Цяперашні *Бягучы адрас: Кёльн 50931, Германія, Кёльнскі кластар дасканаласці, даследаванні клеткавай рэакцыі на стрэс пры захворваннях, звязаных са старэннем (CECAD).
Нейрадэгенерацыя мітахондрыяльных захворванняў лічыцца незваротнай, паколькі метабалічная пластычнасць нейронаў абмежаваная, але ўплыў мітахондрыяльнай дысфункцыі на аўтаномію клетак нейрональнага метабалізму ў арганізме дрэнна вывучаны. Тут мы прадстаўляем клеткава-спецыфічны пратэом нейронаў Пуркінье з прагрэсавальным дэфіцытам OXPHOS, выкліканым парушэннем дынамікі мітахондрыяльнага зліцця. Мы выявілі, што мітахондрыяльная дысфункцыя выклікала глыбокія змены ў галіне пратэомікі, што ў канчатковым выніку прывяло да паслядоўнай актывацыі дакладных метабалічных праграм перад гібеллю клетак. Нечакана мы вызначылі відавочную індукцыю піруваткарбаксілазы (PCx) і іншых ферментаў супраць старэння, якія дапаўняюць прамежкавыя прадукты цыклу TCA. Інгібіраванне PCx пагоршыла акісляльны стрэс і нейрадэгенерацыю, што сведчыць аб тым, што атэрасклероз мае ахоўны эфект у нейронах, у якіх адсутнічае OXPHOS. Аднаўленне мітахондрыяльнага зліцця ў тэрмінальна дэгенераваных нейронах цалкам змяняе гэтыя метабалічныя характарыстыкі, тым самым прадухіляючы гібель клетак. Нашы вынікі ідэнтыфікуюць раней невядомыя шляхі, якія надаюць устойлівасць мітахондрыяльнай дысфункцыі, і паказваюць, што нейрадэгенерацыю можна адмяніць нават на позніх стадыях захворвання.
Цэнтральная роля мітахондрый у падтрыманні нейрональнага энергетычнага метабалізму падкрэсліваецца шырокімі неўралагічнымі сімптомамі, звязанымі з мітахондрыяльнымі захворваннямі чалавека. Большасць гэтых захворванняў выклікаюцца геннымі мутацыямі, якія рэгулююць экспрэсію мітахондрыяльных генаў (1, 2) або разбурэннем генаў, звязаным з дынамікай мітахондрый, што ўскосна ўплывае на стабільнасць мітахондрыяльнай ДНК (мтДНК) (3, 4). Даследаванні на жывёльных мадэлях паказалі, што ў адказ на мітахондрыяльную дысфункцыю ў навакольных тканінах могуць актывавацца кансерватыўныя метабалічныя шляхі (5-7), што дае важную інфармацыю для глыбокага разумення патагенезу гэтых складаных захворванняў. Наадварот, наша разуменне метабалічных змен пэўных тыпаў клетак, выкліканых агульнай недастатковасцю выпрацоўкі мітахондрыяльнага аденозинтрифасфату (АТФ) мозгам, з'яўляецца фундаментальным (8), што падкрэслівае неабходнасць вызначэння тэрапеўтычных мішэняў, якія можна выкарыстоўваць для прафілактыкі або прадухілення захворванняў. Прадухіленне нейрадэгенерацыі (9). Недахоп інфармацыі заключаецца ў тым, што нервовыя клеткі шырока лічацца вельмі абмежаванымі метабалічнымі гнуткасцямі ў параўнанні з тыпамі клетак навакольных тканін (10). Улічваючы, што гэтыя клеткі адыгрываюць цэнтральную ролю ў каардынацыі пастаўкі метабалітаў да нейронаў для садзейнічання сінаптычнай перадачы і рэагавання на пашкоджанні і захворванні, здольнасць адаптаваць клеткавы метабалізм да складаных умоў мазгавой тканіны практычна абмежаваная гліяльнымі клеткамі (11-14). Акрамя таго, уласцівая клеткавая гетэрагеннасць мазгавой тканіны ў значнай ступені перашкаджае вывучэнню метабалічных змен, якія адбываюцца ў пэўных нейрональных падгрупах. У выніку мала што вядома пра дакладныя клеткавыя і метабалічныя наступствы мітахондрыяльнай дысфункцыі ў нейронах.
Каб зразумець метабалічныя наступствы мітахондрыяльнай дысфункцыі, мы вылучылі нейроны Пуркінье (ПН) на розных стадыях нейрадэгенерацыі, выкліканай разбурэннем знешняй мембраны мітахондрыялаў (Mfn2). Нягледзячы на ​​тое, што мутацыі Mfn2 у людзей звязаны з формай спадчыннай маторна-сенсорнай неўрапатыяй, вядомай як сіндром Шарко-Мары-Тута тыпу 2А (15), умоўнае разбурэнне Mfn2 у мышэй з'яўляецца добра вядомым метадам індукцыі акісляльна-фасфарыляцыйнай дысфункцыі (OXPHOS). Розныя нейрональныя падтыпы (16-19) і выніковы нейрадэгенератыўны фенатып суправаджаюцца прагрэсавальнымі неўралагічнымі сімптомамі, такімі як рухальныя парушэнні (18, 19) або мазжачкавая атаксія (16). Выкарыстоўваючы камбінацыю колькаснай (LFQ) пратэомікі без метак, метабаломікі, візуалізацыі і вірусалагічных метадаў, мы паказваем, што прагрэсавальная нейрадэгенерацыя моцна індукуе піруваткарбаксілазу (PCx) і іншыя фактары, якія ўдзельнічаюць у атэрасклерозе ПН in vivo. Экспрэсія ферментаў. Каб праверыць актуальнасць гэтай высновы, мы спецыяльна знізілі экспрэсію PCx у парастках з дэфіцытам Mfn2 і выявілі, што гэтая аперацыя пагаршае акісляльны стрэс і паскарае нейрадэгенерацыю, тым самым даказваючы, што азааспермія прыводзіць да гібелі клетак і метабалічнай адаптацыі. Высокая экспрэсія MFN2 можа цалкам выратаваць парасткі з тэрмінальнай дэгенерацыяй, выкліканыя цяжкім дэфіцытам OXPHOS, масіўным спажываннем мітахандрыяльнай ДНК і, відавочна, парушанай мітахондрыяльнай сеткай, што яшчэ раз падкрэслівае, што гэтая форма нейрадэгенерацыі можа аднаўляцца нават на запушчанай стадыі захворвання да гібелі клетак.
Каб візуалізаваць мітахондрыі ў PN з накаўтам Mfn2, мы выкарысталі штам мышэй, які дазваляе Cre-залежным мітахондрыям нацэльвацца на экспрэсію Cre - жоўтага флуарэсцэнтнага бялку (YFP) (mtYFP) (20), і праверылі марфалогію мітахондрый in vivo. Мы выявілі, што разбурэнне гена Mfn2 у PN прывядзе да паступовага дзялення мітахондрыяльнай сеткі (малюнак S1A), і найбольш раннія змены былі выяўлены ва ўзросце 3 тыдняў. Наадварот, істотная дэгенерацыя клетачнага пласта PN, пра што сведчыць страта імунафарбавання кальбіндзінам, пачалася толькі ва ўзросце 12 тыдняў (малюнак 1, A і B). Неадпаведнасць часу паміж найбольш раннімі зменамі ў марфалогіі мітахондрый і бачным пачаткам гібелі нейронаў падштурхнула нас даследаваць метабалічныя змены, выкліканыя дысфункцыяй мітахондрый перад гібеллю клетак. Мы распрацавалі стратэгію на аснове сартавання клетак, актываваных флуарэсцэнцыяй (FACS), для вылучэння PN, якія экспрэсуюць YFP (YFP+) (малюнак 1C), і ў кантрольных мышэй (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: :L7-cre), далей пазначаную як CTRL (малюнак S1B). Аптымізацыя стратэгіі гейтынгу на аснове адноснай інтэнсіўнасці сігналу YFP дазваляе нам ачысціць цела YFP+ (YFPhigh) PN ад не-PN (YFPneg) (малюнак S1B) або меркаваных флуарэсцэнтных аксонавых/дэндрытных фрагментаў (YFPlow; малюнак S1D, злева), што пацверджана канфакальнай мікраскопіяй (малюнак S1D, справа). Каб праверыць ідэнтычнасць класіфікаванай папуляцыі, мы правялі LFQ-пратэёміку, а затым аналіз галоўных кампанент і выявілі, што існуе выразнае аддзяленне паміж клеткамі YFPhigh і YFPneg (малюнак S1C). Клеткі YFPhigh прадэманстравалі чыстае ўзбагачэнне вядомымі маркерамі PN (г.зн. Calb1, Pcp2, Grid2 і Itpr3) (21, 22), але не ўзбагачэнне бялкамі, якія звычайна экспрэсуюцца ў нейронах або іншых тыпах клетак (малюнак 1D). Параўнанне паміж узорамі ў класіфікаваных клетках YFPhigh, сабраных у незалежных эксперыментах, паказала каэфіцыент карэляцыі > 0,9, што дэманструе добрую ўзнаўляльнасць паміж біялагічнымі паўторамі (малюнак S1E). Такім чынам, гэтыя дадзеныя пацвердзілі наш план вострай і спецыфічнай ізаляцыі магчымых PN. Паколькі выкарыстоўваная сістэма драйвераў L7-cre індукуе мазаічную рэкамбінацыю ў першы тыдзень пасля родаў (23), мы пачалі выбракоўваць мышэй з CTRL і ўмоўна (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) збіраць нейроны. Пасля завяршэння рэкамбінацыі гэта называецца Mfn2cKO ва ўзросце 4 тыдняў. У якасці канчатковага пункта мы абралі 8-тыднёвы ўзрост, калі пласт PN быў цэлым, нягледзячы на ​​відавочную фрагментацыю мітахондрый (малюнак 1B і малюнак S1A). Усяго мы колькасна вызначылі 3013 бялкоў, з якіх каля 22% былі заснаваны на анатацыях MitoCarta 2.0 на аснове мітахондрыяльнага пратэома як мітахондрыі (малюнак 1E) (малюнак 1E) (24). Аналіз дыферэнцыяльнай экспрэсіі генаў, праведзены на 8-м тыдні, паказаў, што толькі 10,5% усіх бялкоў мелі значныя змены (малюнак 1F і малюнак S1F), з якіх 195 бялкоў былі рэгуляваны паніжана, а 120 бялкоў — павышана (малюнак 1F). Варта адзначыць, што «аналіз інавацыйных шляхоў» гэтага набору дадзеных паказвае, што дыферэнцыяльна экспрэсаваныя гены ў асноўным належаць да абмежаванага набору спецыфічных метабалічных шляхоў (малюнак 1G). Цікава, што, хоць паніжэнне рэгуляцыі шляхоў, звязаных з OXPHOS і кальцыевай сігналізацыяй, пацвярджае індукцыю мітахондрыяльнай дысфункцыі ў мітахондрыяльных PN з дэфіцытам зліцця, іншыя катэгорыі, якія ў асноўным звязаны з метабалізмам амінакіслот, значна павышаюцца, што адпавядае метабалізму, які адбываецца ў мітахондрыяльных PN. Перамантаж з'яўляецца паслядоўным.
(A) Тыповыя канфакальныя фатаграфіі зрэзаў мазжачка мышэй CTRL і Mfn2cKO, якія дэманструюць прагрэсіўную страту PN (кальбіндзін, шэры); ядры былі кантрастна афарбаваны DAPI. (B) Колькасная ацэнка (A) (аднабаковы дысперсійны аналіз, ***P<0,001; n = ад 4 да 6 кружочкаў ад трох мышэй). (C) Эксперыментальны працоўны працэс. (D) Размеркаванне цеплавой карты маркераў, спецыфічных для Пуркінье (уверсе) і іншых тыпаў клетак (пасярэдзіне). (E) Дыяграма Вена, якая паказвае колькасць мітахандрыяльных бялкоў, выяўленых у класіфікаванай PN. (F) Вулканічны графік дыферэнцыяльна экспрэсаваных бялкоў у нейронах Mfn2cKO праз 8 тыдняў (парогавае значэнне значнасці 1,3). (G) Аналіз шляхоў творчасці паказвае пяць найбольш важных шляхоў павышэння (чырвоны) і паніжэння (сіні) у PN Mfn2cKO, класіфікаванай як 8 тыдняў. Паказаны сярэдні ўзровень экспрэсіі кожнага выяўленага бялку. Цеплавая карта ў адценнях шэрага: скарэкціраванае значэнне P. ns, не важна.
