C7 была прапанавана компартменталізацыя шляху дэградацыі карбарылу (Kamini et al., 2018). Мяркуецца, што карбарыл транспартуецца ў перыплазматычную прастору праз перагародку вонкавай мембраны і/або праз дыфузійныя поріны. CH - гэта перыплазматычны фермент, які каталізуе гідроліз карбарылу да 1-нафтолу, які з'яўляецца больш стабільным, больш гідрафобным і больш таксічным. CH лакалізаваны ў перыплазме і мае нізкую афіннасць да карбарылу, тым самым кантралюючы ўтварэнне 1-нафтолу, тым самым прадухіляючы яго назапашванне ў клетках і зніжаючы яго таксічнасць для клетак (Kamini et al., 2018). Атрыманы 1-нафтол транспартуецца ў цытаплазму праз унутраную мембрану шляхам падзелу і/або дыфузіі, а затым гідраксіліруецца да 1,2-дыгідраксінафталіну высокаафінным ферментам 1NH для далейшага метабалізму ў цэнтральным вугляродным шляху.
Нягледзячы на ​​тое, што мікраарганізмы валодаюць генетычнымі і метабалічнымі здольнасцямі раскладаць ксенабіятычныя крыніцы вугляроду, іерархічная структура іх выкарыстання (г.зн. пераважнае выкарыстанне простых крыніц вугляроду над складанымі) з'яўляецца асноўнай перашкодай для біядэградацыі. Наяўнасць і выкарыстанне простых крыніц вугляроду прыводзіць да паніжэння рэгуляцыі генаў, якія кадуюць ферменты, што раскладаюць складаныя/непераважныя крыніцы вугляроду, такія як ПАВ. Добра вывучаным прыкладам з'яўляецца тое, што пры сумесным увядзенні глюкозы і лактозы ў Escherichia coli глюкоза выкарыстоўваецца больш эфектыўна, чым лактоза (Jacob and Monod, 1965). Паведамлялася, што Pseudomonas раскладаюць розныя ПАВ і ксенабіятычныя злучэнні як крыніцы вугляроду. Іерархія выкарыстання крыніц вугляроду ў Pseudomonas выглядае наступным чынам: арганічныя кіслоты > глюкоза > араматычныя злучэнні (Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Аднак ёсць і выключэнне. Цікава, што Pseudomonas sp. CSV86 мае ўнікальную іерархічную структуру, якая пераважна выкарыстоўвае араматычныя вуглевадароды (бензойную кіслату, нафталін і г.д.), а не глюкозу, і сумесна метабалізуе араматычныя вуглевадароды з арганічнымі кіслотамі (Basu et al., 2006). У гэтай бактэрыі гены дэградацыі і транспарту араматычных вуглевадародаў не паніжаюцца нават у прысутнасці другой крыніцы вугляроду, такой як глюкоза або арганічныя кіслоты. Пры вырошчванні ў асяроддзі з глюкозай і араматычнымі вуглевадародамі было заўважана, што гены транспарту і метабалізму глюкозы былі паніжаныя, араматычныя вуглевадароды выкарыстоўваліся ў першай лагарыфмічнай фазе, а глюкоза - у другой лагарыфмічнай фазе (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). З іншага боку, прысутнасць арганічных кіслот не паўплывала на экспрэсію метабалізму араматычных вуглевадародаў, таму чакаецца, што гэтая бактэрыя будзе кандыдатам для даследаванняў біядэградацыі (Phale et al., 2020).
