Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для дасягнення найлепшых вынікаў рэкамендуем выкарыстоўваць больш новую версію браўзера (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Прапіёнавая кіслата (ППК) выкарыстоўваецца для вывучэння ролі мітахондрыяльнай дысфункцыі ў нейраразвіццёвых парушэннях, такіх як расстройства аўтыстычнага спектру. Вядома, што ППК парушае біягенез, метабалізм і абнаўленне мітахондрыял. Аднак уплыў ППК на дынаміку, дзяленне і зліццё мітахондрыял застаецца праблематычным з-за складанай часовай прыроды гэтых механізмаў. Тут мы выкарыстоўваем дадатковыя метады колькаснай візуалізацыі, каб даследаваць, як ППК уплывае на ультраструктуру, марфалогію і дынаміку мітахондрыял у нейронападобных клетках SH-SY5Y. ППК (5 мМ) выклікала значнае памяншэнне плошчы мітахондрыял (p < 0,01), дыяметра і акружнасці Ферэта (p < 0,05) і плошчы 2 (p < 0,01). Аналіз лакатара мітахондрыяльных падзей паказаў значнае павелічэнне (p < 0,05) падзей дзялення і зліцця, тым самым падтрымліваючы цэласнасць мітахондрыяльнай сеткі ў стрэсавых умовах. Акрамя таго, экспрэсія мРНК cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) і OPA1 (p < 0,05) была значна зніжана. 01). Гэта ілюструе перабудову марфалогіі, біягенезу і дынамікі мітахондрый для падтрымання функцыі ў стрэсавых умовах. Нашы дадзеныя даюць новае разуменне ўплыву PPA на дынаміку мітахондрый і падкрэсліваюць карыснасць метадаў візуалізацыі для вывучэння складаных рэгуляторных механізмаў, якія ўдзельнічаюць у рэакцыях мітахондрый на стрэс.
Мітахондрыі з'яўляюцца неад'емнымі ўдзельнікамі розных клетачных функцый, якія выходзяць за рамкі іх тыповых роляў у вытворчасці энергіі і біясінтэзе. Мітахондрыяльны метабалізм з'яўляецца ключавым рэгулятарам кальцыевай сігналізацыі, метабалічнага і акісляльна-аднаўленчага гамеастазу, запаленчай сігналізацыі, эпігенетычных мадыфікацый, праліферацыі клетак, дыферэнцыяцыі і запраграмаванай клетачнай смерці1. У прыватнасці, мітахондрыяльны метабалізм мае вырашальнае значэнне для развіцця, выжывання і функцыянавання нейронаў і шырока ўдзельнічае ў розных праявах неўрапаталогіі2,3,4.
За апошняе дзесяцігоддзе метабалічны статус стаў цэнтральным рэгулятарам нейрагенезу, дыферэнцыяцыі, паспявання і пластычнасці5,6. Нядаўна марфалогія і дынаміка мітахондрый сталі асабліва важнымі кампанентамі мітозу, дынамічнага працэсу, які падтрымлівае пул здаровых мітахондрый у клетках. Дынаміка мітахондрый рэгулюецца складанымі ўзаемазалежнымі шляхамі, пачынаючы ад мітахондрыяльнага біягенезу і біяэнергетыкі і заканчваючы мітахондрыяльным дзяленнем, зліццём, транспартам і клірэнсам7,8. Парушэнне любога з гэтых інтэгратыўных механізмаў пагаршае падтрыманне здаровых мітахондрыяльных сетак і мае глыбокія функцыянальныя наступствы для нейраразвіцця9,10. Сапраўды, парушэнне рэгуляцыі мітахондрыяльнай дынамікі назіраецца пры многіх псіхіятрычных, нейрадэгенератыўных і нейраразвіццёвых засмучэннях, у тым ліку расстройствах аўтыстычнага спектру (РАС)11,12.
РАС — гэта гетэрагеннае нейраразвіццёвае захворванне са складанай генетычнай і эпігенетычнай архітэктурай. Спадчыннасць РАС не аспрэчваецца, але малекулярная этыялогія, якая ляжыць у яго аснове, застаецца недастаткова вывучанай. Назапашаныя дадзеныя з даклінічных мадэляў, клінічных даследаванняў і мультыомічных малекулярных набораў дадзеных даюць усё больш доказаў мітахондрыяльнай дысфункцыі пры РАС13,14. Раней мы правялі поўнагеномны скрынінг метылявання ДНК у кагорце пацыентаў з РАС і вызначылі дыферэнцыяльна метыляваныя гены, кластарныя ўздоўж мітахондрыяльных метабалічных шляхоў15. Пасля мы паведамілі пра дыферэнцыяльнае метыляванне цэнтральных рэгулятараў мітахондрыяльнага біягенезу і дынамікі, якое было звязана з павелічэннем колькасці копій мтДНК і змененым метабалічным профілем мачы пры РАС16. Нашы дадзеныя даюць усё больш доказаў таго, што мітахондрыяльная дынаміка і гамеастаз гуляюць цэнтральную ролю ў патафізіялогіі РАС. Такім чынам, паляпшэнне механістычнага разумення ўзаемасувязі паміж мітахондрыяльнай дынамікай, марфалогіяй і функцыяй з'яўляецца ключавой мэтай бягучых даследаванняў неўралагічных захворванняў, якія характарызуюцца другаснай мітахондрыяльнай дысфункцыяй.
Малекулярныя метады часта выкарыстоўваюцца для вывучэння ролі спецыфічных генаў у рэакцыях мітахондрый на стрэс. Аднак гэты падыход можа быць абмежаваны шматграннай і часовай прыродай механізмаў мітатычнага кантролю. Больш за тое, дыферэнцыяльная экспрэсія мітахондрыяльных генаў з'яўляецца ўскосным паказчыкам функцыянальных змен, асабліва таму, што звычайна аналізуецца толькі абмежаваная колькасць генаў. Таму былі прапанаваны больш прамыя метады вывучэння функцыі мітахондрый і біяэнергетыкі17. Марфалогія мітахондрый цесна звязана з дынамікай мітахондрый. Форма, злучэнне і структура мітахондрый маюць вырашальнае значэнне для выпрацоўкі энергіі і выжывання мітахондрый і клетак5,18. Больш за тое, розныя кампаненты мітозу сканцэнтраваны на зменах у марфалогіі мітахондрый, якія могуць служыць карыснымі канчатковымі кропкамі мітахондрыяльнай дысфункцыі і забяспечваць аснову для наступных механістычных даследаванняў.
Марфалогію мітахондрый можна непасрэдна назіраць з дапамогай прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (ПЭМ), што дазваляе дэталёва вывучаць ультраструктуру клетак. ПЭМ непасрэдна візуалізуе марфалогію, форму і структуру мітахондрыяльных крыст пры разрозненні асобных мітахондрый, а не абапіраецца выключна на транскрыпцыю генаў, экспрэсію бялкоў або функцыянальныя параметры мітахондрый у папуляцыях клетак17,19,20. Акрамя таго, ПЭМ спрыяе вывучэнню ўзаемадзеяння паміж мітахондрыямі і іншымі арганэламі, такімі як эндаплазматычная сетка і аўтафагасомы, якія адыгрываюць ключавую ролю ў функцыі мітахондрый і гамеастазе21,22. Такім чынам, гэта робіць ПЭМ добрым адпраўным пунктам для вывучэння дысфункцыі мітахондрый, перш чым засяродзіцца на канкрэтных шляхах або генах. Паколькі функцыя мітахондрый становіцца ўсё больш актуальнай для неўрапаталогіі, існуе відавочная неабходнасць мець магчымасць непасрэдна і колькасна вывучаць марфалогію і дынаміку мітахондрый у нейрональных мадэлях in vitro.