Дадзеныя пратэомікі паказалі, што экспрэсія бялкоў комплексаў I, III і IV паступова зніжалася. Комплексы I, III і IV утрымлівалі неабходныя субадзінкі, закадаваныя мтДНК, у той час як комплекс II, які быў закадаваны толькі ядзерна, практычна не змяніўся (малюнак 2A і малюнак S2A). У адпаведнасці з вынікамі пратэомікі, імунагістахімія зрэзаў тканіны мазжачка паказала, што ўзровень субадзінак MTCO1 (субадзінка 1 мітахандрыяльнай цытахром-С-аксідазы) комплексу IV у PN паступова зніжаўся (малюнак 2B). Субадзінка Mtatp8, закадаваная мтДНК, была значна зніжана (малюнак S2A), у той час як стацыянарны ўзровень субадзінкі АТФ-сінтазы, закадаванай ядзерна, заставаўся нязменным, што адпавядае вядомаму стабільнаму комплексу падзборкі АТФ-сінтазы F1, калі экспрэсія мтДНК стабільная. Утварэнне паслядоўнае. Перапыненне (7). Ацэнка ўзроўню мтДНК у адсартаваных PN Mfn2cKO з дапамогай палімеразнай ланцуговай рэакцыі ў рэжыме рэальнага часу (qPCR) пацвердзіла паступовае зніжэнне колькасці копій мтДНК. У параўнанні з кантрольнай групай, ва ўзросце 8 тыдняў захавалася толькі каля 20% узроўню мтДНК (малюнак 2C). У адпаведнасці з гэтымі вынікамі, для выяўлення ДНК было выкарыстана канфакальная мікраскапія, якая паказвае залежнае ад часу спажыванне мітахондрыяльных нуклеатыдаў (малюнак 2D). Мы выявілі, што толькі некаторыя кандыдаты, якія ўдзельнічаюць у дэградацыі мітахондрыяльных бялкоў і рэакцыі на стрэс, былі рэгуляваны ўверх, у тым ліку Lonp1, Afg3l2 і Clpx, а таксама фактары зборкі комплексу OXPHOS. Істотных змен узроўняў бялкоў, якія ўдзельнічаюць у апаптозе, не выяўлена (малюнак S2B). Аналагічна, мы выявілі, што каналы мітахондрыя і эндаплазматычнага рэтыкулума, якія ўдзельнічаюць у транспарце кальцыя, маюць толькі нязначныя змены (малюнак S2C). Акрамя таго, ацэнка бялкоў, звязаных з аўтафагіяй, не выявіла істотных змен, што адпавядае бачнай індукцыі аўтафагасом, якая назіраецца in vivo з дапамогай імунагістахіміі і электроннай мікраскапіі (малюнак S3). Аднак прагрэсавальная дысфункцыя OXPHOS у PN суправаджаецца відавочнымі ультраструктурнымі зменамі мітахондрыял. Мітахандрыяльныя кластары можна ўбачыць у целах клетак і дендрытных дрэвах парасткаў Mfn2cKO ва ўзросце 5 і 8 тыдняў, а структура ўнутранай мембраны зведала значныя змены (малюнак S4, A і B). У адпаведнасці з гэтымі ультраструктурнымі зменамі і значным зніжэннем мтДНК, аналіз вострых зрэзаў мазжачка галаўнога мозгу з дапамогай метылавага эфіру тэтраметылрадаміна (TMRM) паказаў, што патэнцыял мітахандрыяльнай мембраны ў парастках Mfn2cKO быў значна зніжаны (малюнак S4C).
(A) Аналіз узроўню экспрэсіі комплексу OXPHOS з цягам часу. Разглядаюцца толькі бялкі з P<0,05 праз 8 тыдняў (двухфактарны ANOVA). Пункцірная лінія: Без карэкціроўкі ў параўнанні з CTRL. (B) Злева: Прыклад зрэзу мазжачка, пазначанага антыцеламі супраць MTCO1 (маштабная шкала, 20 мкм). Плошча, занятая целамі клетак Пуркінье, пакрыта жоўтым колерам. Справа: Колькасная ацэнка ўзроўняў MTCO1 (аднабаковы дысперсійны аналіз; n = ад 7 да 20 клетак, прааналізаваных ад трох мышэй). (C) ПЛР-аналіз колькасці копій мтДНК у адсартаванай PN (аднабаковы дысперсійны аналіз; n = ад 3 да 7 мышэй). (D) Злева: Прыклад зрэзу мазжачка, пазначанага антыцеламі супраць ДНК (маштабная шкала, 20 мкм). Плошча, занятая целамі клетак Пуркінье, пакрыта жоўтым колерам. Справа: Колькасная ацэнка паражэнняў мтДНК (аднабаковы дысперсійны аналіз; n = ад 5 да 9 клетак ад трох мышэй). (E) Прыклад вострага зрэзу мазжачка, які паказвае mitoYFP + клеткі Пуркінье (стрэлка) у запісе з выкарыстаннем цэльных клетак з выкарыстаннем патч-клэмп. (F) Колькасная ацэнка крывой IV. (G) Тыповыя запісы ін'екцыі дэпалярызацыйнага току ў клетках Пуркінье CTRL і Mfn2cKO. Верхняя рыса: першы імпульс, які выклікаў АП. Ніжняя рыса: максімальная частата АП. (H) Колькасная ацэнка постсінаптычных спантанных уваходаў (sPSP). Тыповая рыса запісу і яе каэфіцыент маштабавання паказаны ў (I). Аднабаковы дысперсійны аналіз прааналізаваў n = 5-20 клетак ад трох мышэй. Дадзеныя выражаны як сярэдняе ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Тыповыя сляды спантаннага АП, запісанага з выкарыстаннем рэжыму перфараванага патч-клэмп. Верхняя рыса: максімальная частата АП. Ніжняя рыса: маштабаванне адной АП. (K) Колькасна вызначце сярэднюю і максімальную частату АП у адпаведнасці з (J). Тэст Манна-Уітні; n = 5 клетак было прааналізавана ад чатырох мышэй. Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± SEM; гэта не важна.
Відавочныя пашкоджанні OXPHOS былі выяўлены ў 8-тыднёвых Mfn2cKO PN, што сведчыць аб сур'ёзных парушэннях фізіялагічнай функцыі нейронаў. Таму мы прааналізавалі пасіўныя электрычныя характарыстыкі нейронаў з дэфіцытам OXPHOS праз 4-5 тыдняў і 7-8 тыдняў, выканаўшы запісы з дапамогай патч-клэмп цэлых клетак у вострых зрэзах мазжачка (малюнак 2E). Нечакана сярэдні мембранны патэнцыял спакою і ўваходны супраціў нейронаў Mfn2cKO былі падобнымі да кантролю, хоць паміж клеткамі назіраліся нязначныя адрозненні (табліца 1). Аналагічна, ва ўзросце 4-5 тыдняў не было выяўлена істотных змен у залежнасці ад току і напружання (IV крывая) (малюнак 2F). Аднак ні адзін нейрон Mfn2cKO ва ўзросце 7-8 тыдняў не перажыў нутравенны рэжым (этап гіперпалярызацыі), што сведчыць аб наяўнасці відавочнай адчувальнасці да патэнцыялу гіперпалярызацыі на гэтай позняй стадыі. У адрозненне ад гэтага, у нейронах Mfn2cKO дэпалярызацыйныя токі, якія выклікаюць паўтаральныя разрады патэнцыялу дзеяння (ПД), добра пераносяцца, што сведчыць аб тым, што іх агульныя характары разрадаў істотна не адрозніваюцца ад такіх жа ў кантрольных нейронах 8-тыднёвага ўзросту (табліца 1 і малюнак 2G). Аналагічна, частата і амплітуда спантанных постсінаптычных токаў (СПТ) былі параўнальныя з кантрольнай групай, а частата падзей павялічылася з 4 тыдняў да 5 тыдняў, з 7 тыдняў да 8 тыдняў з падобным павелічэннем (малюнак 2, H і I). Перыяд сінаптычнага паспявання ў ПП (25). Падобныя вынікі былі атрыманы пасля перфараваных ПП-пластыраў. Такая канфігурацыя прадухіляе магчымую кампенсацыю дэфектаў клеткавага АТФ, як гэта можа адбыцца пры запісе з дапамогай кламп-запісу цэлых клетак. У прыватнасці, патэнцыял мембраны спакою і частата спантаннага ўздзеяння нейронаў Mfn2cKO не пацярпелі (малюнак 2, J і K). Карацей кажучы, гэтыя вынікі паказваюць, што PN з відавочнай дысфункцыяй OXPHOS могуць добра спраўляцца з высокачастотнымі разраднымі мадэлямі, што сведчыць аб наяўнасці кампенсацыйнага механізму, які дазваляе ім падтрымліваць электрафізіялагічныя рэакцыі, блізкія да нармальных.
Дадзеныя прадстаўлены як сярэдняе значэнне ± SEM (аднабаковы дысперсійны аналіз, тэст множных параўнанняў Холма-Сідака; *P<0,05). Нумар адзінкі пазначаны ў дужках.
Мы паставілі сабе за мэту даследаваць, ці ўключае якая-небудзь катэгорыя ў наборы дадзеных пратэомікі (малюнак 1G) шляхі, якія могуць супрацьстаяць цяжкаму дэфіцыту OXPHOS, тым самым тлумачачы, чаму пашкоджаная PN можа падтрымліваць амаль нармальную электрафізіялогію (малюнак 2, ад E да K). Пратэомны аналіз паказаў, што ферменты, якія ўдзельнічаюць у катабалізме амінакіслот з разгалінаваным ланцугом (BCAA), былі значна павялічаны (малюнак 3A і малюнак S5A), і канчатковы прадукт ацэтыл-CoA (CoA) або сукцыніл-CoA могуць дапаўняць трыкарбаксілаты ў цыкле артэрыясклератычнай кіслаты (TCA). Мы выявілі, што ўтрыманне трансаміназы 1 (BCAT1) і BCAT2 BCAA павялічылася. Яны каталізуюць першы этап катабалізму BCAA шляхам генерацыі глутамату з α-кетаглутарату (26). Усе субадзінкі, якія складаюць комплекс кетакіслот-дэгідрагеназы з разгалінаваным ланцугом (BCKD), рэгулююцца ўверх (комплекс каталізуе наступнае і незваротнае дэкарбаксіляванне атрыманага вугляроднага шкілета BCAA) (малюнак 3A і малюнак S5A). Аднак відавочных змен у самой BCAA ў адсартаваных PN не было выяўлена, што можа быць звязана з павелічэннем паглынання клеткамі гэтых незаменных амінакіслот або выкарыстаннем іншых крыніц (глюкозы або малочнай кіслаты) для дапаўнення цыклу TCA (малюнак S5B). PN, якія не ўтрымлівалі OXPHOS, таксама прадэманстравалі павышаную актыўнасць раскладання і трансамінавання глутаміна ва ўзросце 8 тыдняў, што можа адлюстравацца ў павышэнні рэгуляцыі мітахандрыяльных ферментаў глутаміназы (GLS) і глутамінпіруваттрансаміназы 2 (GPT2) (малюнак 3, A і C). Варта адзначыць, што павышэнне рэгуляцыі GLS абмяжоўваецца сплайсаванай ізаформай глутаміназы C (GLS-GAC) (змена Mfn2cKO/CTRL прыблізна ў 4,5 раза, P = 0,05), і яе спецыфічная павышэнне рэгуляцыі ў ракавых тканінах можа падтрымліваць мітахандрыяльную біяэнергію. (27)
(A) Цеплавая карта паказвае кратнае змяненне ўзроўню бялку для пазначанага шляху праз 8 тыдняў. (B) Прыклад зрэзу мазжачка, пазначанага антыцеламі супраць PCx (маштабная паласа, 20 мкм). Жоўтая стрэлка паказвае на цела клетак Пуркінье. (C) Аналіз экспрэсіі бялку з часам, ідэнтыфікаваны як важны кандыдат для атэрасклерозу (множны t-крытэрый, *FDR <5%; n = 3-5 мышэй). (D) Вышэй: Схематычная дыяграма, якая паказвае розныя спосабы паступлення пазначанага вугляроду, які змяшчаецца ў трэйсеры [1-13C]пірувату (г.зн. праз PDH або трансартэрыяльны шлях). Унізе: Дыяграма скрыпкі паказвае працэнт аднаразовага пазначанага вугляроду (M1), пераўтворанага ў аспарагіновую кіслату, цытрынавую кіслату і яблычную кіслату пасля пазначэння вострых зрэзаў мазжачка [1-13C]піруватам (парны t-крытэрый; ** P <0,01). (E) Комплексны аналіз часовай гісторыі пазначанага шляху. Разглядайце толькі бялкі з P <0,05 праз 8 тыдняў. Пункцірная лінія: няма карэкціровачнага значэння (двухфактарны дысперсійны аналіз; * P <0,05; *** P <0,001). Дадзеныя прадстаўлены як сярэдняе значэнне ± SEM.
У нашым аналізе катабалізм BCAA стаў адным з ключавых шляхоў павышэння рэгуляцыі. Гэты факт пераканаўча сведчыць аб тым, што аб'ём вентыляцыі, які ўваходзіць у цыкл TCA, можа змяняцца пры парэнтэрыях з дэфіцытам OXPHOS. Гэта можа прадстаўляць сабой асноўную форму нейрональнай метабалічнай перабудовы, якая можа аказваць непасрэдны ўплыў на нейрональную фізіялогію і выжывальнасць падчас падтрымання цяжкай дысфункцыі OXPHOS. У адпаведнасці з гэтай гіпотэзай мы выявілі, што асноўны антыатэрасклератычны фермент PCx рэгулюецца ўверх (Mfn2cKO/CTRL змяняецца прыблізна ў 1,5 разы; малюнак 3A), што каталізуе пераўтварэнне пірувату ў оксалаацэтат (28), які, як мяркуюць, знаходзіцца ў тканіны мозгу. Экспрэсія абмежавана астрацытамі (29, 30). У адпаведнасці з вынікамі пратэомікі, канфакальная мікраскапія паказала, што экспрэсія PCx была спецыфічна і значна павялічана ў парэнтэрыях з дэфіцытам OXPHOS, у той час як рэактыўнасць PCx была ў асноўным абмежавана суседнімі гліяльнымі клеткамі Бергмана кантрольнай групы (малюнак 3B). Каб функцыянальна праверыць назіраную павышаную рэгуляцыю PCx, мы апрацавалі вострыя зрэзы мазжачка трэйсерам [1-13C]піруватам. Пры акісленні пірувату піруватадэгідрагеназай (PDH) яго ізатопная метка знікала, але ўключалася ў прамежкавыя прадукты цыклу TCA пры метаболізме пірувату праз сасудзістыя рэакцыі (малюнак 3D). У падтрымку нашых пратэомных дадзеных мы назіралі вялікую колькасць маркераў ад гэтага трэйсера ў аспарагінавай кіслаце зрэзаў Mfn2cKO, у той час як цытрынавая і яблычная кіслаты таксама мелі ўмераную тэндэнцыю, хоць і не значную (малюнак 3D).