Добра вядома, што біятрансфармацыя вуглевадародаў можа выклікаць акісляльны стрэс і павышэнне рэгуляцыі антыаксідантных ферментаў у мікраарганізмаў. Неэфектыўная біядэградацыя нафталіну як у клетках стацыянарнай фазы, так і ў прысутнасці таксічных злучэнняў прыводзіць да ўтварэння актыўных формаў кіслароду (АФК) (Kang et al. 2006). Паколькі ферменты, якія дэградуюць нафталін, утрымліваюць жалеза-серныя кластары, пры акісляльным стрэсе жалеза ў гемавых і жалеза-серных бялках будзе акісляцца, што прывядзе да інактывацыі бялку. Ферэдаксін-НАДФ+-рэдуктаза (Fpr) разам з супераксіддысмутазай (SOD) апасродкуе зварачальную акісляльна-аднаўленчую рэакцыю паміж NADP+/NADPH і двума малекуламі ферэдаксіну або флавадаксіну, тым самым знішчаючы АФК і аднаўляючы жалеза-серны цэнтр пры акісляльным стрэсе (Li et al. 2006). Паведамлялася, што як Fpr, так і SodA (SOD) у Pseudomonas могуць быць выкліканыя акісляльным стрэсам, і павышаная актыўнасць SOD і каталазы назіралася ў чатырох штамах Pseudomonas (O1, W1, As1 і G1) падчас росту ва ўмовах дадання нафталіну (Kang et al., 2006). Даследаванні паказалі, што даданне антыаксідантаў, такіх як аскарбінавая кіслата або двухвалентнае жалеза (Fe2+), можа павялічыць хуткасць росту нафталіну. Пры росце Rhodococcus erythropolis у нафталінавым асяроддзі транскрыпцыя генаў цытахрому P450, звязаных з акісляльным стрэсам, у тым ліку sodA (супераксіддысмутаза Fe/Mn), sodC (супераксіддысмутаза Cu/Zn) і recA, павялічвалася (Sazykin et al., 2019). Параўнальны колькасны пратэомны аналіз клетак Pseudomonas, культываваных у нафталіне, паказаў, што павышэнне рэгуляцыі розных бялкоў, звязаных з рэакцыяй на акісляльны стрэс, з'яўляецца стратэгіяй барацьбы са стрэсам (Herbst et al., 2013).
Паведамлялася, што мікраарганізмы выпрацоўваюць біяпавярхоўна-актыўныя рэчывы пад уздзеяннем гідрафобных крыніц вугляроду. Гэтыя павярхоўна-актыўныя рэчывы — амфіфільныя павярхоўна-актыўныя злучэнні, якія могуць утвараць агрэгаты на мяжы падзелу алей-вада або паветра-вада. Гэта спрыяе псеўдарастваранню і палягчае адсорбцыю араматычных вуглевадародаў, што прыводзіць да эфектыўнай біядэградацыі (Rahman et al., 2002). Дзякуючы гэтым уласцівасцям біяпавярхоўна-актыўныя рэчывы шырока выкарыстоўваюцца ў розных галінах прамысловасці. Даданне хімічных павярхоўна-актыўных рэчываў або біяпавярхоўна-актыўных рэчываў да бактэрыяльных культур можа павысіць эфектыўнасць і хуткасць дэградацыі вуглевадародаў. Сярод біяпавярхоўна-актыўных рэчываў рамналіпіды, якія выпрацоўваюцца Pseudomonas aeruginosa, былі шырока вывучаны і ахарактарызаваны (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Акрамя таго, іншыя тыпы біяпавярхоўна-актыўных рэчываў ўключаюць ліпапептыды (муцыны з Pseudomonas fluorescens), эмульгатар 378 (з Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg and Ron, 1999), ліпіды дыцукрыду трэгалозы з Rhodococcus (Ramdahl, 1985), ліхенін з Bacillus (Saraswathy and Hallberg, 2002) і павярхоўна-актыўныя рэчывы з Bacillus subtilis (Siegmund and Wagner, 1991) і Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Было паказана, што гэтыя магутныя павярхоўна-актыўныя рэчывы зніжаюць павярхоўнае нацяжэнне з 72 дын/см да менш чым 30 дын/см, што дазваляе лепш паглынаць вуглевадароды. Паведамлялася, што Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia і іншыя віды бактэрый могуць выпрацоўваць розныя біяпавярхоўна-актыўныя рэчывы на аснове рамналіпідаў і глікаліпідаў пры вырошчванні ў нафталінавым і метылнафталінавым асяроддзі (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 можа выпрацоўваць пазаклеткавы біяпавярхоўна-актыўны рэчыва Biosur-Pm пры вырошчванні на араматычных злучэннях, такіх як нафтавая кіслата (Phale et al., 1995). Кінетыка ўтварэння Biosur-Pm паказала, што яго сінтэз з'яўляецца працэсам, які залежыць ад росту і pH. Было выяўлена, што колькасць Biosur-Pm, якая выпрацоўваецца клеткамі