У гэтым артыкуле мы разглядаем дынаміку мітахондрый у нейрональнай мадэлі мітахондрыяльнай дысфункцыі пры расстройствах аўтыстычнага спектру. Раней мы паведамлялі пра дыферэнцыяльнае метыляванне прапіёніл-КоА-карбаксілазы бэта (PCCB) у ASD15, субадзінцы мітахандрыяльнага фермента прапіёніл-КоА-карбаксілазы PCC. Вядома, што парушэнне рэгуляцыі PCC выклікае таксічнае назапашванне прапіёнільных вытворных, у тым ліку прапіёнавай кіслаты (PPA)23,24,25. Было паказана, што PPA парушае нейрональны метабалізм і змяняе паводзіны in vivo і з'яўляецца ўсталяванай жывёльнай мадэллю для вывучэння нейраразвіццёвых механізмаў, якія ўдзельнічаюць у ASD26,27,28. Акрамя таго, паведамлялася, што PPA парушае патэнцыял мітахондрыяльнай мембраны, біягенез і дыханне in vitro і шырока выкарыстоўваецца для мадэлявання мітахондрыяльнай дысфункцыі ў нейронах29,30. Аднак уплыў выкліканай PPA мітахондрыяльнай дысфункцыі на марфалогію і дынаміку мітахондрый застаецца недастаткова вывучаным.
У гэтым даследаванні выкарыстоўваюцца дадатковыя метады візуалізацыі для колькаснай ацэнкі ўплыву PPA на марфалогію, дынаміку і функцыю мітахондрый у клетках SH-SY5Y. Спачатку мы распрацавалі метад TEM для візуалізацыі змяненняў у марфалогіі і ультраструктуры мітахондрый17,31,32. Улічваючы дынамічную прыроду мітахондрый33, мы таксама выкарысталі аналіз лакалізатара мітахондрыйных падзей (MEL) для колькаснай ацэнкі змяненняў у балансе паміж падзеямі дзялення і зліцця, колькасці і аб'ёму мітахондрый пры стрэсе PPA. Нарэшце, мы вывучылі, ці звязаны марфалогія і дынаміка мітахондрый са зменамі ў экспрэсіі генаў, якія ўдзельнічаюць у біягенезе, дзяленні і зліцці. У сукупнасці нашы дадзеныя ілюструюць праблему высвятлення складанасці механізмаў, якія рэгулююць дынаміку мітахондрый. Мы падкрэсліваем карыснасць TEM пры вывучэнні марфалогіі мітахондрый як вымернай канвергентнай канчатковай кропкі мітозу ў клетках SH-SY5Y. Акрамя таго, мы падкрэсліваем, што дадзеныя TEM даюць найбольш багатую інфармацыю ў спалучэнні з метадамі візуалізацыі, якія таксама фіксуюць дынамічныя падзеі ў адказ на метабалічны стрэс. Далейшая характарыстыка малекулярных рэгуляторных механізмаў, якія падтрымліваюць мітоз нейрональных клетак, можа даць важнае разуменне мітахондрыяльнага кампанента нервовай сістэмы і нейрадэгенератыўных захворванняў.
Каб выклікаць мітахандрыяльны стрэс, клеткі SH-SY5Y апрацоўвалі PPA з выкарыстаннем 3 мМ і 5 мМ прапіянату натрыю (NaP). Перад TEM узоры падвяргалі крыягеннай падрыхтоўцы з выкарыстаннем замарожвання пад высокім ціскам і замарожвання (мал. 1a). Мы распрацавалі аўтаматызаваны канвеер аналізу мітахондрыяльных малюнкаў для вымярэння васьмі марфалагічных параметраў мітахондрыяльных папуляцый у трох біялагічных паўторах. Мы выявілі, што апрацоўка PPA значна змяніла чатыры параметры: плошчу 2, плошчу, перыметр і дыяметр Ферэта (мал. 1b-e). Плошча 2 значна паменшылася як пры апрацоўцы 3 мМ, так і 5 мМ PPA (p = 0,0183 і p = 0,002 адпаведна) (мал. 1b), у той час як плошча (p = 0,003), перыметр (p = 0,0106) і дыяметр Ферэта значна знізіліся. У групе, якая атрымлівала 5 мМ, назіралася значнае зніжэнне (p = 0,0172) у параўнанні з кантрольнай групай (мал. 1c-e). Значнае скарачэнне плошчы і акружнасці паказала, што клеткі, апрацаваныя 5 мМ PPA, мелі меншыя, больш круглявыя мітахондрыі, і што гэтыя мітахондрыі былі менш выцягнутымі, чым у кантрольных клетках. Гэта таксама адпавядае значнаму зніжэнню дыяметра Ферэ, незалежнага параметра, які сведчыць аб памяншэнні найбольшай адлегласці паміж краямі часціц. Назіраліся змены ў ультраструктуры крыст: крысты сталі менш выяўленымі пад уплывам стрэсу PPA (мал. 1a, панэль B). Аднак не ўсе выявы выразна адлюстроўвалі ультраструктуру крыст, таму колькасны аналіз гэтых змен не праводзіўся. Гэтыя дадзеныя ПЭМ могуць адлюстроўваць тры магчымыя сцэнарыі: (1) PPA ўзмацняе дзяленне або інгібіруе зліццё, што прыводзіць да памяншэння памераў існуючых мітахондрый; (2) узмоцнены біягенез стварае новыя, меншыя мітахондрыі або (3) адначасова індукуе абодва механізмы. Нягледзячы на ​​тое, што гэтыя ўмовы нельга адрозніць з дапамогай ПЭМ, значныя марфалагічныя змены сведчаць аб зменах у гамеастазе і дынаміцы мітахондрый пры стрэсе PPA. Пасля гэтага мы даследавалі дадатковыя параметры для далейшай характарыстыкі гэтай дынамікі і патэнцыйных механізмаў, якія ляжаць у аснове яе.
Прапіёнавая кіслата (PPA) перабудоўвае марфалогію мітахондрый. (a) Тыповыя выявы прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (TEM), якія паказваюць, што памер мітахондрый памяншаецца, а мітахондрыі становяцца меншымі і больш круглявымі са павелічэннем апрацоўкі PPA; 0 мМ (неапрацаваныя), 3 мМ і 5 мМ адпаведна. Чырвоныя стрэлкі паказваюць мітахондрыі. (b–e) Клеткі SH-SY5Y, апрацаваныя PPA на працягу 24 гадзін, былі падрыхтаваны для TEM, і вынікі былі прааналізаваны з дапамогай Fiji/ImageJ. Чатыры з васьмі параметраў паказалі значныя адрозненні паміж кантрольнымі (неапрацаванымі, 0 мМ PPA) і апрацаванымі (3 мМ і 5 мМ PPA) клеткамі. (b) Вобласць 2, (c) Плошча, (d) Перыметр, (e) Дыяметр Ферэта. Для вызначэння значных адрозненняў (p < 0,05) выкарыстоўваліся аднабаковы дысперсійны аналіз (кантроль супраць апрацоўкі) і тэст множнага параўнання Данэта. Кропкі дадзеных прадстаўляюць сярэдняе значэнне мітахондрый для кожнай асобнай клеткі, а палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± SEM. Паказаныя дадзеныя прадстаўляюць n = 3, не менш за 24 клеткі на паўтарэнне; усяго было прааналізавана 266 малюнкаў; * азначае p < 0,05, ** азначае p < 0,01.