У дофамінавых нейронах мышэй MitoPark з мітахондрыяльнай дысфункцыяй, выкліканай дофамінавымі нейронамі, якія спецыфічна разбураюць ген мітахондрыяльнага транскрыпцыйнага фактару А (Tfam) (малюнак S6B), экспрэсія PCx таксама была значна павялічана (31), што сведчыць аб тым, што ацэтонкіслы артэрыясклероз рэгулюецца падчас дысфункцыі нейрональнага OXPHOS у арганізме. Варта адзначыць, што было выяўлена, што ўнікальныя ферменты (32-34), якія могуць экспрэсавацца ў нейронах, якія могуць быць звязаны з артэрыясклерозам, значна павышаюцца ў PN, у якіх адсутнічае OXPHOS, такія як прапіёніл-КоА-карбаксілаза (PCC-A), маланіл-КоА пераўтварае прапіёніл-КоА ў сукцыніл-КоА, і мітахандрыяльны яблычны фермент 3 (ME3), асноўная роля якога заключаецца ў аднаўленні пірувату з малату (малюнак 3, А і С) (33, 35). Акрамя таго, мы выявілі значнае павелічэнне фермента Pdk3, які фасфарылюе і такім чынам інактывуе ПДГ (36), у той час як ніякіх змен у ферменте Pdp1, які актывуе ПДГ, або ў самім ферментным комплексе ПДГ не выяўлена (малюнак 3А). Адпаведна, у парастках Mern2cKO фасфараляванне субадзінкі α1 (PDHE1α) кампанента піруватдэгідрагеназы E1 комплексу ПДГ у Ser293 (вядома, што інгібіруе ферментатыўную актыўнасць ПДГ) было павялічана (малюнак S6C) (малюнак S6C). Піруват не мае доступу да сасудаў.
Нарэшце, мы выявілі, што супершлях біясінтэзу серыну і гліцыну, адпаведны мітахондрыяльны фалійны цыкл (1C) і біясінтэз праліну (малюнак 1G і малюнак S5C) значна павышаюцца, згодна з паведамленнямі, падчас працэсу актывацыі. Навакольныя тканіны актывуюцца пры мітахондрыяльнай дысфункцыі (5-7). Канфакальны аналіз, які пацвярджае гэтыя пратэомныя дадзеныя, паказаў, што пры PN з адсутнасцю OXPHOS зрэзы мазжачка 8-тыднёвых мышэй падвяргаліся ўздзеянню серынгідраксіметылтрансферазы 2 (SHMT2), ключавога фермента мітахондрыяльнага фалійнага цыклу. Значны імунны адказ (малюнак S5D). У 13 вострых зрэзах мазжачка, інкубаваных з CU-глюкозай, эксперыменты па метабалічным адсочванні дадаткова пацвердзілі павышэнне рэгуляцыі біясінтэзу серыну і праліну, што сведчыць аб павелічэнні патоку ізаформ вугляроду ў серын і пралін (малюнак S5E). Паколькі рэакцыі, якія стымулююцца GLS і GPT2, адказваюць за сінтэз глутамату з глутаміна і трансамінаванне паміж глутаматам і α-кетаглутаратам, іх павышэнне сведчыць аб тым, што нейроны з дэфіцытам OXPHOS маюць павышаную патрэбу ў глутамаце. Гэта можа быць накіравана на падтрыманне павышанага біясінтэзу праліну (малюнак S5C). У адрозненне ад гэтых змен, пратэомны аналіз мазжачковых астрацытаў мышэй Mfn2cKO, спецыфічных для PN, паказаў, што гэтыя шляхі (у тым ліку ўсе антыпераксідазы) істотна не змяніліся ў экспрэсіі, што дэманструе, што гэта метабалічнае перанакіраванне з'яўляецца селектыўным да дэградаванага PN (мал. S6, ад D да G).
Карацей кажучы, гэтыя аналізы выявілі істотна розныя заканамернасці часовай актывацыі спецыфічных метабалічных шляхоў пры PN. Нягледзячы на ​​тое, што парушэнне функцыі нейрональных мітахондрыялаў можа прывесці да ранняга атэрасклерозу і рэмадэлявання 1C (малюнак 3E і малюнак S5C), і нават да прадказальных змен у экспрэсіі I і IV комплексаў, змены ў сінтэзе серыну de novo выяўляюцца толькі на позніх стадыях. Дысфункцыя OXPHOS (малюнак 3E і малюнак S5C). Гэтыя вынікі вызначаюць паслядоўны працэс, у якім выкліканыя стрэсам мітахондрыяльныя (цыкл 1C) і цытаплазматычныя (біясінтэз серыну) шляхі рэагуюць сінергічна з павелічэннем атэрасклерозу ў цыкле TCA, змяняючы нейрональны метабалізм.
8-тыднёвыя OXPHOS-дэфіцытныя PN могуць падтрымліваць высокачастотную ўзбуджальную актыўнасць і падвяргацца значнаму метабалічнаму перападключэнню, каб кампенсаваць мітахондрыяльную дысфункцыю. Гэта адкрыццё падымае цікавую магчымасць таго, што нават у гэты момант гэтыя клеткі могуць таксама атрымліваць тэрапеўтычнае ўмяшанне для затрымкі або прадухілення нейрадэгенерацыі. Позняе. Мы вырашылі гэтую магчымасць з дапамогай двух незалежных умяшанняў. У першым метадзе мы распрацавалі вектар Cre-залежнага аденоасацыяванага віруса (AAV), каб MFN2 мог селектыўна экспрэсавацца ў OXPHOS-дэфіцытных PN in vivo (малюнак S7A). AAV, які кадуе MFN2, і флуарэсцэнтны рэпарцёрны ген mCherry (Mfn2-AAV) былі правераны ў першасных нейронных культурах in vitro, што прывяло да экспрэсіі MFN2 Cre-залежным чынам і выратавала марфалогію мітахондрыял, тым самым прадухіляючы нейрамутацыі ў нейронах Mfn2cKO (малюнкі S7, B, D і E). Далей мы правялі эксперыменты in vivo па стэрэатаксічнай дастаўцы 8-тыднёвых Mfn2-AAV у кару мазжачка мышэй Mfn2cKO і кантрольных мышэй, а таксама прааналізавалі 12-тыднёвых мышэй (малюнак 4A). Мышы Mfn2cKO, якія атрымлівалі лячэнне, памерлі (малюнак 1, A і B) (16). Вірусная трансдукцыя in vivo прывяла да селектыўнай экспрэсіі PN у некаторых колах мазжачка (малюнак S7, G і H). Ін'екцыя кантрольнага AAV, які экспрэсуе толькі mCherry (Ctrl-AAV), не аказала істотнага ўплыву на ступень нейрадэгенерацыі ў жывёл Mfn2cKO. Наадварот, аналіз Mfn2cKO, трансдуцыраваных з дапамогай Mfn2-AAV, паказаў значны ахоўны эфект пласта клетак PN (малюнак 4, B і C). У прыватнасці, шчыльнасць нейронаў, здаецца, амаль не адрозніваецца ад кантрольных жывёл (малюнак 4, B і C, а таксама малюнак S7, H і I). Экспрэсія MFN1, але не MFN2, аднолькава эфектыўная ў прадухіленні гібелі нейронаў (малюнак 4C і малюнак S7, C і F), ​​што сведчыць аб тым, што экспрэсія эктапічнага MFN1 можа эфектыўна кампенсаваць недахоп MFN2. Далейшы аналіз на ўзроўні адзінкавай палавой сеткі (ПН) паказаў, што Mfn2-AAV у значнай ступені аднавіў ультраструктуру мітахондрый, нармалізаваў узровень мтДНК і змяніў высокую экспрэсію антыангіягеннага маркера PCx ​​(малюнак 4, C-E). Візуальны агляд выратаваных мышэй Mfn2cKO ў стане спакою паказаў, што іх пастава і рухальныя сімптомы (рух S1-S3) палепшыліся. У заключэнне, гэтыя эксперыменты паказваюць, што адкладзенае паўторнае ўвядзенне MFN2 у ПН з сур'ёзным дэфіцытам OXPHOS дастаткова для змянення спажывання мтДНК і індукцыі атэрасклерозу, тым самым прадухіляючы дэгенерацыю аксонаў і гібель нейронаў in vivo.
(A) Схема, якая паказвае эксперыментальны графік ін'екцыі AAV, які кадуе MFN2, калі пазначаны метабалічны шлях актываваны. (B) Тыповыя канфакальныя выявы 12-тыднёвых зрэзаў мазжачка, трансдуцыраваных праз 8 тыдняў у мышэй Mfn2cKO і пазначаных антыцеламі супраць кальбіндзіну. Справа: маштабаванне валокнаў аксонаў. Маштаб павелічэння аксонаў складае 450 і 75 мкм. (C) Злева: колькасная ацэнка шчыльнасці клетак Пуркінье ў трансдукцыйнай пятлі AAV (AAV+) (аднабаковы дысперсійны аналіз; n = 3 мышы). Справа: аналіз фокусу мтДНК у трансдуцыраваных PN на 12-м тыдні (няпарны t-крытэрый; n = 6 клетак ад трох мышэй). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Тыповыя прасвечвальныя электронныя мікрафотаздымкі PN зрэзаў мазжачка Mfn2cKO, трансдуцыраваных пазначанымі віруснымі вектарамі. Ружовая маска паказвае плошчу, занятую дендрытамі, а жоўты пункцірны квадрат — павелічэнне справа; n абазначае ядро. Маштабная лінейка — 1 мкм. (E) паказвае прыклад афарбоўвання PCx у PN, трансдуцыраванай праз 12 тыдняў. Маштабная лінейка — 20 мкм. OE — звышэкспрэсія; FC — кратнае змяненне.
Нарэшце, мы даследавалі важнасць выжывання клетак, выкліканага пераксідазай, у PN, якія перажылі дысфункцыю OXPHOS. Мы стварылі mCherry, які кадуе AAV-shRNA (кароткую шпількавую РНК), спецыфічна накіраваную на мРНК мышынага PCx (AAV-shPCx), і ўвялі вірус або яго скрэмбляваны кантроль (AAV-scr) у мазжачок мышэй Mfn2cKO. Ін'екцыя была праведзена на чацвёртым тыдні жыцця (малюнак 5A), каб дасягнуць эфектыўнага зніжэння PCx у перыяд, калі экспрэсія PCx павялічвалася (малюнак 3C), а пласт клетак PN быў усё яшчэ цэлы (малюнак 1A). Варта адзначыць, што зніжэнне PCx (малюнак S8A) прыводзіць да значнага паскарэння гібелі PN, якая абмяжоўваецца інфікаваным кольцам (малюнак 5, B і C). Каб зразумець механізм метабалічных эфектаў, выкліканых павышэннем рэгуляцыі PCx, мы вывучылі акісляльна-аднаўленчы статус нейронаў пасля адначасовай экспрэсіі PCx і адначасовай экспрэсіі аптычнага біясенсара Grx1-roGFP2, апасродкаванага AAV (малюнак S8, B-D), каб ацаніць адноснае змяненне акісляльна-аднаўленчага патэнцыялу пептыдаў (38). Затым мы правялі двухфатонную флуарэсцэнтную пажыццёвую візуалізацыйную мікраскапію (FLIM) у вострых зрэзах мозгу 7-тыднёвых Mfn2cKO або кантрольных аднапамётнікаў, каб выявіць патэнцыйныя змены ў цытаплазматычным акісляльна-аднаўленчым статусе пасля праверкі ўмоў FLIM (малюнак S8, E-G). Аналіз паказаў значнае павелічэнне акісляльнага стану асобных нейронаў Mfn2cKO без экспрэсіі PCx, што адрозніваецца ад кантрольных нейронаў або нейронаў Mfn2cKO, якія экспрэсуюць толькі змяшаную shRNA (малюнак 5, D і E). Калі экспрэсія PCx была паніжана, працэнт PN Mfn2cKO, якія праяўлялі высока акіслены стан, павялічыўся больш чым у тры разы (малюнак 5E), што сведчыць аб тым, што павышэнне рэгуляцыі PCx падтрымлівала акісляльна-аднаўленчую здольнасць дэгенераваных нейронаў.
(A) Схема, якая паказвае эксперыментальны графік ін'екцыі AAV, які кадуе shPCx, калі актываваны пазначаны метабалічны шлях. (B) Тыповыя канфакальныя фатаграфіі 8-тыднёвых зрэзаў мазжачка ў мышэй Mfn2cKO, трансдуцыраваных і пазначаных антыцеламі супраць кальцынеўрыну праз 4 тыдні. Маштабная лінейка, 450 мкм. (C) Колькасная ацэнка шчыльнасці клетак Пуркінье ў AAV-трансдуцыраваных петлях (аднабаковы дысперсійны аналіз; n = ад 3 да 4 мышэй). Дадзеныя прадстаўлены як сярэдняе значэнне ± SEM; ***P <0,001. (D) Тыповыя выявы FLIM паказваюць сярэднюю працягласць жыцця 7-тыднёвых PN, якія экспрэсуюць глутатыён-акісляльна-аднаўленчы сенсар Grx1-roGFP2, у зададзеных эксперыментальных умовах. Суадносіны LUT (табліца пошуку): інтэрвал часу выжывання (у пікасекундах). Маштабная лінейка, 25 мкм. (E) Гістаграма паказвае размеркаванне значэнняў працягласці жыцця Grx1-roGFP2 з (D) (n=ад 158 да 368 клетак у дзвюх мышэй пры кожнай умове). Кругавая дыяграма над кожнай гістаграмай: паказвае колькасць клетак са значна большымі (чырвоны, акіслены) або карацейшымі (сіні, скарочаны) значэннямі працягласці жыцця, якія перавышаюць 1 стандартнае адхіленне ад сярэдняга значэння працягласці жыцця ў CTRL-AAV-scr. (F) Прапанаваная мадэль паказвае ахоўны эфект павышэння рэгуляцыі нейрональных PCx.
У цэлым, прадстаўленыя намі тут дадзеныя паказваюць, што рээкспрэсія MFN2 можа цалкам выратаваць запушчаную PN з цяжкім дэфіцытам OXPHOS, цяжкім знясіленнем мтДНК і надзвычай анамальнай ista-падобнай марфалогіяй, тым самым забяспечваючы бесперапынны прагрэс нават пры запушчаных захворваннях. Нейрадэгенерацыя з'яўляецца зварачальным доказам стадыі перад гібеллю клетак. Гэтая ступень метабалічнай гнуткасці яшчэ больш падкрэсліваецца здольнасцю нейронаў выклікаць атэрасклероз (перабудова цыклу TCA), які інгібіруе экспрэсію PCx у PN, у якіх адсутнічае OXPHOS, і ўзмацняе гібель клетак, тым самым гуляючы ахоўную ролю (Малюнак 5F).