пры нейтральным pH, была вышэйшай, чым пры pH 8,5. Клеткі, вырашчаныя пры pH 8,5, былі больш гідрафобнымі і мелі больш высокую афіннасць да араматычных і аліфатычных злучэнняў, чым клеткі, вырашчаныя пры pH 7,0. У Rhodococcus spp. N6, больш высокае суадносіны вугляроду да азоту (C:N) і абмежаванне жалеза з'яўляюцца аптымальнымі ўмовамі для вытворчасці пазаклеткавых біясурафтаксантаў (Mutalik et al., 2008). Былі зроблены спробы палепшыць біясінтэз біясураксантаў (павярхоўна-актыўных рэчываў) шляхам аптымізацыі штамаў і ферментацыі. Аднак тытр павярхоўна-актыўнага рэчыва ў культуральным асяроддзі нізкі (1,0 г/л), што стварае праблемы для маштабнай вытворчасці (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Таму для паляпшэння яго біясінтэзу выкарыстоўваліся метады геннай інжынерыі. Аднак яго інжынерная мадыфікацыя з'яўляецца складанай з-за вялікага памеру оперона (∼25 кб) і складанай біясінтэтычнай рэгуляцыі сістэмы кворум-сенсінгу (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). У бактэрыях Bacillus быў праведзены шэраг генна-інжынерных мадыфікацый, галоўным чынам накіраваных на павелічэнне выпрацоўкі сурфакціну шляхам замены прамотара (аперона srfA), празмернай экспрэсіі бялку экспарту сурфакціну YerP і рэгуляторных фактараў ComX і PhrC (Jiao et al., 2017). Аднак гэтыя метады генна-інжынерыі дасягнулі толькі адной або некалькіх генетычных мадыфікацый і пакуль не дасягнулі камерцыйнай вытворчасці. Таму неабходныя далейшыя даследаванні метадаў аптымізацыі, заснаваных на ведах.
Даследаванні біядэградацыі ПАВ у асноўным праводзяцца ў стандартных лабараторных умовах. Аднак на забруджаных участках або ў забруджаным асяроддзі было паказана, што многія абіятычныя і біятычныя фактары (тэмпература, pH, кісларод, даступнасць пажыўных рэчываў, біялагічная даступнасць субстрата, іншыя ксенабіётыкі, інгібіраванне канчатковых прадуктаў і г.д.) змяняюць і ўплываюць на дэградацыйную здольнасць мікраарганізмаў.
Тэмпература аказвае значны ўплыў на біядэградацыю ПАВ. Па меры павышэння тэмпературы канцэнтрацыя растворанага кіслароду памяншаецца, што ўплывае на метабалізм аэробных мікраарганізмаў, паколькі ім патрабуецца малекулярны кісларод у якасці аднаго з субстратаў для аксігеназ, якія ажыццяўляюць рэакцыі гідраксілявання або разрыву кольца. Часта адзначаецца, што падвышаная тэмпература пераўтварае зыходныя ПАВ у больш таксічныя злучэнні, тым самым інгібіруючы біядэградацыю (Muller et al., 1998).
Было адзначана, што многія ўчасткі, забруджаныя ПАВ, маюць экстрэмальныя значэнні pH, такія як участкі, забруджаныя кіслымі шахтнымі дрэнажамі (pH 1–4), і ўчасткі газіфікацыі прыроднага газу/вугалю, забруджаныя шчолачным фільтратам (pH 8–12). Гэтыя ўмовы могуць сур'ёзна паўплываць на працэс біядэградацыі. Таму перад выкарыстаннем мікраарганізмаў для біярэмедыяцыі рэкамендуецца адрэгуляваць pH, дадаўшы адпаведныя хімічныя рэчывы (з умераным або вельмі нізкім акісляльна-аднаўленчым патэнцыялам), такія як сульфат амонію або аміячная салетра для шчолачных глеб або вапнаванне карбанатам кальцыю або карбанатам магнію для кіслых участкаў (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
Паступленне кіслароду ў пацярпелую зону з'яўляецца фактарам, які абмяжоўвае хуткасць біядэградацыі ПАВ. З-за акісляльна-аднаўленчых умоў навакольнага асяроддзя працэсы біярэмедыяцыі in situ звычайна патрабуюць падачы кіслароду з знешніх крыніц (апрацоўка глебы, прамыванне паветрам і даданне хімічных рэчываў) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) паказалі, што даданне пераксіду магнію (злучэння, якое вызваляе кісларод) у забруджаны ваданосны пласт можа эфектыўна біярэмедыяваць злучэнні BTEX. У іншым даследаванні вывучалася дэградацыя фенолу і BTEX in situ у забруджаным ваданосным пласты шляхам увядзення нітрату натрыю і будаўніцтва здабыўных свідравін для дасягнення эфектыўнай біярэмедыяцыі (Bewley and Webb, 2001).