Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Наначасціцы (НЧ) інсуліну з высокім утрыманнем нагрузкі знайшлі розныя прымяненні ў розных лекавых формах. Мэта гэтай працы — ацаніць уплыў працэсаў сублімацыі і распыляльнай сушкі на структуру наначасціц хітазану, загружаных інсулінам, з манітолам у якасці крыяпратэктара або без яго. Мы таксама ацанілі якасць гэтых наначасціц шляхам іх паўторнага растварэння. Перад дэгідратацыяй памер часціц зшытых наначасціц хітазану/трыпаліфасфату натрыю/інсуліну быў аптымізаваны да 318 нм, PDI складаў 0,18, эфектыўнасць інкапсуляцыі — 99,4%, а нагрузка — 25,01%. Пасля аднаўлення ўсе наначасціцы, за выключэннем тых, што былі атрыманы метадам сублімацыі без выкарыстання манітолу, захавалі сваю сферычную структуру часціц. У параўнанні з наначасціцамі, якія змяшчаюць манітол і былі дэгідратаваны любым з гэтых метадаў распылення, распыляльна-высушаныя наначасціцы без манітолу таксама паказалі найменшы сярэдні памер часціц (376 нм) і найбольшую нагрузку (25,02%) з падобнай хуткасцю інкапсуляцыі (98,7%) і PDI. (0,20) шляхам сушкі або ліафілізацыйнай сушкі. Высушаныя наначасціцы з дапамогай распыляльнай сушкі без манітолу таксама прывялі да найхутчэйшага вызвалення інсуліну і найвышэйшай эфектыўнасці клеткавага паглынання. Гэтая праца паказвае, што распыляльная сушка можа абязводжваць наначасціцы інсуліну без неабходнасці крыяпратэктараў у параўнанні з традыцыйнымі метадамі ліафілізацыйнай сушкі, што стварае большую ёмістасць загрузкі, меншыя патрэбы ў дадатках і значную перавагу ў эксплуатацыйных выдатках.
З моманту свайго адкрыцця ў 1922 годзе1,2,3 інсулін і яго фармацэўтычныя прэпараты ратавалі жыцці пацыентаў з дыябетам 1 тыпу (ЦД1) і дыябетам 2 тыпу (ЦД1). Аднак, з-за сваіх уласцівасцей як высокамалекулярнага бялку, інсулін лёгка агрэгуецца, расшчапляецца пратэалітычнымі ферментамі і выводзіцца пры першым праходжанні. Людзям з дыягназам дыябету 1 тыпу патрэбныя ін'екцыі інсуліну да канца жыцця. Многім пацыентам, у якіх першапачаткова дыягнаставалі дыябет 2 тыпу, таксама патрэбныя працяглыя ін'екцыі інсуліну. Штодзённыя ін'екцыі інсуліну з'яўляюцца сур'ёзнай крыніцай штодзённага болю і дыскамфорту для гэтых людзей, што негатыўна ўплывае на псіхічнае здароўе. У выніку, іншыя формы ўвядзення інсуліну, якія выклікаюць меншы дыскамфорт, такія як пероральное ўвядзенне інсуліну, шырока вывучаюцца5, паколькі яны маюць патэнцыял аднавіць якасць жыцця прыблізна 5 мільярдаў чалавек з дыябетам ва ўсім свеце.
Тэхналогія наначасціц забяспечыла значны прагрэс у спробах прымаць пероральны інсулін4,6,7. Такі, які эфектыўна інкапсулюе і абараняе інсулін ад дэградацыі для мэтанакіраванай дастаўкі ў пэўныя ўчасткі цела. Аднак выкарыстанне прэпаратаў з наначасціц мае некалькі абмежаванняў, галоўным чынам з-за праблем са стабільнасцю суспензій часціц. Падчас захоўвання можа адбывацца некаторая агрэгацыя, што зніжае біядаступнасць наначасціц, загружаных інсулінам8. Акрамя таго, для забеспячэння стабільнасці наначасціц інсуліну (НЧ) неабходна таксама ўлічваць хімічную стабільнасць палімернай матрыцы наначасціц і інсуліну. У цяперашні час тэхналогія сублімацыі з'яўляецца залатым стандартам для стварэння стабільных НЧ, прадухіляючы пры гэтым непажаданыя змены падчас захоўвання9.