У гэтым даследаванні мы прадставілі доказы таго, што рэакцыяй нейронаў нервовай сістэмы (ПН) на дысфункцыю OXPHOS з'яўляецца паступовае збліжэнне з атэрасклерозам цыклу TCA праз дыферэнцыяльны шлях актывацыі, які актывуецца метабалічнымі праграмамі. Мы пацвердзілі пратэомны аналіз многімі дадатковымі метадамі і выявілі, што пры ўздзеянні цяжкай мітахондрыяльнай дысфункцыі нейроны маюць раней невядомую форму метабалічнай эластычнасці. Да нашага здзіўлення, увесь працэс перабудовы не абавязкова азначае тэрмінальны метабалічны стан, які паступова і незваротна суправаджае нейрадэгенерацыю, але нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што ён можа ўяўляць сабой падтрымліваючы нейрон нават на стадыі да гібелі клетак. Механізм функцыянальнай кампенсацыі. Гэта адкрыццё сведчыць аб тым, што нейроны маюць значную ступень метабалічнай пластычнасці ў арганізме. Гэты факт даказвае, што пазнейшае паўторнае ўвядзенне MFN2 можа змяніць экспрэсію ключавых метабалічных маркераў і прадухіліць дэгенерацыю ПН. Наадварот, ён інгібіруе атэрасклероз і паскарае нервы. транссексуал.
Адно з найбольш цікавых адкрыццяў нашага даследавання заключаецца ў тым, што PN, у якіх адсутнічае OXPHOS, можа змяняць метабалізм цыклу TCA шляхам павышэння ўзроўню ферментаў, якія спецыфічна стымулююць артэрыясклероз. Метабалічная перабудова з'яўляецца распаўсюджанай рысай ракавых клетак, некаторыя з якіх абапіраюцца на глутамін для дапаўнення прамежкавых прадуктаў цыклу TCA для атрымання аднаўляльных эквівалентаў, якія кіруюць дыхальным ланцугом і падтрымліваюць выпрацоўку папярэднікаў біясінтэзу ліпідаў і нуклеатыдаў (39, 40). Нядаўняе даследаванне паказала, што ў перыферычных тканінах, якія адчуваюць дысфункцыю OXPHOS, аднаўленне метабалізму глутаміна/глутамата таксама з'яўляецца важнай асаблівасцю (5, 41), дзе кірунак уваходу глутаміна ў цыкл TCA залежыць ад ступені пашкоджання OXPHOS (41). Аднак няма выразных доказаў падабенства нейрональнай метабалічнай пластычнасці ў арганізме і яе магчымай значнасці ў кантэксце захворвання. У нядаўнім даследаванні in vitro было паказана, што першасныя коркавыя нейроны мабілізуюць пулы глутамата для нейратрансмісіі, тым самым спрыяючы акісляльнаму метабалізму і атэрасклерозу ва ўмовах метабалічнага стрэсу (42). Варта адзначыць, што пры фармакалагічнай інгібірыванні фермента сукцынатдэгідрагеназы цыклу ТЦА, мяркуецца, што карбаксіляванне пірувата падтрымлівае сінтэз оксалаацэтату ў культываваных нейронах мазжачка (34). Аднак фізіялагічная значнасць гэтых механізмаў для тканіны мозгу (дзе, як мяркуюць, атэрасклероз у асноўным абмяжоўваецца астрацытамі) усё яшчэ мае важнае фізіялагічнае значэнне (43). У гэтым выпадку нашы дадзеныя паказваюць, што пашкоджаныя OXPHOS у арганізме нутрацягліцавыя нейроны (ПН), могуць пераключыцца на дэградацыю BCAA і карбаксіляванне пірувата, якія з'яўляюцца двума асноўнымі крыніцамі папаўнення прамежкавых прадуктаў пула ТЦА. Нягледзячы на ​​тое, што меркаваны ўклад катабалізму BCAA ў нейрональны энергетычны метабалізм быў прапанаваны, акрамя ролі глутамату і ГАМК у нейратрансмісіі (44), да гэтага часу няма доказаў гэтых механізмаў in vivo. Такім чынам, лёгка выказаць здагадку, што дысфункцыянальныя ПН могуць аўтаматычна кампенсаваць спажыванне прамежкавых прадуктаў ТЦА, выкліканае працэсам асіміляцыі, шляхам павелічэння атэрасклерозу. У прыватнасці, для падтрымання павышанага попыту на аспарагіновую кіслату можа спатрэбіцца павышэнне рэгуляцыі PCx, што мяркуецца ў праліферуючых клетках з мітахондрыяльнай дысфункцыяй (45). Аднак наш метабаломны аналіз не выявіў істотных змен у стацыянарным узроўні аспарагінавай кіслаты ў Mfn2cKO PN (малюнак S6A), што, верагодна, адлюстроўвае рознае метабалічнае выкарыстанне аспарагінавай кіслаты паміж праліферуючымі клеткамі і постмітатычнымі нейронамі. Нягледзячы на ​​тое, што дакладны механізм павышэння рэгуляцыі PCx у дысфункцыянальных нейронах in vivo яшчэ трэба ахарактарызаваць, мы паказалі, што гэтая заўчасная рэакцыя адыгрывае важную ролю ў падтрыманні акісляльна-аднаўленчага стану нейронаў, што было прадэманстравана ў эксперыментах FLIM на зрэзах мазжачка. У прыватнасці, прадухіленне павышэння рэгуляцыі PCx PN можа прывесці да больш акісленага стану і паскорыць гібель клетак. Актывацыя дэградацыі BCAA і карбаксіляванне пірувату не з'яўляюцца спосабамі характарыстыкі перыферычных тканін мітахондрыяльнай дысфункцыі (7). Такім чынам, яны, здаецца, з'яўляюцца прыярытэтнай асаблівасцю нейронаў з дэфіцытам OXPHOS, нават калі не адзінай асаблівасцю, якая важная для нейрадэгенерацыі. .
Хвароба мазжачка — гэта гетэрагенны тып нейрадэгенератыўнага захворвання, якое звычайна праяўляецца як атаксія і часта пашкоджвае PNPH (46). Гэтая папуляцыя нейронаў асабліва ўразлівая да мітахондрыяльнай дысфункцыі, паколькі іх селектыўная дэгенерацыя ў мышэй дастатковая для ўзнаўлення многіх рухальных сімптомаў, якія характэрныя для спінацэрэбелярнай атаксіі ў чалавека (16, 47, 48). Паводле паведамленняў, трансгенная мадэль мышы з мутантным генам асацыюецца са спінацэрэбелярнай атаксіяй у чалавека і мае мітахондрыяльную дысфункцыю (49, 50), што падкрэслівае важнасць вывучэння наступстваў дэфіцыту OXPHOS пры PNPH. Такім чынам, асабліва падыходзіць эфектыўная ізаляцыя і вывучэнне гэтай унікальнай папуляцыі нейронаў. Аднак, улічваючы, што PN вельмі адчувальныя да ціску і складаюць невялікую долю ўсёй папуляцыі клетак мазжачка, для многіх даследаванняў, заснаваных на оміцы, селектыўнае падзел іх як цэлых клетак усё яшчэ з'яўляецца складаным аспектам. Нягледзячы на ​​тое, што практычна немагчыма дасягнуць абсалютнай адсутнасці забруджвання іншых тыпаў клетак (асабліва тканін дарослага чалавека), мы спалучылі эфектыўны этап дысацыяцыі з FACS, каб атрымаць дастатковую колькасць жыццяздольных нейронаў для далейшага пратэомнага аналізу і атрымаць даволі высокае пакрыццё бялкоў (каля 3000 бялкоў) у параўнанні з існуючым наборам дадзеных па ўсім мазжачку (51). Захоўваючы жыццяздольнасць цэлых клетак, прадстаўлены намі тут метад дазваляе нам не толькі праверыць змены ў метабалічных шляхах у мітахондрыях, але і праверыць змены ў іх цытаплазматычных аналагах, што дапаўняе выкарыстанне метабалічных мембранных метак мітахондрый для ўзбагачэння тыпу клетак. Новы метад для вызначэння колькасці мітахондрый у складаных тканінах (52, 53). Апісаны намі метад звязаны не толькі з вывучэннем клетак Пуркінье, але і можа быць лёгка прыменены да любога тыпу клетак для вырашэння метабалічных змен у пашкоджаным мозгу, у тым ліку да іншых мадэляў мітахондрыяльнай дысфункцыі.
Нарэшце, мы вызначылі тэрапеўтычнае акно падчас гэтага працэсу метабалічнай перабудовы, якое можа цалкам змяніць ключавыя прыкметы клеткавага стрэсу і прадухіліць дэгенерацыю нейронаў. Такім чынам, разуменне функцыянальных наступстваў апісанай тут перабудовы можа даць фундаментальнае разуменне магчымых метадаў лячэння для падтрымання жыццяздольнасці нейронаў падчас мітахондрыяльнай дысфункцыі. Неабходныя далейшыя даследаванні, накіраваныя на вывучэнне змяненняў энергетычнага абмену ў іншых тыпах клетак мозгу, каб цалкам выявіць прыдатнасць гэтага прынцыпу да іншых неўралагічных захворванняў.
Мышы MitoPark былі апісаны раней (31). Мышы C57BL/6N з loxP, фланкіруючымі гены Mfn2, былі апісаны раней (18) і скрыжаваны з мышамі L7-Cre (23). Атрыманае падвойнае гетэразіготнае нашчадства затым скрыжоўвалі з гамазіготнымі мышамі Mfn2loxP/Mfn2loxP для атрымання спецыфічных па гене накаўтаў Пуркінье для Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). У падгрупе спарвання алель Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) быў уведзены шляхам дадатковых скрыжаванняў (20). Усе працэдуры з жывёламі праводзіліся ў адпаведнасці з еўрапейскімі, нацыянальнымі і інстытуцыйнымі рэкамендацыямі і былі ўхвалены LandesamtfürNatur of Umwelt і Verbraucherschutz, Паўночны Рэйн-Вестфалія, Германія. Працы з жывёламі таксама адпавядаюць рэкамендацыям Еўрапейскай федэрацыі асацыяцый лабараторных навук аб жывёлах.
Пасля анестэзіі вывіху шыйнага аддзела цяжарнай жанчыны эмбрыён мышы вылучалі (E13). Кара галаўнога мозгу рассякалі ў збалансаваным саляным растворы Хэнкса (HBSS) з даданнем 10 мМ Hepes і прапускалі праз мадыфікаванае асяроддзе Ігла Дульбека, якое змяшчае папаін (20 адзінак/мл) і цыстэін (1 мкг/мл). Тканіну інкубавалі ў DMEM (асяроддзі DMEM) і дысацыявалі яе ферментатыўным пераварваннем (Ml) пры тэмпературы 37°C на працягу 20 хвілін, а затым механічна здрабнялі ў DMEM з даданнем 10% фетальнай бычынай сыроваткі. Клеткі высейвалі на шкляныя покрыўныя шклы, пакрытыя полілізінам, пры шчыльнасці 2×10⁶ на 6-см культуральную чашку або пры шчыльнасці 0,5×10⁶ клетак/см² для візуалізацыйнага аналізу. Праз 4 гадзіны асяроддзе замянялі на бессыроватачнае асяроддзе Neurobasal, якое змяшчае 1% дабаўкі B27 і 0,5 мМ GlutaMax. Затым нейроны падтрымліваліся пры тэмпературы 37°C і 5% CO2 на працягу ўсяго эксперыменту і падсілкоўваліся адзін раз на тыдзень. Каб выклікаць рэкамбінацыю in vitro, на другі дзень in vitro для апрацоўкі нейронаў выкарыстоўвалі 3 мкл (24-лункавы культуральны пласцінка) або 0,5 мкл (24-лункавы пласцінка) наступнага вектара віруса AAV9: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, нумар па каталогу 105530-AAV9) і AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, нумар па каталогу 105545-AAV9).
Камплементарная ДНК мышэй Mfn1 і Mfn2 (атрыманая з плазміды Addgene № 23212 і № 23213 адпаведна) пазначана паслядоўнасцю V5 (GKPIPNPLLGLDST) на C-канцы і зліта з mCherry ў рамцы зчытвання праз паслядоўнасць T2A. Grx1-roGFP2 — гэта падарунак ад Heidelberg TP Dick DFKZ (Нямецкі цэнтр даследаванняў кребсфоршинговых даследаванняў). Шляхам замены касеты tdTomato з выкарыстаннем звычайных метадаў кланавання, касета была субкланіравана ў аснову pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (спасылка Addgene № 28306) для стварэння вектараў pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 і pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Падобная стратэгія была выкарыстана для стварэння кантрольнага вектара pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Для стварэння канструкцыі AAV-shPCx патрабуецца плазмідны вектар AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]), які змяшчае паслядоўнасць ДНК, якая кадуе shRNA, накіраваную на мышыны PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Пад кантролем прамотара U6 выкарыстоўваецца mCherry пад кантролем прамотара CMV. Вытворчасць дапаможных вектараў AAV праводзілася ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы (Cell Biolabs). Карацей кажучы, выкарыстоўвалі плазміду-трансфер, якая нясе ген mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) для часовай трансфекцыі клетак 293AAV - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) або Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), а таксама плазміду капсіднага бялку AAV1 і дапаможнага бялку для ўпакоўкі, з выкарыстаннем метаду фасфату кальцыя. Неачышчаны вірусны супернатант атрымлівалі цыкламі замарожвання-размарожвання ў ванне з сухім лёдам/этанолам і лізавалі клеткі ў фасфатна-буферным фізіялагічным растворы (PBS). Вектар AAV быў ачышчаны шляхам перарывістага ультрацэнтрыфугавання з градыентам ёдыксанолу (24 гадзіны пры 32 000 аб/мін і 4°C) і канцэнтраваны з выкарыстаннем цэнтрабежнага фільтра Amicon ultra-15. Тытр геному AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 копій геному (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX быў вызначаны, як апісана раней (54), з дапамогай колькаснай ПЦР у рэжыме рэальнага часу (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/мл) і AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/мл).