Каб далей ахарактарызаваць рэакцыю дынамікі мітахондрый на PPA, мы афарбавалі мітахондрыі этылавым эфірам тэтраметылрадаміна (TMRE) і выкарысталі пакадравую мікраскапію і MEL-аналіз для лакалізацыі і колькаснай ацэнкі мітахондрый праз 24 гадзіны пры 3 і 5 мМ PPA. Апрацоўка падзей дзялення і зліцця. (Мал. 2a). Пасля MEL-аналізу мітахондрыі былі дадаткова прааналізаваны для колькаснай ацэнкі колькасці мітахондрыйных структур і іх сярэдняга аб'ёму. Мы назіралі невялікае, але значнае павелічэнне колькасці падзей дзялення, якія адбываліся пры 3 мМ [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] у параўнанні з дзяленнем [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] і зліццём [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)], а таксама зліццём [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] < 0,05)], якія значна павялічыліся пры 5 мМ у параўнанні з кантролем (Мал. 3b). Колькасць мітахондрый значна павялічылася як пры 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], так і пры 5 мМ [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (мал. 3c), у той час як сярэдні аб'ём кожнай мітахондрыяльнай структуры заставаўся нязменным (мал. 3c). У сукупнасці гэта сведчыць аб тым, што перабудова дынамікі мітахондрый служыць кампенсацыйнай рэакцыяй, якая паспяхова падтрымлівае цэласнасць мітахондрыяльнай сеткі. Павелічэнне колькасці падзей дзялення пры 3 мМ PPA сведчыць аб тым, што павелічэнне колькасці мітахондрый часткова абумоўлена дзяленнем мітахондрый, але, улічваючы, што сярэдні аб'ём мітахондрый застаецца практычна нязменным, біягенез нельга выключаць як дадатковую кампенсацыйную рэакцыю. Аднак гэтыя дадзеныя адпавядаюць меншым круглым мітахондрыяльным структурам, якія назіраюцца з дапамогай ПЭМ, а таксама дэманструюць значныя змены ў дынаміцы мітахондрый, выкліканыя PPA.
Прапіёнавая кіслата (PPA) індукуе дынамічную перабудову мітахондрыял для падтрымання цэласнасці сеткі. Клеткі SH-SY5Y культывавалі, апрацоўвалі 3 і 5 мМ PPA на працягу 24 гадзін і афарбоўвалі TMRE і Hoechst 33342 з наступным MEL-аналізам. (a) Тыповыя выявы пакадравай мікраскапіі, якія адлюстроўваюць колер і бінарызаваныя праекцыі максімальнай інтэнсіўнасці ў момант часу 2 (t2) для кожнай умовы. Абраныя вобласці, пазначаныя на кожнай бінарнай выяве, палепшаны і адлюстраваны ў 3D у трох розных часовых інтэрвалах (t1-t3) для ілюстрацыі дынамікі з цягам часу; падзеі зліцця выдзелены зялёным колерам; падзеі дзялення выдзелены зялёным колерам. Паказаны чырвоным колерам. (b) Сярэдняя колькасць дынамічных падзей на ўмову. (c) Сярэдняя колькасць мітахондрыяльных структур на клетку. (d) Сярэдні аб'ём (мкм3) кожнай мітахондрыяльнай структуры на клетку. Паказаныя дадзеныя тычацца n = 15 клетак на групу лячэння. Паказаныя палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± SEM, маштабная палоска = 10 мкм, * p < 0,05.
Прапіёнавая кіслата (PPA) выклікае падаўленне транскрыпцыі генаў, звязаных з дынамікай мітахондрыял. Клеткі SH-SY5Y апрацоўвалі 3 і 5 мМ PPA на працягу 24 гадзін. Адносная колькасная ацэнка генаў была праведзена з дапамогай RT-qPCR і нармалізавана да B2M. Гены мітахондрыяльнага біягенезу (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 і (d) NFE2L2. Гены зліцця і дзялення мітахондрыял (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 і (i) DRP1. Значныя адрозненні (p < 0,05) былі правераны з дапамогай аднафактарнага ANOVA (кантроль супраць лячэння) і тэсту множнага параўнання Данэта: * азначае p < 0,05, ** азначае p < 0,01, а **** азначае p < 0,0001. Слупкі прадстаўляюць сярэднюю экспрэсію ± SEM. Паказаныя дадзеныя прадстаўляюць n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) і n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) біялагічных паўтораў.
Дадзеныя аналізаў TEM і MEL разам паказваюць, што PPA змяняе марфалогію і дынаміку мітахондрый. Аднак гэтыя метады візуалізацыі не даюць уяўлення аб асноўных механізмах, якія рухаюць гэтымі працэсамі. Таму мы даследавалі экспрэсію мРНК дзевяці ключавых рэгулятараў дынамікі мітахондрый, біягенезу і мітозу ў адказ на лячэнне PPA. Мы колькасна вызначылі анкаген клетачнай міеломы (cMYC), ядзерны дыхальны фактар ​​(NRF1), мітахандрыяльны транскрыпцыйны фактар ​​1 (TFAM), NFE2-падобны транскрыпцыйны фактар ​​BZIP (NFE2L2), гастрын-падобны бялок 2 (STOML2), атрафію глядзельнага нерва 1 (OPA1), мітафузін 1 (MFN1), мітафузін 2 (MFN2) і дынамін-роднасны бялок 1 (DRP1) пасля 24 гадзін апрацоўкі 3 мМ і 5 мМ PPA. Мы назіралі апрацоўку PPA ў канцэнтрацыі 3 мМ (p = 0,0053, p = 0,0415 і p < 0,0001 адпаведна) і 5 мМ (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) (мал. 3a–c). Зніжэнне экспрэсіі мРНК залежала ад дозы: экспрэсія cMYC, NRF1 і TFAM зніжалася ў 5,7, 2,6 і 1,9 раза пры 3 мМ адпаведна і ў 11,2, 3 і 2,2 раза пры 5 мМ. Наадварот, цэнтральны ген рэдокс-біягенезу NFE2L2 не змяняўся ні пры адной канцэнтрацыі PPA, хоць назіралася падобная дозазалежная тэндэнцыя зніжэння экспрэсіі (мал. 3d).
Мы таксама даследавалі экспрэсію класічных генаў, якія ўдзельнічаюць у рэгуляцыі дзялення і зліцця. Лічыцца, што STOML2 удзельнічае ў зліцці, мітафагіі і біягенезе, і яго экспрэсія была значна зніжана (p < 0,0001) пры 3 мМ (змяненне ў 2,4 раза) і 5 мМ (змяненне ў 2,8 раза) PPA (мал. 1). 3d). Падобным чынам, экспрэсія гена зліцця OPA1 была зніжана пры 3 мМ (змяненне ў 1,6 раза) і 5 мМ (змяненне ў 1,9 раза) PPA (p = 0,006 і p = 0,0024 адпаведна) (мал. 3f). Аднак мы не выявілі істотных адрозненняў у экспрэсіі генаў зліцця MFN1, MFN2 або гена дзялення DRP1 пры 24-гадзінным стрэсе PPA (мал. 3g–i). Акрамя таго, мы выявілі, што ўзроўні чатырох бялкоў зліцця і дзялення (OPA1, MFN1, MFN2 і DRP1) не змяняліся ў аднолькавых умовах (мал. 4a–d). Важна адзначыць, што гэтыя дадзеныя адлюстроўваюць адзін момант часу і могуць не адлюстроўваць змены ў экспрэсіі бялкоў або ўзроўнях актыўнасці на ранніх стадыях стрэсу, выкліканага PPA. Аднак значнае зніжэнне экспрэсіі cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 і OPA1 сведчыць аб значнай транскрыпцыйнай дысрэгуляцыі мітахондрыяльнага метабалізму, біягенезу і дынамікі. Акрамя таго, гэтыя дадзеныя падкрэсліваюць карыснасць метадаў візуалізацыі для непасрэднага вывучэння змен канчатковага стану мітахондрыяльнай функцыі.