Аднак, для сублімацыйнай сушкі патрабуецца даданне крыяпратэктараў, каб прадухіліць уплыў механічнага ўздзеяння крышталяў лёду на сферычную структуру наначасціц. Гэта значна зніжае нагрузку наначасціц інсуліну пасля ліяфілізацыі, паколькі крыяпратэктар займае большую частку масы. Такім чынам, атрыманыя наначасціцы інсуліну часта аказваюцца непрыдатнымі для вырабу сухіх парашкападобных прэпаратаў, такіх як таблеткі для прыёму ўнутр і плёнкі для прыёму ўнутр, з-за неабходнасці вялікай колькасці сухіх наначасціц для дасягнення тэрапеўтычнага акна інсуліну.
Распыляльная сушка — гэта добра вядомы і недарагі прамысловы працэс атрымання сухіх парашкоў з вадкіх фаз у фармацэўтычнай прамысловасці10,11. Кантроль над працэсам утварэння часціц дазваляе належным чынам інкапсуляваць некалькі біялагічна актыўных злучэнняў12,13. Акрамя таго, яна стала эфектыўным метадам падрыхтоўкі інкапсуляваных бялкоў для прыёму ўнутр. Падчас распыляльнай сушкі вада вельмі хутка выпараецца, што дапамагае падтрымліваць нізкую тэмпературу ядра часціц11,14, што дазваляе выкарыстоўваць яе для інкапсуляцыі цеплаадчувальных кампанентаў. Перад распыляльнай сушкай пакрыццёвы матэрыял павінен быць старанна гамагенізаваны з растворам, які змяшчае інкапсуляваныя інгрэдыенты11,14. У адрозненне ад сублімацыйнай сушкі, гамагенізацыя перад інкапсуляцыяй пры распыляльнай сушцы паляпшае эфектыўнасць інкапсуляцыі падчас дэгідратацыі. Паколькі працэс інкапсуляцыі распыляльнай сушкі не патрабуе крыяпратэктараў, распыляльную сушку можна выкарыстоўваць для атрымання высушаных наначасціц з высокім утрыманнем напаўняльнікаў.
У гэтым даследаванні паведамляецца пра атрыманне наначасціц, загружаных інсулінам, шляхам зшывання хітазану і трыпаліфасфату натрыю з выкарыстаннем метаду іённага геля. Іённае геляванне - гэта метад падрыхтоўкі, які дазваляе атрымліваць наначасціцы праз электрастатычныя ўзаемадзеянні паміж двума або больш іённымі часціцамі пры пэўных умовах. Для дэгідратацыі аптымізаваных зшытых наначасціц хітазану/трыпаліфасфату натрыю/інсуліну выкарыстоўваліся як метады сублімацыйнай сушкі, так і распыляльнай сушкі. Пасля дэгідратацыі іх марфалогія была прааналізавана з дапамогай SEM. Іх здольнасць да рэкамбінацыі ацэньвалася шляхам вымярэння іх размеркавання па памерах, паверхневага зарада, PDI, эфектыўнасці інкапсуляцыі і ўтрымання. Якасць рэсалюбілізаваных наначасціц, атрыманых рознымі метадамі дэгідратацыі, таксама ацэньвалася шляхам параўнання іх абароны ад інсуліну, паводзін вызвалення і эфектыўнасці паглынання клеткамі.