Першасныя нейроны саскрабалі ў ледзяным 1x PBS, асадзілі, а затым гамагенізавалі ў лізісным буферы 0,5% Triton X-100 / 0,5% дэаксіхалату натрыю / PBS, які змяшчае фасфатазу і інгібітар пратэазы (Roche). Колькаснае вызначэнне бялку праводзілі з дапамогай аналізу біцынханінавай кіслаты (Thermo Fisher Scientific). Затым бялкі падзеленыя з дапамогай электрафарэзу ў SDS-поліакрыламідным гелі, а затым блотавалі на полівінілідэнфтарыдную мембрану (GE Healthcare). Блакуйце неспецыфічныя ўчасткі і інкубуйце з першасным антыцелам (падрабязнасці гл. у табліцы S1) у 5% малацэ ў TBST (Tris-буферны фізіялагічны раствор з Tween), этапы прамывання і другасныя антыцелы ў TBST Incubate. Інкубуйце з першасным антыцелам на працягу ночы пры +4°C. Пасля прамывання нанясіце другасныя антыцелы на 2 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы. Пасля гэтага, шляхам інкубацыі таго ж блота з антыцеламі супраць β-актыну, была пацверджана тая ж загрузка. Выяўленне шляхам пераўтварэння ў хемілюмінесцэнцыю і ўзмацнення хемілюмінесцэнцыі (GE Healthcare).
Нейроны, папярэдне пасеяныя на покрыўныя шклы, фіксавалі 4% парафармальдэгідам (PFA)/PBS у пазначаны момант часу пры пакаёвай тэмпературы на працягу 10 хвілін. Спачатку покрыўныя шклы пранікалі 0,1% Triton X-100/PBS на працягу 5 хвілін пры пакаёвай тэмпературы, а затым у блакіруючы буфер [3% бычыны сыроватачны альбумін (BSA)/PBS]. На другі дзень покрыўныя шклы прамывалі блакіруючым буферам і інкубавалі з адпаведнымі другаснымі антыцеламі, кан'югаванымі з флуарафорам, на працягу 2 гадзін пры пакаёвай тэмпературы; нарэшце, узоры старанна прамывалі ў PBS з 4',6-дыямідына-2-феніліндолам (DAPI), кантрастліва афарбоўвалі, а затым фіксавалі на прадметным шкле мікраскопа з дапамогай Aqua-Poly/Mount.
Мышам (самцам і самкам) уводзілі анестэзію шляхам унутрыбрушыннай ін'екцыі кетаміна (130 мг/кг) і ксілазіну (10 мг/кг) і падскурна ўводзілі абязбольвальнае карпрафен (5 мг/кг). Пасля гэтага мышы змяшчалі ў стэрэатаксічны інструмент (Kopf), абсталяваны награвальнай падушкай. Адкрывалі чэрап і з дапамогай стаматалагічнай дрылі разрэджвалі частку кары мазжачка, якая адпавядае міякулярнай костцы (ад лямбда: хвост 1,8, латэральны 1, што адпавядае долям IV і V). Выкарыстоўваючы выгнутую іголку шпрыца, асцярожна стваралі невялікую адтуліну ў чэрапе, каб не пашкодзіць сасудзістую сістэму ніжэй. Затым тонкі шкляны капіляр павольна ўводзілі ў мікраадтуліну (ад -1,3 да -1 на вентральным баку цвёрдай мазгавой абалонкі), і ад 200 да 300 нл AAV ўводзілі ў мікраін'ектар (Narishige) з дапамогай ручных шпрыцоў (Narishige) некалькі разоў пры нізкім ціску на працягу 10-20 хвілін. Пасля ўвядзення капіляр трэба пакінуць яшчэ на 10 хвілін, каб вірус мог цалкам распаўсюдзіцца. Пасля выдалення капіляраў скуру старанна зашываюць, каб мінімізаваць запаленне раны і даць жывёле магчымасць аднавіцца. Жывёл лячылі абязбольвальнымі прэпаратамі (каспафен) на працягу некалькіх дзён пасля аперацыі, на працягу якіх старанна кантралявалі іх фізічны стан, а затым у пазначаны час іх падвяргалі эўтаназіі. Усе працэдуры праводзіліся ў адпаведнасці з еўрапейскімі, нацыянальнымі і інстытуцыйнымі рэкамендацыямі і былі ўхвалены LandesamtfürNatur of Umwelt und Verbraucherschutz, Паўночны Рэйн-Вестфалія, Германія.
Жывёл анестэзавалі кетамінам (100 мг/кг) і ксілазінам (10 мг/кг), пасля чаго сэрца спачатку перфузавалі 0,1 М PBS, а затым 4% PFA ў PBS. Тканіну рассякалі і фіксавалі ў 4% PFA/PBS на працягу ночы пры тэмпературы 4°C. Для падрыхтоўкі сагітальных зрэзаў (таўшчынёй 50 мкм) з фіксаванага мозгу ў PBS выкарыстоўвалі вібрацыйны нож (Leica Microsystems GmbH, Вена, Аўстрыя). Калі не пазначана іншае, афарбоўванне свабодна плаваючых зрэзаў праводзілі, як апісана вышэй (13), пры пакаёвай тэмпературы і перамешванні. Карацей кажучы, спачатку атрыманыя зрэзы пермеабілізавалі 0,5% Triton X-100/PBS на працягу 15 хвілін пры пакаёвай тэмпературы; для некаторых эпітопаў (Pcx і Shmt2) — шляхам награвання зрэзаў на працягу 25 хвілін у буферы tris-EDTA пры тэмпературы 80°C (pH 9) замест гэтага этапу. Далей зрэзы інкубавалі з першаснымі антыцеламі (гл. Табліцу S1) у блакіруючым буферы (3% BSA/PBS) пры 4°C на працягу ночы з памешваннем. На наступны дзень зрэзы прамывалі блакіруючым буферам і інкубавалі з адпаведнымі другаснымі антыцеламі, кан'югаванымі з флуарафорам, на працягу 2 гадзін пры пакаёвай тэмпературы; нарэшце, зрэзы старанна прамывалі ў PBS, кантрастліва афарбоўвалі DAPI, а затым фіксавалі AquaPolymount на прадметным шкле мікраскопа.
Для візуалізацыі ўзору выкарыстоўваўся лазерны сканіруючы канфакальны мікраскоп (TCS SP8-X або TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), абсталяваны белым лазерам і ультрафіялетавым лазерам на 405 дыёдах. Шляхам узбуджэння флуарафора і збору сігналу з дапамогай гібрыднага дэтэктара (HyDs) праграмнае забеспячэнне LAS-X выкарыстоўвалася для збору шматслаёвых малюнкаў у адпаведнасці з выбаркай Найквіста ў паслядоўным рэжыме: для неколькасных панэляў гэта вельмі дынамічныя сігналы (напрыклад, у саматычных клетках і дендрытах) (mtYFP). Выкарыстоўваецца HyD для вызначэння колькасці PN у рэжыме BrightR. Для памяншэння фону выкарыстоўваецца стробіраванне ад 0,3 да 6 нс.
Візуалізацыя адсартаваных клетак у рэжыме рэальнага часу. Пасля сартавання ў асяроддзі Neurobasal-A, якое змяшчае 1% дабаўкі B27 і 0,5 мМ GlutaMax, клеткі неадкладна высейвалі на пакрытыя полі-L-лізінам шкляныя слайды (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталожны нумар 80826), а затым вытрымлівалі пры тэмпературы 37°C і 5% CO2 на працягу 1 гадзіны, каб клеткі маглі асесці. Візуалізацыя ў рэжыме рэальнага часу праводзілася на лазерным сканіруючым канфакальным мікраскопе Leica SP8, абсталяваным белым лазерам, HyD, алейным аб'ектывам з лікавай апертурай (NA) 63×[1,4] і награвальным столікам.
Мышы хутка анестэзавалі вуглякіслым газам і абезгалоўлівалі, мозг хутка вынялі з чэрапа і разрэзалі на сагітальныя зрэзы таўшчынёй 200 мкм (для эксперыменту з маркіроўкай 13C) або таўшчынёй 275 мкм (для эксперыментаў з двума фатонамі), запоўненыя наступнымі матэрыяламі: марозіва (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Вальдорф, Германія) напоўнена наступнымі рэчывамі: 125 мМ ледзяной, насычанай вугляродам (95% O2 і 5% CO2) нізкакаларыйнай штучнай спіннамазгавой вадкасці (ACSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фасфатнага буфера натрыю, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкозы, 0,5 мМ CaCl2 і 3,5 мМ MgCl2 (асматычны ціск ад 310 да 330 ммоль). Перанясіце атрыманыя зрэзы мозгу ў камеру папярэдняй інкубацыі, якая змяшчае асяроддзе з больш высокім утрыманнем Ca2+ ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фасфатнага буфера натрыю, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 1,0 мМ CaCl2 і 2,0 мМ MgCl2) з pH 7,4 і канцэнтрацыяй ад 310 да 320 ммоль).
Падчас працэсу візуалізацыі зрэзы перамяшчалі ў спецыялізаваны пакой для візуалізацыі, і эксперымент праводзіўся пры бесперапыннай перфузіі ACSF пры пастаяннай тэмпературы ад 32° да 33°C. Для візуалізацыі зрэзаў выкарыстоўваўся шматфатонны лазерны сканіруючы мікраскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), абсталяваны аб'ектывам Leica 25x (NA 0.95, вада), тытан-сафіравы лазер (Chameleon Vision II, Coherent). Модуль FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Змены ў цытаплазматычным акісляльна-аднаўленчым стане PN вымяраліся з дапамогай двухфатоннага FLIM у сагітальных зрэзах мозгу, дзе біясенсар Grx1-roGFP2 накіроўваўся на PN. У пласце PN поле захопу выбіраецца прыкладна на 50-80 мкм ніжэй паверхні зрэзу, каб пераканацца ў наяўнасці жыццяздольнай PN (гэта значыць адсутнасці шарыкавай структуры або нейрональных марфалагічных змен уздоўж дендрытаў) і двайнога станоўчага сенсара roGFP2 і AAV, якія кадуюць shRNA PCx або яе кантрольную паслядоўнасць (кожны з якіх сумесна экспрэсуе mCherry). Збіраюць аднаслаёвыя выявы з 2-кратным лічбавым павелічэннем [даўжыня хвалі ўзбуджэння: 890 нм; 512 нм 512 пікселяў]. Дэтэкцыя: унутраная HyD, група фільтраў флуарэсцэінізатыяцыянату (FITC)] і выкарыстоўваюцца сярэдняе выявы на працягу 2-3 хвілін, каб гарантаваць, што сабрана дастаткова фатонаў (усяго 1000 фатонаў) для апраксімацыі крывой. Адчувальнасць зонда Grx1-roGFP2 і праверка ўмоў FLIM праводзіліся шляхам маніторынгу значэння працягласці жыцця roGFP2 пры даданні экзагенных 10 мМ H2O2 у перфузійную ACSF (для максімізацыі акіслення, што прыводзіць да павелічэння працягласці жыцця), а затым даданні 2 мМ дытыятрэйтолу (мінімізуе ступень аднаўлення, што прыводзіць да скарачэння працягласці жыцця) (Малюнак S8, ад D да G). Для аналізу атрыманых вынікаў выкарыстоўвайце праграмнае забеспячэнне FLIMfit 5.1.1, падганяйце адзінарную экспанентную крывую затухання ўсяго малюнка да вымеранай IRF (функцыі водгуку прыбора), і χ2 прыблізна роўны 1. Для разліку часу жыцця асобнага PN маска вакол цела нерва была намалявана ўручную, і для колькаснай ацэнкі выкарыстоўваўся сярэдні час жыцця ў кожнай масцы.
Аналіз мітахандрыяльнага патэнцыялу. Пасля інкубацыі вострага зрэзу са 100 нМ TMRM, непасрэдна дададзеным у перфузаваны ACSF на працягу 30 хвілін, змены мітахандрыяльнага патэнцыялу PN былі вымераны з дапамогай двухфатоннага мікраскопа. Візуалізацыя TMRM праводзілася шляхам узбуджэння зонда пры 920 нм і выкарыстання ўнутранага HyD (тэтраметыларадамін ізатыяцыянат: 585/40 нм) для збору сігналаў; з выкарыстаннем той жа даўжыні хвалі ўзбуджэння, але з выкарыстаннем іншага ўнутранага HyD (FITC: 525/50) для візуалізацыі mtYFP. Выкарыстоўвайце плагін Image Calculator ад ImageJ для ацэнкі мітахандрыяльнага патэнцыялу на ўзроўні адной клеткі. Карацей кажучы, ураўненне плагіна: signal = min (mtYFP, TMRM) выкарыстоўваецца для ідэнтыфікацыі мітахандрыяльнай вобласці, якая паказвае сігнал TMRM у Пуркінье Самалі на аднаслаёвай канфакальнай выяве адпаведнага канала. Затым плошча пікселя ў атрыманай масцы вызначаецца колькасна, а затым нармалізуецца на адпаведным парогавым аднастэкавым малюнку канала mtYFP для атрымання мітахондрыяльнай фракцыі, якая паказвае мітахондрыяльны патэнцыял.
Выява была дэканвалювана з дапамогай праграмнага забеспячэння Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Для адсканаваных малюнкаў плітак мантаж адной пліткі выконваецца з выкарыстаннем алгарытму аўтаматычнага сшывання, які прадастаўляецца праграмным забеспячэннем LAS-X. Пасля каліброўкі выявы выкарыстоўвайце ImageJ і Adobe Photoshop для далейшай апрацоўкі выявы і раўнамернай карэкціроўкі яркасці і кантраснасці. Для графічнай падрыхтоўкі выкарыстоўвайце Adobe Illustrator.
Аналіз факусавання мтДНК. Колькасць паражэнняў мтДНК была колькасна вызначана на зрэзах мазжачка, пазначаных антыцеламі супраць ДНК, з дапамогай канфакальнага мікраскопа. Кожная мэтавая вобласць была створана для цела клеткі і ядра кожнай клеткі, і адпаведная плошча была разлічана з дапамогай убудовы Multi Measure (праграмнае забеспячэнне ImageJ). Адніміце плошчу ядра ад плошчы цела клеткі, каб атрымаць плошчу цытаплазмы. Нарэшце, убудова Analyze Particles (праграмнае забеспячэнне ImageJ) была выкарыстана для аўтаматычнай колькаснай ацэнкі кропак цытаплазматычнай ДНК, якія паказваюць мтДНК на парогавым малюнку, і атрыманыя вынікі былі нармалізаваны да сярэдняга PN мышэй CTRL. Вынікі выражаны як сярэдняя колькасць нуклеазідаў на клетку.