Узроўні бялку фактараў зліцця і дзялення не змяніліся пасля апрацоўкі прапіёнавай кіслатой (PPA). Клеткі SH-SY5Y апрацоўвалі 3 і 5 мМ PPA на працягу 24 гадзін. Узроўні бялку былі колькасна вызначаны з дапамогай вестэрн-блот аналізу, а ўзроўні экспрэсіі былі нармалізаваны да агульнага бялку. Паказаны сярэдняя экспрэсія бялку і рэпрэзентатыўныя вестэрн-блоты мішэні і агульнага бялку. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Слупкі прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± SEM, і паказаныя дадзеныя рэпрэзентатыўныя для n = 3 біялагічных паўтораў. Множныя параўнанні (p < 0,05) былі праведзены з выкарыстаннем аднафактарнага дысперсійнага аналізу і тэсту Данэта. Зыходны гель і блот паказаны на малюнку S1.
Мітахандрыяльная дысфункцыя асацыюецца з мультысістэмнымі захворваннямі, пачынаючы ад метабалічных, сардэчна-сасудзістых і мышачных і заканчваючы неўралагічнымі захворваннямі1,10. Многія нейрадэгенератыўныя і нейрадэгенератыўныя захворванні звязаны з мітахандрыяльнай дысфункцыяй, што падкрэслівае важнасць гэтых арганэл на працягу ўсяго жыцця мозгу. Да гэтых захворванняў адносяцца хвароба Паркінсана, хвароба Альцгеймера і РАС3,4,18. Аднак доступ да тканіны мозгу для вывучэння гэтых захворванняў абцяжараны, асабліва на механістычным узроўні, што робіць клетачныя мадэльныя сістэмы неабходнай альтэрнатывай. У гэтым даследаванні мы выкарыстоўваем клетачную мадэльную сістэму з выкарыстаннем клетак SH-SY5Y, апрацаваных PPA, для рэкапітуляцыі мітахандрыяльнай дысфункцыі, якая назіраецца пры нейрональных захворваннях, асабліва пры расстройствах аўтыстычнага спектру. Выкарыстанне гэтай мадэлі PPA для вывучэння дынамікі мітахандрыяльных захворванняў у нейронах можа даць уяўленне аб этыялогіі РАС.
Мы даследавалі магчымасць выкарыстання ПЭМ для назірання за зменамі ў марфалогіі мітахондрыял. Важна адзначыць, што ПЭМ неабходна выкарыстоўваць правільна, каб максімальна павялічыць яго эфектыўнасць. Падрыхтоўка крыягенных узораў дазваляе лепш захаваць нейрональныя структуры, адначасова фіксуючы клеткавыя кампаненты і памяншаючы ўтварэнне артэфактаў34. У адпаведнасці з гэтым мы назіралі, што нейронападобныя клеткі SH-SY5Y мелі непашкоджаныя субклеткавыя арганэлы і падоўжаныя мітахондрыі (мал. 1a). Гэта падкрэслівае карыснасць крыягенных метадаў падрыхтоўкі для вывучэння марфалогіі мітахондрыял у мадэлях нейрональных клетак. Нягледзячы на ​​тое, што колькасныя вымярэнні маюць вырашальнае значэнне для аб'ектыўнага аналізу дадзеных ПЭМ, да гэтага часу няма адзінага меркавання адносна таго, якія канкрэтныя параметры павінны вымярацца для пацверджання марфалагічных змен мітахондрыял. На падставе вялікай колькасці даследаванняў, якія колькасна даследавалі марфалогію мітахондрыял17,31,32, мы распрацавалі аўтаматызаваны канвеер аналізу малюнкаў мітахондрыял, які вымярае восем марфалагічных параметраў, а менавіта: плошчу, плошчу2, суадносіны бакоў, перыметр, кругласць, градус, дыяметр Ферэ і кругласць.
Сярод іх, PPA значна паменшыў плошчу 2, плошчу, перыметр і дыяметр Ферэ (мал. 1b–e). Гэта паказала, што мітахондрыі сталі меншымі і больш круглявымі, што адпавядае папярэднім даследаванням, якія паказвалі памяншэнне плошчы мітахондрый пасля 72 гадзін мітахондрыяльнага стрэсу, выкліканага PPA30. Гэтыя марфалагічныя асаблівасці могуць сведчыць аб дзяленні мітахондрый, неабходным працэсе для секвестрацыі пашкоджаных кампанентаў з мітахондрыяльнай сеткі, каб спрыяць іх дэградацыі праз мітафагію35,36,37. З іншага боку, памяншэнне сярэдняга памеру мітахондрый можа быць звязана з павелічэннем біягенезу, што прыводзіць да ўтварэння невялікіх новых мітахондрый. Павелічэнне дзялення або біягенезу ўяўляе сабой кампенсаторную рэакцыю для падтрымання мітозу супраць мітахондрыяльнага стрэсу. Аднак нельга выключаць зніжэнне росту мітахондрый, парушэнне зліцця або іншыя станы.
Нягледзячы на ​​тое, што выявы з высокім разрозненнем, створаныя з дапамогай ПЭМ, дазваляюць вызначаць марфалагічныя характарыстыкі на ўзроўні асобных мітахондрый, гэты метад стварае двухмерныя здымкі ў адзін момант часу. Для вывучэння дынамічных рэакцый на метабалічны стрэс мы афарбавалі мітахондрыі з дапамогай TMRE і выкарысталі пакадравую мікраскапію з MEL-аналізам, якая дазваляе высокапрадукцыйную 3D-візуалізацыю змяненняў у мітахондрыяльнай сетцы з цягам часу33,38. Мы назіралі нязначныя, але значныя змены ў дынаміцы мітахондрый пры стрэсе PPA (мал. 2). Пры 3 мМ колькасць падзей дзялення значна павялічылася, у той час як падзеі зліцця засталіся такімі ж, як і ў кантролі. Павелічэнне колькасці як падзей дзялення, так і зліцця назіралася пры 5 мМ PPA, але гэтыя змены былі прыблізна прапарцыйнымі, што сведчыць аб тым, што кінетыка дзялення і зліцця дасягае раўнавагі пры больш высокіх канцэнтрацыях (мал. 2b). Сярэдні аб'ём мітахондрый заставаўся нязменным як пры 3, так і пры 5 мМ PPA, што сведчыць аб захаванні цэласнасці мітахондрыяльнай сеткі (мал. 2d). Гэта адлюстроўвае здольнасць дынамічных мітахондрыяльных сетак рэагаваць на лёгкі метабалічны стрэс, каб эфектыўна падтрымліваць гамеастаз, не выклікаючы фрагментацыі сеткі. Пры 3 мМ ПФК павелічэнне дзялення дастаткова для садзейнічання пераходу да новай раўнавагі, але ў адказ на стрэс, выкліканы больш высокімі канцэнтрацыямі ПФК, патрабуецца больш глыбокая кінетычная перабудова.