Аналіз экспрэсіі бялку. Выкарыстоўвайце плагін Image Calculator ад ImageJ для ацэнкі экспрэсіі бялку ў PN на ўзроўні адной клеткі. Карацей кажучы, на аднаслаёвым канфакальным малюнку адпаведнага канала з дапамогай ураўнення: сігнал = мін (mtYFP, антыцела) ідэнтыфікуецца мітахандрыяльная вобласць, якая праяўляе імунарэактыўнасць да пэўнага антыцела ў Пуркіна. Затым плошча пікселя ў атрыманай масцы вызначаецца колькасна, а затым нармалізуецца на адпаведным парогавым аднаслаёвым малюнку канала mtYFP для атрымання мітахандрыяльнай фракцыі адлюстраванага бялку.
Аналіз шчыльнасці клетак Пуркінье. Для ацэнкі шчыльнасці клетак Пуркінье выкарыстоўваўся плагін Cell Counter праграмы ImageJ, які дзяліў колькасць падлічаных клетак Пуркінье на даўжыню мазжачковага кольца, занятага падлічанымі клеткамі.
Падрыхтоўка і збор узораў. Мозгі кантрольнай групы і мышэй Mfn2cKO фіксавалі ў 2% PFA/2,5% глутаральдэгіде ў 0,1 М фасфатным буферы (PB), а затым рыхтавалі каранарныя зрэзы з выкарыстаннем інфузорый (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Аўстрыя) (таўшчыня ад 50 да 60 мкм). Затым фіксавалі ў буферы PB у 1% тэтрааксіду і 1,5% ферацыянідзе калію пры пакаёвай тэмпературы на працягу 1 гадзіны. Зрэзы тройчы прамывалі дыстыляванай вадой, а затым афарбоўвалі 70% этанолам, які змяшчае 1% уранілацэтату, на працягу 20 хвілін. Затым зрэзы абязводжвалі ў градуяваным спірце і залівалі ў эпаксідную смалу Durcupan ACM (ліцейная смаліна Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, нумар у каталогу 14040) паміж пакрытымі сіліконам шклянымі шкламі і, нарэшце, палімерызавалі ў печы на ​​працягу 48 гадзін пры тэмпературы 60°C. Быў абраны ўчастак кары мазжачка, і на электронным мікраскопе Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Аўстрыя) былі зроблены ультратонкія зрэзы таўшчынёй 50 нм, якія былі нарэзаны на меднай шчыліннай сетцы 2×1 мм, пакрытай полістыролавай плёнкай. Зрэзы былі афарбаваны растворам 4% уранілацэтату ў H2O на працягу 10 хвілін, прамыты H2O некалькі разоў, затым цытратам свінцу Рэйнальдса ў H2O на працягу 10 хвілін, а пасля гэтага некалькі разоў прамыты H2O. Мікрафатаграфіі былі зроблены з дапамогай прасвечвальнага электроннага мікраскопа Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША) з выкарыстаннем лічбавай камеры TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Гаўтынг, ЗША). Германія).
У мышэй, заражаных AAV, мозг аддзялялі і наразалі на сагітальныя зрэзы таўшчынёй 1 мм, а мазжачок даследавалі з дапамогай флуарэсцэнтнага мікраскопа для ідэнтыфікацыі кольца, заражанага AAV (г.зн. экспрэсуючага mCherry). Выкарыстоўваліся толькі тыя эксперыменты, у якіх ін'екцыя AAV прыводзіла да вельмі высокай эфектыўнасці трансдукцыі пласта клетак Пуркінье (г.зн. амаль усяго пласта) як мінімум у двух паслядоўных кольцах мазжачка. Пятля, трансдуцыраваная AAV, падвяргалася мікрадысекцыі для начной постфіксацыі (4% PFA і 2,5% глутаральдэгіду ў 0,1 М какоатным буферы) і далейшай апрацоўцы. Для ўбудавання EPON фіксаваную тканіну прамывалі 0,1 М какоатным буферам натрыю (Applichem) і інкубавалі з 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) у 0,1 М какоатным буферы натрыю (Applichem) на працягу 4 гадзін, затым прамывалі на працягу 2 гадзін. Паўтарылі 3 разы з 0,1 М какоматным буферам. Пасля гэтага для інкубацыі кожнага этанольнага раствора пры тэмпературы 4°C на працягу 15 хвілін выкарыстоўвалі ўзыходзячую серыю этанолу для абязводжвання тканіны. Тканіну пераносілі ў аксід прапілену і інкубавалі на працягу ночы ў EPON (Sigma-Aldrich) пры тэмпературы 4°C. Змяшчалі тканіну ў свежы EPON пры пакаёвай тэмпературы на 2 гадзіны, а затым залівалі яе пры тэмпературы 62°C на 72 гадзіны. Выкарыстоўвалі ультрамікратом (Leica Microsystems, UC6) і алмазны нож (Diatome, Біль, Швейцарыя) для выразання ультратонкіх зрэзаў таўшчынёй 70 нм і афарбоўвалі 1,5% растворам уранілацэтату на працягу 15 хвілін пры тэмпературы 37°C і афарбоўвалі растворам цытрату свінцу на працягу 4 хвілін. Электронныя мікрафатаграфіі былі зроблены з дапамогай прасвечвальнага электроннага мікраскопа JEM-2100 Plus (JEOL), абсталяванага камерай OneView 4K 16-bit (Gatan) і праграмным забеспячэннем DigitalMicrograph (Gatan). Для аналізу электронныя мікрафатаграфіі былі атрыманы з лічбавым павелічэннем 5000× або 10 000×.
Марфалагічны аналіз мітахондрый. Для ўсіх аналізаў контуры асобных мітахондрый былі ўручную акрэслены на лічбавых выявах з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння ImageJ. Аналізуюцца розныя марфалагічныя параметры. Шчыльнасць мітахондрый выражаецца ў працэнтах, атрыманых шляхам дзялення агульнай плошчы мітахондрый кожнай клеткі на плошчу цытаплазмы (плошча цытаплазмы = плошча клеткі - плошча ядра клеткі) × 100. Кругласць мітахондрый разлічваецца па формуле [4π∙(плошча/перыметр 2)]. Марфалогія мітахондрый была прааналізавана і падзелена на дзве катэгорыі («трубчастыя» і «пухіравыя») у адпаведнасці з іх асноўнымі формамі.
Аналіз колькасці і шчыльнасці аўтафагасом/лізасом. Выкарыстоўвайце праграмнае забеспячэнне ImageJ, каб уручную акрэсліць контуры кожнай аўтафагасомы/лізасомы на лічбавым малюнку. Плошча аўтафагасом/лізасом выражаецца ў працэнтах, якія разлічваюцца шляхам дзялення агульнай плошчы структуры аўтафагасом/лізасом кожнай клеткі на плошчу цытаплазмы (плошча цытаплазмы = плошча клеткі - плошча ядра) × 100. Шчыльнасць аўтафагасом/лізасом разлічваецца шляхам дзялення агульнай колькасці на колькасць структур аўтафагасом/лізасом на клетку (у пераліку на плошчу цытаплазмы) (плошча цытаплазмы = плошча клеткі - плошча ядра).
Маркіроўка для вострых зрэзаў і падрыхтоўкі ўзораў. Для эксперыментаў, якія патрабуюць маркіроўкі глюкозай, перанясіце вострыя зрэзы мозгу ў камеру папярэдняй інкубацыі, якая змяшчае насычаны вуглярод (95% O2 і 5% CO2), высокі Ca2+ ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фасфатны буфер натрыю, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 1,0 мМ CaCl2 і 2,0 мМ MgCl2, даведзены да pH 7,4 і ад 310 да 320 мОсм), у якім глюкоза з'яўляецца 13C6-глюкозным замяшчэннем (Eurisotop, нумар у каталогу CLM-1396). Для эксперыментаў, якія патрабуюць маркіроўкі піруватам, перанясіце зрэзы вострага мозгу ў асяроддзе з больш высокім утрыманнем Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фасфатнага буфера натрыю, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 1,0 мМ CaCl2 і дадайце 2,0 мМ MgCl2, давядзіце pH да 7,4 і ад 310 да 320 мОсм) і дадайце 1 мМ 1-[1-13C]пірувату (Eurisotop, нумар у каталогу CLM-1082). Інкубуйце зрэзы на працягу 90 хвілін пры тэмпературы 37°C. Пасля заканчэння эксперыменту зрэзы хутка прамывалі водным растворам (pH 7,4), які змяшчаў 75 мМ карбанату амонію, а затым гамагенізавалі ў суадносінах ацэтанітрылу (ACN):метанолу:вады ў суадносінах 40:40:20 (аб'ём:аб'ём:аб'ём). Пасля 30-хвіліннай інкубацыі зрэзаў на лёдзе ўзоры цэнтрыфугавалі пры 21 000 g на працягу 10 хвілін пры 4°C, а празрысты супернатант высушылі ў канцэнтратары SpeedVac. Атрыманы высушаны асадак метабаліту захоўвалі пры тэмпературы -80°C да аналізу.
Аналіз амінакіслот, мечаных 13C, з дапамогай вадкаснай храматаграфіі-мас-спектрометрыі. Для аналізу з дапамогай вадкаснай храматаграфіі-мас-спектрометрыі (LC-MS) асадак метабаліту рэсуспендавалі ў 75 мкл вады класа LC-MS (Honeywell). Пасля цэнтрыфугавання пры 21 000 g на працягу 5 хвілін пры 4°C 20 мкл ачышчанага супернатанту выкарыстоўвалі для аналізу патоку амінакіслот, а астатнюю частку экстракта адразу ж выкарыстоўвалі для аналізу аніёнаў (гл. ніжэй). Аналіз амінакіслот праводзілі з выкарыстаннем раней апісанага пратаколу дэрыватызацыі бензоілхларыду (55, 56). На першым этапе да 20 мкл экстракта метабаліту дадалі 10 мкл 100 мМ карбанату натрыю (Sigma-Aldrich), а затым да ACN класа LC дадалі 10 мкл 2% бензоілхларыду (Sigma-Aldrich). Узор коратка перамяшалі на віхравой ванне, а затым цэнтрыфугавалі пры 21 000 g на працягу 5 хвілін пры 20°C. Перанесці ачышчаны супернатант у 2-мілілітровы флакон для аўтаматычнага самаадбору з канічнай шкляной устаўкай (аб'ём 200 мкл). Узоры аналізавалі з дапамогай звышвысокапрадукцыйнай сістэмы вадкаснай хроматографіі Acquity iClass (Waters), падлучанай да высокадакладнага дакладнага мас-спектрометра Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Для аналізу 2 мкл дэрыватызаванага ўзору ўводзілі ў калонку з высокатрывалым дыяксідам крэмнію T3 памерам 100×1,0 мм (Waters), якая змяшчае часціцы памерам 1,8 мкм. Хуткасць патоку складае 100 мкл/мін, а буферная сістэма складаецца з буфера А (10 мМ фарыяту амонію і 0,15% мурашынай кіслаты ў вадзе) і буфера В (ACN). Градыент наступны: 0%В пры 0 хвілінах; 0%В. Ад 0 да 15%В пры 0 да 0,1 хвіліны; ад 15 да 17%В пры 0,1 да 0,5 хвіліны; B ад 17 да 55% пры 0,5 да 14 хвілін; B ад 55 да 70% пры 14 да 14,5 хвілін; ад 14,5 да 70 да 100% B пры 18 хвілінах; 100% B пры 18 да 19 хвілін; ад 100 да 0% B пры 19 да 19,1 хвіліны; 0% B пры 19,1 да 28 хвілін (55, 56). Мас-спектрометр QE-HF працуе ў рэжыме станоўчай іанізацыі з дыяпазонам мас m/z (суадносіны масы да зараду) ад 50 да 750. Выкарыстоўваемая раздзяляльная здольнасць складае 60 000, атрыманая іённая мішэнь з рэгуляваннем узмацнення (AGC) складае 3×106, а максімальны час іёна — 100 мілісекунд. Крыніца награвальнай электрараспыляльнай іанізацыі (ESI) працуе пры напрузе распылення 3,5 кВ, тэмпературы капіляра 250°C, патоку паветра праз абалонку 60 а.а. (умоўных адзінак) і дапаможным патоку паветра 20 а.а. 250°C. Лінза S усталявана на 60 а.а.
Аналіз арганічных кіслот, мечаных 13C, з дапамогай аніённай храматаграфіі-МС. Астатні асадак метабаліту (55 мкл) быў прааналізаваны з выкарыстаннем сістэмы іённай храматаграфіі Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), падлучанай да мас-спектрометра QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Карацей кажучы, 5 мкл экстракта метабаліту было ўведзена ў калонку Dionex IonPac AS11-HC, абсталяваную ВЭЖХ (2 мм × 250 мм, памер часціц 4 мкм, Thermo Fisher Scientific) у рэжыме частковага цыкла з каэфіцыентам напаўнення 1. ) Ахоўная калона Dionex IonPac AG11-HC (2 мм x 50 мм, 4 мкм, Thermo Fisher Scientific). Тэмпература калонкі падтрымліваецца на ўзроўні 30°C, а аўтасамплер усталяваны на 6°C. Выкарыстоўвайце картрыдж з гідраксідам калію, забяспечаны дэіянізаванай вадой, для стварэння градыенту гідраксіду калію праз генератар элюента. Падзел метабалітаў пры хуткасці патоку 380 мкл/мін, ужываючы наступны градыент: ад 0 да 3 хвілін, 10 мМ KOH; ад 3 да 12 хвілін, ад 10 да 50 мМ KOH; ад 12 да 19 хвілін, ад 50 да 100 мМ KOH; ад 19 да 21 хвіліны, 100 мМ KOH; ад 21 да 21,5 хвілін, ад 100 да 10 мМ KOH. Калонку зноў ураўнаважылі ў канцэнтрацыі 10 мМ KOH на працягу 8,5 хвілін.