Колькасць мітахондрый павялічылася пры абедзвюх канцэнтрацыях стрэсу PPA, але сярэдні аб'ём мітахондрый істотна не змяніўся (мал. 2c). Гэта можа быць звязана з павелічэннем біягенезу або павелічэннем дзялення; аднак, пры адсутнасці значнага зніжэння сярэдняга аб'ёму мітахондрый, больш верагодна, што біясінтэз павялічваецца. Аднак дадзеныя на малюнку 2 пацвярджаюць існаванне двух кампенсацыйных механізмаў: павелічэнне колькасці падзей дзялення, што адпавядае павышэнню рэгуляцыі мітахондрыяльнага дзялення, і павелічэнне колькасці падзей, што адпавядае мітахондрыяльнаму біягенезу. У канчатковым выніку, дынамічная кампенсацыя лёгкага стрэсу можа складацца з адначасовых працэсаў, якія ўключаюць дзяленне, зліццё, біягенез і мітафагію. Нягледзячы на ​​тое, што папярэднія аўтары паказалі, што PPA ўзмацняе мітоз30,39 і мітафагію29, мы прадстаўляем доказы рэмадэлявання дынамікі мітахондрыяльнага дзялення і зліцця ў адказ на PPA. Гэтыя дадзеныя пацвярджаюць марфалагічныя змены, якія назіраюцца з дапамогай TEM, і даюць далейшае разуменне механізмаў, звязаных з мітахондрыяльнай дысфункцыяй, выкліканай PPA.
Паколькі ні аналіз TEM, ні аналіз MEL не далі прамых доказаў механізмаў рэгуляцыі генаў, якія ляжаць у аснове назіраных марфалагічных змен, мы вывучылі экспрэсію РНК генаў, якія ўдзельнічаюць у мітахондрыяльным метабалізме, біягенезе і дынаміцы. Протаанкаген cMYC - гэта транскрыпцыйны фактар, які ўдзельнічае ў рэгуляцыі мітахондрый, гліколізу, метабалізму амінакіслот і тоўстых кіслот40. Акрамя таго, вядома, што cMYC рэгулюе экспрэсію амаль 600 мітахондрыяльных генаў, якія ўдзельнічаюць у мітахондрыяльнай транскрыпцыі, трансляцыі і зборцы комплексаў, у тым ліку NRF1 і TFAM41. NRF1 і TFAM - гэта два цэнтральныя рэгулятары мітозу, якія дзейнічаюць ніжэй па плыні ад PGC-1α для актывацыі рэплікацыі мтДНК. Гэты шлях актывуецца сігналізацыяй цАМФ і AMPK і адчувальны да выдаткаў энергіі і метабалічнага стрэсу. Мы таксама вывучылі NFE2L2, рэдокс-рэгулятар мітахондрыяльнага біягенезу, каб вызначыць, ці могуць эфекты PPA быць апасродкаваны акісляльным стрэсам.
Нягледзячы на ​​тое, што экспрэсія NFE2L2 заставалася нязменнай, мы выявілі паслядоўнае дозазалежнае зніжэнне экспрэсіі cMYC, NRF1 і TFAM пасля 24 гадзін апрацоўкі 3 мМ і 5 мМ PPA (мал. 3a-c). Зніжэнне экспрэсіі cMYC раней паведамлялася як адказ на мітахандрыяльны стрэс42, і наадварот, зніжэнне экспрэсіі cMYC можа выклікаць мітахондрыяльную дысфункцыю шляхам рэмадэлявання мітахондрыяльнага метабалізму, сеткавай сувязнасці і мембраннай палярызацыі43. Цікава, што cMYC таксама ўдзельнічае ў рэгуляцыі мітахондрыяльнага дзялення і зліцця42,43 і, як вядома, павялічвае фасфараляванне DRP1 і лакалізацыю мітахондрый падчас дзялення клетак44, а таксама апасродкуе марфалагічную рэмадэляцыю мітахондрый у нейрональных ствалавых клетках45. Сапраўды, фібрабласты з дэфіцытам cMYC дэманструюць паменшаны памер мітахондрый, што адпавядае зменам, выкліканым стрэсам PPA43. Гэтыя дадзеныя ілюструюць цікавую, але пакуль незразумелую сувязь паміж cMYC і дынамікай мітахондрый, што забяспечвае цікавую мішэнь для будучых даследаванняў рэмадэлявання, выкліканага стрэсам PPA.
Зніжэнне NRF1 і TFAM адпавядае ролі cMYC як важнага транскрыпцыйнага актыватара. Гэтыя дадзеныя таксама адпавядаюць папярэднім даследаванням на клетках рака тоўстай кішкі чалавека, якія паказалі, што PPA зніжае экспрэсію мРНК NRF1 праз 22 гадзіны, што было звязана з дэфіцытам АТФ і павелічэннем ROS46. Гэтыя аўтары таксама паведамілі, што экспрэсія TFAM павялічвалася праз 8,5 гадзіны, але вярнулася да зыходнага ўзроўню праз 22 гадзіны. Наадварот, Kim et al. (2019) паказалі, што экспрэсія мРНК TFAM значна зніжалася пасля 4 гадзін стрэсу PPA ў клетках SH-SY5Y; аднак праз 72 гадзіны экспрэсія бялку TFAM значна павялічвалася, а колькасць копій мтДНК значна павялічвалася. Такім чынам, зніжэнне колькасці генаў мітахондрыяльнага біягенезу, якое мы назіралі праз 24 гадзіны, не выключае магчымасці таго, што павелічэнне колькасці мітахондрый звязана з актывацыяй біягенезу ў больш раннія моманты часу. Папярэднія даследаванні паказалі, што PPA значна павялічвае рэгуляцыю мРНК і бялку PGC-1α ў клетках SH-SY5Y праз 4 гадзіны 30 хвілін, у той час як прапіёнавая кіслата ўзмацняе мітахондрыяльны біягенез у гепатацытах цяляці праз PGC-1α праз 12 гадзін 39 хвілін. Цікава, што PGC-1α з'яўляецца не толькі прамым транскрыпцыйным рэгулятарам NRF1 і TFAM, але таксама, як было паказана, рэгулюе актыўнасць MFN2 і DRP1 шляхам рэгулявання дзялення і зліцця47. У сукупнасці гэта сведчыць аб цеснай сувязі механізмаў, якія рэгулююць кампенсаторныя рэакцыі мітахондрыялаў, выкліканыя PPA. Больш за тое, нашы дадзеныя адлюстроўваюць значную дысрэгуляцыю транскрыпцыйнай рэгуляцыі біягенезу і метабалізму пры стрэсе PPA.
Гены STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 і DRP1 з'яўляюцца аднымі з цэнтральных рэгулятараў мітахондрыяльнага дзялення, зліцця і дынамікі37,48,49. Існуе шмат іншых генаў, якія ўдзельнічаюць у дынаміцы мітахондрыял, аднак раней было выяўлена, што STOML2, OPA1 і MFN2 дыферэнцыяльна метыляваныя ў кагортах з РАС16, і некалькі незалежных даследаванняў паведамлялі пра змены гэтых транскрыпцыйных фактараў у адказ на мітахондрыяльны стрэс50,51.52. Экспрэсія як OPA1, так і STOML2 была значна зніжана пры апрацоўцы 3 мМ і 5 мМ PPA (мал. 3e, f). OPA1 з'яўляецца адным з класічных рэгулятараў мітахондрыяльнага зліцця праз непасрэднае ўзаемадзеянне з MFN1 і 2 і гуляе ролю ў перабудове крыст і марфалогіі мітахондрыял53. Дакладная роля STOML2 у дынаміцы мітахондрыял застаецца незразумелай, але дадзеныя сведчаць аб тым, што ён гуляе ролю ў мітахондрыяльным зліцці, біягенезе і мітафагіі.