Элюяваныя метабаліты пасля калоны змешваюцца з патокам ізапрапанолу з хуткасцю 150 мкл/мін, а затым накіроўваюцца ў мас-спектрометр высокага разрознення, які працуе ў рэжыме адмоўнай іанізацыі. МС кантралюе дыяпазон мас ад m/z 50 да 750 з разрозненнем 60 000. АГХ усталявана на 1×106, а максімальны час іёна падтрымліваецца на ўзроўні 100 мс. Нагрэтая крыніца ESI працавала пры напрузе распылення 3,5 кВ. Іншыя налады крыніцы іёнаў наступныя: тэмпература капіляра 275°C; паток газу абалонкі — 60 AU; паток дапаможнага газу — 20 AU пры 300°C і налада S-лінзы на 60 AU.
Аналіз дадзеных метабалітаў, мечаных 13C. Для аналізу дадзеных суадносін ізатопаў выкарыстоўвайце праграмнае забеспячэнне TraceFinder (версія 4.2, Thermo Fisher Scientific). Ідэнтычнасць кожнага злучэння была праверана з дапамогай надзейнага эталоннага злучэння і прааналізавана незалежна. Для правядзення аналізу ўзбагачэння ізатопаў плошча экстрагаванай іённай храматаграмы (XIC) кожнага ізатопа 13C (Mn) была выдзелена з [M + H] +, дзе n - колькасць атамаў вугляроду мэтавага злучэння, якое выкарыстоўваецца для аналізу амінакіслот, або [MH] + выкарыстоўваецца для аналізу аніёнаў. Дакладнасць масы XIC складае менш за пяць частак на мільён, а дакладнасць RT складае 0,05 хвіліны. Аналіз узбагачэння праводзіцца шляхам разліку суадносін кожнага выяўленага ізатопа да сумы ўсіх ізатопаў адпаведнага злучэння. Гэтыя суадносіны прыведзены ў працэнтных значэннях для кожнага ізатопа, а вынікі выражаны ў выглядзе молярнага працэнта ўзбагачэння (MPE), як апісана раней (42).
Замарожаны нейронавы асадак гамагенізавалі ў ледзяным 80% метаноле (аб./аб.), перамяшалі на вортэксе і інкубавалі пры тэмпературы -20°C на працягу 30 хвілін. Зноў перамяшалі ўзор на вортэксе і перамешвалі пры тэмпературы +4°C на працягу 30 хвілін. Узор цэнтрыфугавалі пры 21 000 g на працягу 5 хвілін пры 4°C, а затым атрыманы супернатант збіралі і высушвалі з дапамогай канцэнтратара SpeedVac пры тэмпературы 25°C для наступнага аналізу. Як апісана вышэй, быў праведзены аналіз вадкаснай мас-спектрометрыяй (LC-MS) амінакіслот адсартаваных клетак. З дапамогай TraceFinder (версія 4.2, Thermo Fisher Scientific) быў праведзены аналіз дадзеных з выкарыстаннем монаізатопнай масы кожнага злучэння. Квантыльная нармалізацыя дадзеных метабалітаў была праведзена з выкарыстаннем праграмнага пакета preprocessCore (57).
Падрыхтоўка зрэзаў. Мыш хутка анестэзавалі вуглякіслым газам і абезгалоўлівалі, мозг хутка вынялі з чэрапа, і вібруючы нож, напоўнены лёдам (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Вальдорф, Германія), выкарыстоўвалі для разразання яго на сагітальныя зрэзы таўшчынёй ад 300 да 375 мкм. Халодная газіфікацыя вугляродам (95% O2 і 5% CO2). Нізкі Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фасфатны буфер натрыю, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 1,0 мМ CaCl2 і 6,0 мМ MgCl2. Давядзіце pH да 7,4 і да 310-330 мОсм). Перанясіце атрыманыя зрэзы мозгу ў камеру, якая змяшчае больш высокі Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фасфатнага буфера натрыю, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ D-глюкозы, 4,0 мМ CaCl2 і 3,5 мМ MgCl2) з pH 7,4 і ціскам ад 310 да 320 мОсм. Захоўвайце зрэзы на працягу 20-30 хвілін, каб іх можна было аднавіць перад запісам.
Запіс. Для ўсіх запісаў выкарыстоўваўся столік мікраскопа, абсталяваны фіксаванай камерай запісу і аб'ектывам з 20-кратным павелічэннем для імерсіі ў ваду (Scientifica). Меркаваныя клеткі Пуркінье былі ідэнтыфікаваны па (i) памеры цела, (ii) анатамічным размяшчэнні мазжачка і (iii) экспрэсіі флуарэсцэнтнага рэпарцёрнага гена mtYFP. Піпетка з супраціўленнем наканечніка ад 5 да 11 Мом выцягваецца з дапамогай капіляра з боросілікатнага шкла (GB150-10, 0,86 мм × 1,5 мм × 100 мм, Science Products, Хофхайм, Германія) і гарызантальнай піпеткі Instruments (P-1000, Sutter), Новато, Каліфорнія. Усе запісы праводзіліся з дапамогай узмацняльніка ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Там, Германія), які кіраваўся праграмным забеспячэннем Signal (версія 6.0, Cambridge Electronic, Кембрыдж, Вялікабрытанія). Эксперымент быў запісаны з частатой дыскрэтызацыі 12,5 кГц. Сігнал фільтруецца з дапамогай двух кароткапраходных фільтраў Беселя з частотамі зрэзу 1,3 і 10 кГц адпаведна. Ёмістасць мембраны і піпеткі кампенсуецца схемай кампенсацыі з дапамогай узмацняльніка. Усе эксперыменты праводзіліся пад кіраваннем камеры Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Германія), якая кіруецца праграмным забеспячэннем Hokawo (версія 2.8, Hamamatsu, Gerden, Германія).
Руцінная канфігурацыя і аналіз цэлых клетак. Непасрэдна перад запісам напоўніце піпетку ўнутраным растворам, які змяшчае наступныя рэчывы: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ глюканату калію, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ АТФ (Mg), 0,5 мМ гуанозінтрыфасфату (GTP) (Na) і 10,0 мМ крэатынінфасфату, даведзеныя да pH 7,25, а асматычны ціск склаў 290 мОсм (цукроза). Адразу пасля прыкладання сілы 0 пА для разрыву мембраны быў вымераны мембранны патэнцыял спакою. Уваходны супраціў вымяраецца шляхам прыкладання гіперпалярызаваных токаў -40, -30, -20 і -10 пА. Вымерайце велічыню напружання і выкарыстоўвайце закон Ома для разліку ўваходнага супраціўлення. Спантанная актыўнасць рэгістравалася з дапамогай вольтметра на працягу 5 хвілін, а sPSC ідэнтыфікавалася і вымяралася ў праграме Igor Pro (версія 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) з выкарыстаннем паўаўтаматычнага сцэнарыя распазнавання. Крывая IV і стацыянарны ток вымяраюцца шляхам фіксацыі батарэі пры розных патэнцыялах (пачынаючы ад -110 мВ) і павелічэння напружання з крокам 5 мВ. Выпрацоўка AP правяралася шляхам падачы дэпалярызацыйнага току. Фіксуйце ячэйку пры -70 мВ падчас падачы імпульсу дэпалярызацыйнага току. Адрэгулюйце крок кожнага блока рэгістрацыі асобна (ад 10 да 60 пА). Разлічыце максімальную частату AP, падлічыўшы ўручную імпульсныя пікі, якія выклікаюць найвышэйшую частату AP. Парог AP аналізуецца з выкарыстаннем другой вытворнай дэпалярызацыйнага імпульсу, які першым запускае адзін або некалькі AP.
Канфігурацыя і аналіз перфараванага латка. Выканайце запіс перфараванага латка з выкарыстаннем стандартных пратаколаў. Выкарыстоўвайце піпетку без АТФ і ГТФ, якая не ўтрымлівае наступных інгрэдыентаў: 128 мМ глюканату K, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0,1 мМ EGTA і 2 мМ MgCl2, і давядзіце pH да 7,2 (з дапамогай KOH). АТФ і ГТФ выключаюцца з унутрыклетачнага раствора, каб прадухіліць некантраляваную пранікальнасць клеткавай мембраны. Піпетку-латка напаўняюць унутраным растворам, які змяшчае амфатэрыцын (прыблізна ад 200 да 250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich), каб атрымаць запіс перфараванага латка. Амфатэрыцын растваралі ў дыметылсульфаксідзе (канчатковая канцэнтрацыя: ад 0,1 да 0,3%; ДМСО; D8418, Sigma-Aldrich). Выкарыстаная канцэнтрацыя ДМСО не аказала істотнага ўплыву на даследаваныя нейроны. Падчас працэсу прабівання супраціўленне канала (Ra) бесперапынна кантралявалася, і эксперымент пачынаўся пасля стабілізацыі амплітуды Ra і AP (20-40 хвілін). Спантанная актыўнасць вымяралася ў кляштах напружання і/або току на працягу 2-5 хвілін. Аналіз дадзеных праводзіўся з выкарыстаннем Igor Pro (версія 7.05.2, WaveMetrics, ЗША), Excel (версія 2010, Microsoft Corporation, Рэдманд, ЗША) і GraphPad Prism (версія 8.1.2, GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Каліфорнія). Для ідэнтыфікацыі спантанных AP выкарыстоўваецца плагін IgorPro NeuroMatic v3.0c. Аўтаматычна ідэнтыфікуйце AP з выкарыстаннем зададзенага парога, які наладжваецца індывідуальна для кожнага запісу. Выкарыстоўваючы інтэрвал пікаў, вызначайце частату пікаў з максімальнай імгненнай частатой пікаў і сярэдняй частатой пікаў.
Вылучэнне PN. Адаптаваўшыся да раней апублікаванага пратакола, PN былі ачышчаны з мазжачка мышэй на пэўным этапе (58). Карацей кажучы, мазжачок быў рассячаны і здробнены ў ледзяным дысацыяцыйным асяроддзі [без HBSS Ca2+ і Mg2+, з даданнем 20 мМ глюкозы, пеніцыліну (50 адз./мл) і стрэптаміцыну (0,05 мг/мл)], а затым перавараны асяроддзе ў папаіне [HBSS, з даданнем 1-цыстэін·HCl (1 мг/мл), папаіну (16 адз./мл) і дэзоксірыбануклеазы I (ДНаза I; 0,1 мг/мл)]. Апрацоўка на працягу 30 хвілін пры тэмпературы 30°C. Спачатку прамыйце тканіны ў асяроддзі HBSS, якое змяшчае яечны слізь (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) і ДНКазу (0,1 мг/мл) пры пакаёвай тэмпературы, каб прадухіліць ферментатыўнае пераварванне, а затым у асяроддзі HBSS, якое змяшчае 20 мМ глюкозы. Акуратнае здрабненне ў HBSS, пеніцыліне (50 адз./мл), стрэптаміцыне (0,05 мг/мл) і ДНКазе (0,1 мг/мл) вызваляе адзінкавыя клеткі. Атрыманую клетачную суспензію фільтруюць праз клеткавы фільтр 70 мкм, затым клеткі асядаюць цэнтрыфугаваннем (1110 аб/мін, 5 хвілін, 4°C) і рэсуспендуюць у сартавальным асяроддзі [HBSS, дапоўнены 20 мМ глюкозай, 20% фетальнай бычынай сыроваткай, пеніцылінам (50 адз./мл) і стрэптаміцынам (0,05 мг/мл)]; ацэньвайце жыццяздольнасць клетак з дапамогай прапіюма ёдыду і даводзьце шчыльнасць клетак да 1×106 - 2×106 клетак/мл. Перад праточнай цытаметрыяй суспензію фільтравалі праз клеткавае сіта з памерамі пор 50 мкм.
Праточны цытаметр. Сартаванне клетак праводзілася пры тэмпературы 4°C з выкарыстаннем прылады FACSAria III (BD Biosciences) і праграмнага забеспячэння FACSDiva (BD Biosciences, версія 8.0.1). Клетачная суспензія сартавалася з выкарыстаннем сопла 100 мкм пад ціскам 20 фунтаў на квадратны дюйм з хуткасцю ~2800 падзей/сек. Паколькі традыцыйныя крытэрыі гейтынгу (памер клетак, бімадальная дыскрымінацыя і характарыстыкі рассейвання) не могуць забяспечыць правільнае вылучэнне PN ад іншых тыпаў клетак, стратэгія гейтынгу ўстанаўліваецца на аснове непасрэднага параўнання інтэнсіўнасці YFP і аўтафлуарэсцэнцыі ў мышэй mitoYFP+ ​​​​і кантрольных мышэй mitoYFP −. YFP узбуджаецца шляхам апраменьвання ўзору лазернай лініяй 488 нм, і сігнал выяўляецца з дапамогай паласовага фільтра 530/30 нм. У мышэй mitoYFP+ ​​​​адносная сіла рэпарцёрнага гена Rosa26-mitoYFP таксама выкарыстоўваецца для адрознення фрагментаў цела нейронаў і аксонаў. 7-AAD узбуджаецца жоўтым лазерам з даўжынёй хвалі 561 нм і дэтэгуецца з дапамогай паласовага фільтра 675/20 нм для выключэння мёртвых клетак. Каб адначасова аддзяліць астрацыты, клетачную суспензію афарбоўваюць ACSA-2-APC, затым узор апрамяняюць лазернай лініяй 640 нм, і для дэтэктавання сігналу выкарыстоўваецца паласавы фільтр 660/20 нм.
Сабраныя клеткі былі асаджаны шляхам цэнтрыфугавання (1110 аб/мін, 5 хвілін, 4°C) і захоўваны пры тэмпературы -80°C да выкарыстання. Мышы Mfn2cKO і іх дзіцяняты класіфікуюцца ў адзін дзень, каб мінімізаваць варыятыўнасць працэдуры. Прэзентацыя і аналіз дадзеных FACS праводзіліся з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння FlowJo (FlowJo LLC, Ашленд, Арэгон, ЗША).
Як ужо згадвалася вышэй (59), для вылучэння ДНК з адсартаваных нейронаў для наступнай колькаснай ацэнкі мтДНК выкарыстоўваецца ПЛР у рэжыме рэальнага часу. Лінейнасць і парогавая адчувальнасць былі спачатку правераны шляхам правядзення кПЛР на рознай колькасці клетак. Карацей кажучы, сабралі 300 PN у буферы для лізісу, які складаецца з 50 мМ трыс-HCl (pH 8,5), 1 мМ EDTA, 0,5% Tween 20 і пратэіназы K (200 нг/мл), і інкубавалі пры тэмпературы 55°C на працягу 120 хвілін. Клеткі далей інкубавалі пры тэмпературы 95°C на працягу 10 хвілін, каб забяспечыць поўную інактывацыю пратэіназы K. Выкарыстоўваючы зонд TaqMan (Thermo Fisher), спецыфічны для mt-Nd1, мтДНК вымяралі з дапамогай паўколькаснай ПЛР у сістэме 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, нумар па каталогу Mm04225274_s1), гены mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, нумар па каталогу AIVI3E8) і 18S (Thermo Fisher Scientific, нумар па каталогу Hs99999901_s1).
Падрыхтоўка ўзору пратэому. Раствор награвалі пры тэмпературы 95°C на працягу 10 хвілін і апрацоўвалі ультрагукам у буферы для лізісу [6 М гуанідын хларыду, 10 мМ трыс(2-карбаксіэтыл)фасфіну гідрахларыду, 10 мМ хлорацэтаміду і 100 мМ трыс-лізуючых нейронных гранул у HCl]. На Bioruptor (Diagenode) на працягу 10 хвілін (30 секунд імпульсу / 30 секунд паўзы). Узор разводзілі ў суадносінах 1:10 у 20 мМ трыс-HCl (pH 8,0), змешвалі з 300 нг трыпсін-золата (Promega) і інкубавалі на працягу ночы пры тэмпературы 37°C для дасягнення поўнага пераварвання. На другі дзень узор цэнтрыфугавалі пры 20 000 g на працягу 20 хвілін. Супернатант разводзілі 0,1% мурашынай кіслатой, а раствор абезсальвалі з дапамогай самаробных наканечнікаў StageTips. Узор высушылі ў прыборы SpeedVac (канцэнтратар Eppendorf plus 5305) пры тэмпературы 45°C, а затым пептыд суспендавалі ў 0,1% мурашынай кіслаце. Усе ўзоры былі падрыхтаваны адначасова адным і тым жа спецыялістам. Для аналізу ўзораў астрацытаў 4 мкг дэсалёных пептыдаў былі пазначаны тандэмнай масавай меткай (TMT10plex, нумар у каталогу 90110, Thermo Fisher Scientific) з суадносінамі пептыду і рэагента TMT 1:20. Для маркіроўкі TMT 0,8 мг рэагента TMT рэсуспендавалі ў 70 мкл бязводнага ACN, і высушаны пептыд аднавілі ў 9 мкл 0,1 М TEAB (трыэтыламоній бікарбанат), да якога дадалі 7 мкл рэагента TMT у ACN. Канцэнтрацыя склала 43,75%. Пасля 60 хвілін інкубацыі рэакцыю спынілі даданнем 2 мкл 5% гідраксіламіну. Пазначаныя пептыды збіралі, высушвалі, рэсуспендавалі ў 200 мкл 0,1% мурашынай кіслаты (КК), падзелілі на дзве часткі, а затым обессолівалі з дапамогай самаробных наканечнікаў StageTips. З дапамогай звышвысокаэфектыўнага вадкаснага храматографа UltiMate 3000 (звышвысокаэфектыўнага вадкаснага храматографа UltiMate 3000) адну з дзвюх паловак фракцыянавалі на храматаграфічнай калонцы Acquity памерам 1 мм х 150 мм, запоўненай часціцамі C18 памерам 130 Å1,7 мкм (Waters, каталожны нумар SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Падзялялі пептыды пры хуткасці патоку 30 мкл/мін, падзялялі ад 1% да 50% буфера B на працягу 85 хвілін з паэтапным градыентам 96 хвілін, ад 50% да 95% буфера B на працягу 3 хвілін, затым 8 хвілін для 95% буфера B; Буфер А складаецца з 5% ACN і 10 мМ бікарбанату амонію (ABC), а буфер B — з 80% ACN і 10 мМ ABC. Збірайце фракцыі кожныя 3 хвіліны, аб'ядноўвайце іх у дзве групы (1 + 17, 2 + 18 і г.д.) і сушыце ў вакуумнай цэнтрыфузе.
Аналіз LC-MS/MS. Для мас-спектрометрыі пептыды (нумар r119.aq) былі падзелены на аналітычнай калонцы PicoFrit 25 см, унутраным дыяметрам 75 мкм (новы аб'ектыў, нумар дэталі PF7508250), абсталяванай асяроддзем ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 мкм (Dr. Maisch, мат), выкарыстоўвалі EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Германія). Калонка падтрымлівалася пры тэмпературы 50°C. Буферы А і В — гэта 0,1% мурашыная кіслата ў вадзе і 0,1% мурашыная кіслата ў 80% ACN адпаведна. Пептыды былі падзелены з 6% да 31% буфера В на працягу 65 хвілін і з 31% да 50% буфера В на працягу 5 хвілін з градыентам 200 нл/мін. Элюяваныя пептыды былі прааналізаваны на мас-спектрометры Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Вымярэнне m/z пептыднага папярэдніка праводзіцца з дазволам 120 000 у дыяпазоне ад 350 да 1500 m/z. Выкарыстоўваючы 27% нармалізаванай энергіі сутыкнення, наймацнейшы папярэднік з зарадавым станам ад 2 да 6 выбіраецца для расшчаплення дысацыяцыяй C-пасткі высокай энергіі (HCD). Час цыклу ўстанаўліваецца на 1 с. Значэнне m/z пептыднага фрагмента вымяралася ў іённай пастцы з выкарыстаннем найменшай мішэні AGC 5×104 і максімальнага часу інжэкцыі 86 мс. Пасля фрагментацыі папярэднік быў змешчаны ў спіс дынамічнага выключэння на 45 с. Пептыды, пазначаныя TMT, былі раздзелены на калонцы Acclaim PepMap 50 см, 75 мкм (Thermo Fisher Scientific, нумар у каталогу 164942), а спектры міграцыі былі прааналізаваны на мас-спектрометры Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific), абсталяваным абсталяваннем для высокапалявых асіметрычных іёнаў з формай хвалі (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific), які працуе пры двух кампенсацыйных напружаннях -50 і -70 В. MS3, абраны на аснове папярэдніка сінхранізацыі, выкарыстоўваецца для вымярэння сігналу іёнаў-паведамляльнікаў TMT. Падзел пептыдаў праводзіўся на EASY-nLC 1200 з выкарыстаннем лінейнага градыентнага элюцыі 90% з канцэнтрацыяй буфера ад 6% да 31%; буфер А складаў 0,1% FA, а буфер B складаў 0,1% FA і 80% ACN. Аналітычная калонка працавала пры тэмпературы 50°C. Выкарыстоўвайце FreeStyle (версія 1.6, Thermo Fisher Scientific) для падзелу зыходнага файла ў адпаведнасці з кампенсацыйным напружаннем FAIMS.
Ідэнтыфікацыя і колькасная ацэнка бялку. З дапамогай інтэграванай пошукавай сістэмы Andromeda зыходныя дадзеныя былі прааналізаваны з дапамогай MaxQuant версіі 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Акрамя паслядоўнасцей рэкамбіназы Cre і YFP, атрыманых з Aequorea victoria, былі праведзены пошук спектраў пептыдных фрагментаў на прадмет кананічнай паслядоўнасці і ізаформнай паслядоўнасці эталоннага пратэома мышы (ідэнтыфікатар пратэома UP000000589, спампаваны з UniProt у маі 2017 г.). Акісленне метыяніну і N-канцавое ацэтыляванне бялку былі зададзены як зменныя мадыфікацыі; метыляванне карбамоілу цыстэіну было зададзена як фіксаваныя мадыфікацыі. Параметры пераварвання ўстаноўлены на «спецыфічнасць» і «трыпсін/P». Мінімальная колькасць пептыдаў і пептыдаў razor, якія выкарыстоўваюцца для ідэнтыфікацыі бялку, складае 1; мінімальная колькасць унікальных пептыдаў - 0. Ва ўмовах супастаўлення пептыднай карты хуткасць ідэнтыфікацыі бялку склала 0,01. Опцыя «Другі пептыд» уключана. Выкарыстоўвайце опцыю «супастаўленне паміж прагонамі» для перадачы паспяховых ідэнтыфікацый паміж рознымі зыходнымі файламі. Выкарыстоўвайце мінімальнае суадносіны LFQ падлік 1 для колькаснай ацэнкі без пазнак (LFQ) (60). Інтэнсіўнасць LFQ фільтруецца як мінімум па двух сапраўдных значэннях як мінімум у адной групе генатыпаў у кожны момант часу і экстрапалюецца з нармальнага размеркавання з шырынёй 0,3 і зрушваецца ўніз на 1,8. Выкарыстоўвайце вылічальную платформу Perseus (https://maxquant.net/perseus/) і R (https://r-project.org/) для аналізу вынікаў LFQ. Для аналізу дыферэнцыяльнай экспрэсіі выкарыстоўваўся двухбаковы ўмераны t-крытэрый з праграмнага пакета limma (61). Даследчы аналіз дадзеных праводзіцца з выкарыстаннем ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally і pheatmap. Дадзеныя пратэомікі на аснове TMT былі прааналізаваны з выкарыстаннем MaxQuant версіі 1.6.10.43. Шукайце неапрацаваныя дадзеныя пратэомікі ў базе дадзеных пратэомікі чалавека UniProt, якая была загружана ў верасні 2018 года. Аналіз уключае карэкцыйны каэфіцыент ізатопнай чысціні, прадастаўлены вытворцам. Выкарыстоўвайце ліму ў R для аналізу дыферэнцыяльных выразаў. Зыходныя дадзеныя, вынікі пошуку ў базе дадзеных, а таксама працоўны працэс і вынікі аналізу дадзеных захоўваюцца ў альянсе ProteomeXchange праз партнёрскі рэпазітар PRIDE з ідэнтыфікатарам набору дадзеных PXD019690.
Функцыянальныя анатацыі ўзбагачаюць аналіз. Для вызначэння багацця тэрмінаў функцыянальнай анатацыі ў наборы дадзеных праз 8 тыдняў быў выкарыстаны інструмент Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) (Малюнак 1). Карацей кажучы, колькасны спіс бялкоў, атрыманы ў выніку аналізу дадзеных LC-MS/MS (тандэмная мас-спектрометрыя), выкарыстоўваецца з наступнымі крытэрыямі фільтрацыі: Mus musculus абраны ў якасці віду і фону, а катэгорыя паказвае, што значэнне P, скарэкціраванае па Бенджаміні для ўзбагачэння 0,05 або ніжэй, лічыцца значным. Для гэтага графіка паказаны пяць самых высокіх лішніх катэгорый у кожным кластары на аснове скарэкціраванага значэння P. Выкарыстоўваючы множны t-крытэрый, выкарыстоўваючы двухэтапную лінейную праграму ўзмацнення Бенджаміні, Крыгера і Екуціелі (Q = 5%), праводзіцца аналіз экспрэсіі бялкоў з улікам часу для важных кандыдатаў, вызначаных у кожнай катэгорыі, і кожны радок аналізуецца асобна. Няма неабходнасці прымаць паслядоўнае стандартнае адхіленне.
Каб параўнаць вынікі гэтага даследавання з апублікаванымі базамі дадзеных і стварыць дыяграму Вена на малюнку 1, мы аб'ядналі колькасны спіс бялкоў з анатацыямі MitoCarta 2.0 (24). Для стварэння дыяграмы выкарыстоўвайце анлайн-інструмент Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Падрабязную інфармацыю аб статыстычных працэдурах, якія выкарыстоўваюцца для пратэомнага аналізу, можна знайсці ў адпаведным раздзеле "Матэрыялы і метады". Падрабязную інфармацыю аб усіх астатніх эксперыментах можна знайсці ў адпаведнай легендзе. Калі не пазначана іншае, усе дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± SEM, і ўсе статыстычныя аналізы былі выкананы з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння GraphPad Prism 8.1.2.
Дадатковыя матэрыялы да гэтага артыкула можна знайсці па спасылцы http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Гэты артыкул знаходзіцца ў адкрытым доступе і распаўсюджваецца ў адпаведнасці з умовамі ліцэнзіі Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, якая дазваляе выкарыстанне, распаўсюджванне і прайграванне на любым носьбіце, калі канчатковае выкарыстанне не мае камерцыйнай выгады, і перадумовай з'яўляецца правільнасць арыгінальнага твора. Спасылка.
Заўвага: Мы просім вас падаць свой адрас электроннай пошты толькі для таго, каб чалавек, якога вы рэкамендуеце для старонкі, ведаў, што вы хочаце, каб ён бачыў ліст, і што гэта не спам. Мы не будзем фіксаваць ніякіх адрасоў электроннай пошты.
Гэтае пытанне выкарыстоўваецца для праверкі таго, ці з'яўляецеся вы наведвальнікам, і для прадухілення аўтаматычнай рассылкі спаму.
Э. Маторы, І. Атанасаў, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донах'ю, В. Сактывалу, П. Джаваліска, Н. Тоні, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсан
Пратэомны аналіз дысфункцыянальных нейронаў паказаў, што метабалічныя праграмы актывуюцца для супрацьдзеяння нейрадэгенерацыі.
Э. Маторы, І. Атанасаў, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донах'ю, В. Сактывалу, П. Джаваліска, Н. Тоні, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсан
Пратэомны аналіз дысфункцыянальных нейронаў паказаў, што метабалічныя праграмы актывуюцца для супрацьдзеяння нейрадэгенерацыі.
©2020 Амерыканская асацыяцыя садзейнічання развіццю навукі. усе правы абаронены. AAAS з'яўляецца партнёрам HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.