STOML2 удзельнічае ў падтрыманні мітахондрыяльнай дыхальнай сувязі і фарміраванні комплексаў дыхальнага ланцуга54,55 і, як было паказана, значна змяняе метабалічныя характарыстыкі ракавых клетак56. Даследаванні паказалі, што STOML2 спрыяе патэнцыялу мітахондрыяльнай мембраны і біягенезу праз узаемадзеянне з BAN і кардыяліпінам55, 57, 58. Акрамя таго, незалежныя даследаванні паказалі, што ўзаемадзеянне паміж STOML2 і PINK1 рэгулюе мітафагію59,60. Прыкметна, што STOML2, як паведамлялася, непасрэдна ўзаемадзейнічае з MFN2 і стабілізуе яго, а таксама адыгрывае важную ролю ў стабілізацыі доўгіх ізаформ OPA1 шляхам інгібіравання пратэазы, адказнай за дэградацыю OPA153,61,62. Зніжэнне экспрэсіі STOML2, якое назіраецца ў рэакцыях PPA, можа зрабіць гэтыя злітыя вавёркі больш успрымальнымі да дэградацыі праз убіквіцін- і пратэасом-залежныя шляхі48. Нягледзячы на ​​тое, што дакладная роля STOML2 і OPA1 у дынамічнай рэакцыі на PPA незразумелая, зніжэнне экспрэсіі гэтых генаў зліцця (малюнак 3) можа парушыць баланс паміж дзяленнем і зліццём і прывесці да памяншэння памеру мітахондрый (малюнак 3). 1).
З іншага боку, экспрэсія бялку OPA1 заставалася нязменнай праз 24 гадзіны, у той час як узроўні мРНК і бялку MFN1, MFN2 або DRP1 істотна не змяніліся пасля апрацоўкі PPA (мал. 3g-i, мал. 4). Гэта можа сведчыць аб адсутнасці змен у рэгуляцыі гэтых фактараў, якія ўдзельнічаюць у мітахондрыяльным зліцці і дзяленні. Аднак варта адзначыць, што кожны з гэтых чатырох генаў таксама рэгулюецца посттранскрыпцыйнымі мадыфікацыямі (PTM), якія кантралююць актыўнасць бялку. OPA1 мае восем альтэрнатыўных варыянтаў сплайсінгу, якія пратэалітычна расшчапляюцца ў мітахондрыях, утвараючы дзве розныя ізаформы 63. Баланс паміж доўгімі і кароткімі ізаформамі ў канчатковым выніку вызначае ролю OPA1 у мітахондрыяльным зліцці і падтрыманні мітахондрыяльнай сеткі 64. Актыўнасць DRP1 рэгулюецца фасфараляваннем кальцый/кальмадулін-залежнай пратэінкіназы II (CaMKII), у той час як дэградацыя DRP1 рэгулюецца ўбіквітынацыяй і SUMOylation 65. Нарэшце, як DRP1, так і MFN1/2 з'яўляюцца ГТФазамі, таму актыўнасць можа залежаць ад хуткасці выпрацоўкі ГТФ у мітахондрыях 66. Такім чынам, хоць экспрэсія гэтых бялкоў застаецца пастаяннай, гэта можа не адлюстроўваць нязменную актыўнасць або лакалізацыю бялку 67, 68. Сапраўды, існуючыя рэпертуары бялкоў ПТМ часта служаць першай лініяй абароны, адказнай за медыяванне вострых стрэсавых рэакцый. Пры наяўнасці ўмеранага метабалічнага стрэсу ў нашай мадэлі, верагодна, ПТМ спрыяе павышэнню актыўнасці бялкоў зліцця і дзялення для дастатковага аднаўлення цэласнасці мітахондрыял без неабходнасці дадатковай актывацыі гэтых генаў на ўзроўні мРНК або бялку.
Узятыя разам, вышэйзгаданыя дадзеныя падкрэсліваюць складаную і залежную ад часу рэгуляцыю марфалогіі мітахондрыялаў і праблемы высвятлення гэтых механізмаў. Для вывучэння экспрэсіі генаў спачатку неабходна вызначыць канкрэтныя гены-мішэні ў гэтым шляху. Аднак нашы дадзеныя паказваюць, што гены ў адным і тым жа шляху не рэагуюць аднолькава на адзін і той жа стрэс. Фактычна, папярэднія даследаванні паказалі, што розныя гены ў адным і тым жа шляху могуць дэманстраваць розныя профілі часовага адказу30,46. Акрамя таго, існуюць складаныя посттранскрыпцыйныя механізмы, якія парушаюць сувязь паміж транскрыпцыяй і функцыяй генаў. Пратэомныя даследаванні могуць даць уяўленне аб уплыве посттранскрыпцыйных мэханізмаў і функцыі бялку, але яны таксама ствараюць праблемы, у тым ліку нізкапрадукцыйныя метады, высокія суадносіны сігнал/шум і нізкае разрозненне.
У гэтым кантэксце вывучэнне марфалогіі мітахондрыял з дапамогай прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (ПЭМ) і мікраэлектроннай электроннай мікраскапіі (МЭЛ) мае вялікі патэнцыял для вырашэння фундаментальных пытанняў аб узаемасувязі паміж дынамікай і функцыяй мітахондрыял і аб тым, як гэта ўплывае на захворванні. Найбольш важна тое, што ПЭМ забяспечвае прамы метад вымярэння марфалогіі мітахондрыял як канвергентнай канчатковай кропкі мітахондрыяльнай дысфункцыі і дынамікі51. МЭЛ таксама забяспечвае прамы метад візуалізацыі падзей дзялення і зліцця ў трохмерным клетачным асяроддзі, што дазваляе колькасна ацаніць дынамічную рэмадэляванне мітахондрыял нават пры адсутнасці змяненняў у экспрэсіі генаў33. Тут мы падкрэсліваем карыснасць метадаў візуалізацыі мітахондрыял пры другасных мітахондрыяльных захворваннях. Гэтыя захворванні звычайна характарызуюцца хранічным лёгкім метабалічным стрэсам, які характарызуецца тонкай рэмадэляваннем мітахондрыяльных сетак, а не вострым пашкоджаннем мітахондрыял. Аднак кампенсацыя мітахондрыял, неабходная для падтрымання мітозу пры хранічным стрэсе, мае глыбокія функцыянальныя наступствы. У кантэксце неўралогіі лепшае разуменне гэтых кампенсаторных механізмаў можа даць важную інфармацыю аб плеятропнай неўрапаталогіі, звязанай з мітахондрыяльнай дысфункцыяй.
У канчатковым выніку, нашы дадзеныя падкрэсліваюць карыснасць метадаў візуалізацыі для разумення функцыянальных наступстваў складаных узаемадзеянняў паміж экспрэсіяй генаў, мадыфікацыямі бялкоў і актыўнасцю бялкоў, якія кантралююць дынаміку нейрональных мітахондрый. Мы выкарысталі PPA для мадэлявання мітахондрыяльнай дысфункцыі ў мадэлі нейрональных клетак, каб атрымаць уяўленне аб мітахондрыяльным кампаненте ASD. Клеткі SH-SY5Y, апрацаваныя PPA, паказалі змены ў марфалогіі мітахондрый: мітахондрыі сталі маленькімі і круглымі, а крысты былі дрэнна акрэслены пры назіранні з дапамогай TEM. Аналіз MEL паказвае, што гэтыя змены адбываюцца адначасова з павелічэннем колькасці падзей дзялення і зліцця для падтрымання мітахондрыяльнай сеткі ў адказ на лёгкі метабалічны стрэс. Больш за тое, PPA значна парушае транскрыпцыйную рэгуляцыю мітахондрыяльнага метабалізму і гамеастазу. Мы вызначылі cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 і OPA1 як ключавыя мітахондрыяльныя рэгулятары, парушаныя стрэсам PPA, і могуць гуляць ролю ў апасродкаванні выкліканых PPA змен у марфалогіі і функцыі мітахондрый. Неабходныя далейшыя даследаванні, каб лепш ахарактарызаваць выкліканыя PPA часовыя змены ў экспрэсіі генаў і актыўнасці бялкоў, лакалізацыі і посттрансляцыйных мадыфікацыях. Нашы дадзеныя падкрэсліваюць складанасць і ўзаемазалежнасць рэгуляторных механізмаў, якія апасродкуюць рэакцыю мітахондрыялаў на стрэс, і дэманструюць карыснасць ПЭМ і іншых метадаў візуалізацыі для больш мэтанакіраваных механістычных даследаванняў.
Клетачная лінія SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) была набыта ў Sigma-Aldrich. Клеткі SH-SY5Y вырошчвалі ў мадыфікаваным асяроддзі Ігла Дульбека/пажыўнай сумесі F-12 (DMEM/F-12) і L-глутаміна (SC09411, ScienCell) у колбах аб'ёмам 25 см² з дадаткам 20% фетальнай бычынай сыроваткі (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) і 1% пеніцылін-стрэптаміцыну (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) пры тэмпературы 37 °C, 5% CO². Клеткі субкультывавалі да 80% зліцця з выкарыстаннем 0,05% трыпсіну-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), цэнтрыфугавалі пры 300 g і высейвалі пры шчыльнасці прыблізна 7 × 105 клетак/мл. Усе эксперыменты праводзіліся на недыферэнцыяваных клетках SH-SY5Y паміж пасажамі 19–22. PPA ўводзілі ў выглядзе NaP. Растварыце парашок NaP (CAS № 137-40-6, хімічная формула C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) у цёплай вадзе MilliQ да канцэнтрацыі 1 M і захоўвайце пры тэмпературы 4 °C. У дзень апрацоўкі развядзіце гэты раствор 1 M PPA да 3 mM і 5 mM PPA ў бессыроватачным асяроддзі (DMEM/F-12 з L-глутамінам). Канцэнтрацыі апрацоўкі для ўсіх эксперыментаў былі наступнымі: без PPA (0 mM, кантроль), 3 mM і 5 mM PPA. Эксперыменты праводзіліся як мінімум у трох біялагічных паўторах.
Клеткі SH-SY5Y высейвалі ў колбы аб'ёмам 25 см5 з хуткасцю 5,5 × 105 клетак/мл і вырошчвалі на працягу 24 гадзін. Апрацоўка PPA была дададзена ў колбу перад 24 гадзінамі інкубацыі. Збіралі клетачныя асадкі ў адпаведнасці са звычайнымі пратаколамі субкультуравання тканін млекакормячых (апісанымі вышэй). Рэсуспендавалі клетачныя асадкі ў 100 мкл 2,5% глутаральдэгіду, 1× PBS і захоўвалі пры тэмпературы 4°C да апрацоўкі. Клеткі SH-SY5Y коратка цэнтрыфугавалі для асадка клетак і выдалення 2,5% раствора глутаральдэгіду, 1× PBS. Рэсуспендавалі асадак у 4% агарозным гелі, прыгатаваным у дыстыляванай вадзе (суадносіны аб'ёму агарозы да асадка 1:1). Кавалкі агарозы змяшчалі на сеткі на плоскіх пласцінах і пакрывалі 1-гексадэцэнам перад замарожваннем пад высокім ціскам. Узоры замарожвалі ў 100% сухім ацэтоне пры тэмпературы -90°C на працягу 24 гадзін. Затым тэмпературу павысілі да -80°C і дадалі раствор 1% чатырохаксіду осмія і 0,1% глутаральдэгіду. Узоры захоўвалі пры -80°C на працягу 24 гадзін. Пасля гэтага тэмпературу паступова павышалі да пакаёвай тэмпературы на працягу некалькіх дзён: ад -80°C да -50°C на працягу 24 гадзін, да -30°C на працягу 24 гадзін, да -10°C на працягу 24 гадзін і, нарэшце, да пакаёвай тэмпературы.
Пасля крыягеннай падрыхтоўкі ўзоры былі прасякнуты смалой, і ультратонкія зрэзы (∼100 нм) былі зроблены з выкарыстаннем ультрамікратома Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Зрэзы былі афарбаваны 2% уранілацэтатам і цытратам свінцу. Узоры былі даследаваны з дапамогай прасвечвальнага электроннага мікраскопа FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (раней FEI), Эйндховен, Нідэрланды), які працуе на 200 кВ (перадатчык Lab6), і ПЗС-камеры Gatan (Gatan, Вялікабрытанія), абсталяванай энергетычным фільтрам Tridiem.
У кожнай тэхнічнай паўторнасці было атрымана не менш за 24 выявы асобных клетак, усяго 266 выяваў. Усе выявы былі прааналізаваны з выкарыстаннем макра «Вобласць інтарэсу» (ROI) і макра «Мітахондрыі». Мітахондрыйны макра заснаваны на апублікаваных метадах17,31,32 і дазваляе паўаўтаматычную пакетную апрацоўку выяваў TEM у Fiji/ImageJ69. У двух словах: выява інвертуецца і пераварочваецца з выкарыстаннем аднімання фону коціцца шара (радыус 60 пікселяў) і паласавога фільтра FFT (з выкарыстаннем верхняй і ніжняй межаў 60 і 8 пікселяў адпаведна) і падаўлення вертыкальных ліній з допускам арыентацыі 5%. Апрацаваная выява аўтаматычна ўсталёўвае парог з выкарыстаннем алгарытму максімальнай энтрапіі, і генеруецца бінарная маска. Былі вылучаны вобласці выявы, звязаныя з выбранымі ўручную ROI на неапрацаваных выявах TEM, якія характарызуюць мітахондрыі і выключаюць плазматычную мембрану і іншыя вобласці з высокай кантраснасцю. Для кожнай вынятай вобласці інтарэсу (ROI) аналізаваліся бінарныя часціцы памерам больш за 600 пікселяў, а плошча, перыметр, вялікія і малыя восі часціц, дыяметр Ферэ, круглявасць і акружнасць вымяраліся з дапамогай убудаваных функцый вымярэння Fiji/ImageJ. Згодна з Merrill, Flippo і Strack (2017), з гэтых дадзеных былі разлічаны плошча 2, каэфіцыент бакоў часціц (каэфіцыент бакоў вялікай і малой восяў) і каэфіцыент формы (FF), дзе FF = перыметр 2/4π x плошча. Вызначэнне параметрнай формулы можна знайсці ў Merrill, Flippo і Strack (2017). Згаданыя макрасы даступныя на GitHub (гл. Заяву аб даступнасці дадзеных). У сярэднім на адну апрацоўку PPA аналізавалася прыблізна 5600 часціц, што ў агульнай складанасці складае прыблізна 17 000 часціц (дадзеныя не паказаны).
Клеткі SH-SH5Y змяшчалі ў 8-камерныя культуральныя чашкі (ThermoFisher, #155411) для адгезіі на працягу ночы, а затым інкубавалі з фарбавальнікамі TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) і Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Выявы атрымлівалі з выкарыстаннем лазераў 405 нм і 561 нм на працягу 10 хвілін, а неапрацаваныя выявы атрымлівалі ў выглядзе z-стэкаў, якія змяшчалі 10 мікрафатаграфій выяваў з крокам az 0,2 мкм паміж кадрамі выявы ў 12 наступных момантах часу. Выявы былі сабраны з дапамогай платформы звышвысокага разрознення Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германія) з выкарыстаннем аб'ектыва LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Выявы былі прааналізаваны ў ImageJ з выкарыстаннем раней апісанага канвеера і плагіна ImageJ для вымярэння падзей зліцця і дзялення, сярэдняй колькасці мітахондрыяльных структур і сярэдняга аб'ёму мітахондрыял на клетку33. Макрасы MEL даступныя на GitHub (гл. Заяву аб даступнасці дадзеных).
Клеткі SH-SY5Y вырошчвалі ў шасцілункавых пласцінах пры шчыльнасці 0,3 × 10⁶ клетак/мл на працягу 24 гадзін перад апрацоўкай. РНК экстрагавалі з выкарыстаннем пратаколу Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) з невялікімі мадыфікацыямі: дадавалі 300 мкл буфера для лізісу РНК у кожную лунку перад выдаленнем і лізавалі кожны ўзор на апошнім этапе з дапамогай 30 мкл вады без ДНКазы/РНКазы для элюцыі. Усе ўзоры правяралі на колькасць і якасць з выкарыстаннем УФ-бачнага спектрафатометра NanoDrop ND-1000. Агульны бялок з клеткавых лізатаў атрымлівалі з выкарыстаннем 200 мкл буфера для лізісу RIPA, а канцэнтрацыю бялку вызначалі колькасна з дапамогай аналізу бялку Брэдфарда70.
Сінтэз кДНК быў выкананы з выкарыстаннем набору для сінтэзу кДНК Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы з некаторымі мадыфікацыямі. кДНК была сінтэзавана ў рэакцыях па 20 мкл з выкарыстаннем ад 0,7 да 1 мкг агульнай РНК. Праймеры былі выбраны з раней апублікаваных артыкулаў 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (табліца S1), а адпаведныя зонды былі распрацаваны з выкарыстаннем інструмента PrimerQuest ад Integrated DNA Technologies. Усе гены, якія ўяўляюць цікавасць, былі нармалізаваны адносна ядзернага гена B2M. Экспрэсія генаў STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC і OPA1 была вымерана з дапамогай RT-qPCR. Мастэр-сумесь уключала палімеразу LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 мкМ прамых і зваротных праймераў, кДНК і ваду, прыдатную для ПЛР, каб атрымаць канчатковы аб'ём 10 мкл для кожнай рэакцыі. Экспрэсія генаў дзялення і дэфіцыравання (DRP1, MFN1/2) вымяралася з дапамогай мультыплекснага аналізу TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) выкарыстоўвалася ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы з невялікімі зменамі. Мультыплексная RT-qPCR Master Mix уключае 1X LUNA Taq палімеразу, 10 мкМ прамых і зваротных праймераў, 10 мкМ зонда, кДНК і ваду, прыдатную для ПЛР, што прывяло да канчатковага аб'ёму 20 мкл для кожнай рэакцыі. RT-qPCR праводзілася з выкарыстаннем Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — серыйны нумар: R0618110). Умовы цыклавання паказаны ў табліцы S1. Усе ўзоры кДНК былі ампліфікаваны ў трох паўторах, і стандартная крывая была пабудавана з выкарыстаннем серыі дзесяцікратных развядзенняў. Выкіды ў трох паўторах са стандартным адхіленнем парога цыклу (Ct) > 0,5 былі выдалены з аналізу для забеспячэння ўзнаўляльнасці дадзеных30,72. Адносную экспрэсію генаў разлічвалі з выкарыстаннем метаду 2-ΔΔCt79.
Узоры бялку (60 мкг) змешвалі з буферам для загрузкі Лэмлі ў суадносінах 2:1 і аналізавалі на 12% бясколерным бялковым гелі (Bio-Rad #1610184). Бялкі пераносілі на мембрану PVDF (полівінілідэнфтарыд) (#170-84156, Bio-Rad) з выкарыстаннем сістэмы Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Мембрану блакавалі і інкубавалі з адпаведнымі першаснымі антыцеламі (OPA1, MFN1, MFN2 і DRP1) (разведзенымі 1:1000) на працягу 48 гадзін, а затым інкубавалі з другаснымі антыцеламі (1:10 000) на працягу 1 гадзіны. Затым мембраны візуалізавалі з выкарыстаннем субстрата Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) і рэгістравалі з дапамогай сістэмы Bio-Rad ChemiDoc MP. Для вестэрн-блот-аналізу выкарыстоўвалі ImageLab версіі 6.1. Зыходны гель і блот паказаны на малюнку S1. Інфармацыя аб антыцелах прадстаўлена ў табліцы S2.
Наборы дадзеных прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння і стандартнай памылкі сярэдняга (SEM) як мінімум трох незалежных выбарак. Нармальнасць набораў дадзеных была праверана з выкарыстаннем крытэрыя Шапіра-Уілкса (калі не пазначана іншае), перш чым выказаць здагадку аб размеркаванні Гаўса і роўных стандартных адхіленнях і працягнуць аналіз. Акрамя таго, для аналізу набору дадзеных выкарыстоўваўся крытэрый Фішэра MEL LSD (p < 0,05), аднафактарны дысперсійны аналіз (сярэдняе значэнне лячэння супраць кантролю) і крытэрый множнага параўнання Данэта для вызначэння значнасці (p < 0,05). Значныя значэнні p паказаны на графіку як *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Усе статыстычныя аналізы і графікі былі выкананы і створаны з выкарыстаннем GraphPad Prism 9.4.0.
Макрасы Fiji/ImageJ для аналізу малюнкаў TEM знаходзяцца ў адкрытым доступе на GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Макрас лакатара мітахондрыяльных падзей (MEL) знаходзіцца ў адкрытым доступе на GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейліяна А., Дэві Н.М. і Віджая А. Мітахондрыі: галоўныя рэгулятары метабалізму, гамеастазу, стрэсу, старэння і эпігенетыкі. Інданезійская. Біямедыцынскія навукі. J. ​​13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Шматгранная мітахондрыяльная дысфункцыя пры шызафрэніі, комплекс I як магчымая паталагічная мішэнь. Шызафрэнія. рэсурс. 187, 3–10 (2017).
Боз, А. і Біл, М. Ф. Мітахандрыяльная дысфункцыя пры хваробе Паркінсана. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Шарма В. К., Сінгх Т. Г. і Мехта В. Стрэсаваныя мітахондрыі: мішэні інвазіі пры хваробе Альцгеймера. Мітахондрыі 59, 48–57 (2021).
Беленгер П., Дуартэ ЖМН, Шук П.Ф. і Ферэйра Г.К. Мітахондрыі і мозг: біяэнергетыка і іншае. Нейратаксіны. рэсурс. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. і інш. Плейатропныя мітахондрыі: уплыў мітахондрый на развіццё нейронаў і захворванні. J. ​​Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Карданьё-Рамас, К. і Марайс, В.А. Мітахандрыяльны біягенез у нейронах: як і дзе. міжнароднасць. Дж. Мор. навука. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендаль, У., Ністэр, М. і Чжао, Дж. Рэгуляцыя дынамікі мітахондрый млекакормячых: магчымасці і праблемы. фронт. эндакрынны. (Лазана) 11, 374 (2020).
Хачо, М. і Слэк, Р.С. Мітахандрыяльная дынаміка ў рэгуляцыі нейрагенезу: ад мозгу, які развіваецца, да мозгу дарослага чалавека. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).