pH змешанага раствора і суадносіны хітазану і інсуліну з'яўляюцца двума ключавымі фактарамі, якія ўплываюць на памер часціц і эфектыўнасць інкапсуляцыі (ЭІ) канчатковых наначасціц, паколькі яны непасрэдна ўплываюць на працэс іанатропнага гелеўтварэння. Было паказана, што pH змешанага раствора моцна карэлюе з памерам часціц і эфектыўнасцю інкапсуляцыі (мал. 1a). Як паказана на мал. 1a, пры павелічэнні pH з 4,0 да 6,0 сярэдні памер часціц (нм) памяншаўся, а ЭІ значна павялічвалася, у той час як пры павелічэнні pH да 6,5 сярэдні памер часціц пачынаў павялічвацца, а ЭІ заставалася нязменнай. Па меры павелічэння суадносін хітазану і інсуліну сярэдні памер часціц таксама павялічваецца. Акрамя таго, ніякіх змен ЭІ не назіралася, калі наначасціцы былі падрыхтаваны пры масавым суадносінах хітазану/інсуліну вышэй за 2,5:1 (мас./мас.) (мал. 1b). Такім чынам, аптымальныя ўмовы падрыхтоўкі ў гэтым даследаванні (pH 6,0, масавае суадносіны хітазану/інсуліну 2,5:1) былі выкарыстаны для падрыхтоўкі. Наначасціцы, загружаныя інсулінам, для далейшага вывучэння. Пры такіх умовах падрыхтоўкі сярэдні памер часціц наначасціц інсуліну быў аптымізаваны да 318 нм (мал. 1c), PDI склаў 0,18, эфектыўнасць убудавання склала 99,4%, дзета-патэнцыял склаў 9,8 мВ, а загрузка інсуліну склала 25,01% (м/м). Згодна з вынікамі прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (ПЭМ), аптымізаваныя наначасціцы былі прыблізна сферычнымі і дыскрэтнымі з адносна аднастайным памерам (мал. 1d).
Аптымізацыя параметраў наначасціц інсуліну: (а) уплыў pH на сярэдні дыяметр і эфектыўнасць інкапсуляцыі (ЭІ) наначасціц інсуліну (прыгатаваных пры масавым суадносінах хітазану і інсуліну 5:1); (б) хітазан і ўплыў масавых суадносін інсуліну на сярэдні дыяметр і эфектыўнасць інкапсуляцыі (ЭІ) наначасціц інсуліну (прыгатаваных пры pH 6); (в) размеркаванне памераў часціц аптымізаваных наначасціц інсуліну; (г) мікрафатаграфія аптымізаваных наначасціц інсуліну, атрыманая з дапамогай прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (ПЭМ).
Добра вядома, што хітазан — гэта слабы поліэлектраліт з pKa 6,5. Ён мае станоўчы зарад у кіслым асяроддзі, таму што яго асноўная амінагрупа пратанавана іонамі вадароду15. Таму яго часта выкарыстоўваюць у якасці носьбіта для інкапсуляцыі адмоўна зараджаных макрамалекул. У гэтым даследаванні хітазан выкарыстоўваўся для інкапсуляцыі інсуліну з ізаэлектрычнай кропкай 5,3. Паколькі хітазан выкарыстоўваецца ў якасці пакрывальнага матэрыялу, з павелічэннем яго долі адпаведна павялічваецца таўшчыня вонкавага пласта наначасціц, што прыводзіць да большага сярэдняга памеру часціц. Акрамя таго, больш высокі ўзровень хітазану можа інкапсуляваць больш інсуліну. У нашым выпадку EE была найвышэйшай, калі суадносіны хітазану і інсуліну дасягалі 2,5:1, і не назіралася істотных змен EE, калі суадносіны працягвалі павялічвацца.
Акрамя суадносін хітазану і інсуліну, pH таксама адыгрываў вырашальную ролю ў падрыхтоўцы наначасціц. Ган і інш.17 вывучалі ўплыў pH на памер часціц наначасціц хітазану. Яны выявілі пастаяннае памяншэнне памеру часціц, пакуль pH не дасягнуў 6,0, і значнае павелічэнне памеру часціц назіралася пры pH > 6,0, што адпавядае нашым назіранням. Гэта з'ява звязана з тым, што з павышэннем pH малекула інсуліну набывае адмоўны павярхоўны зарад, што спрыяе электрастатычным узаемадзеянням з комплексам хітазан/трыпаліфасфат натрыю (TPP), што прыводзіць да малога памеру часціц і высокай EE. Аднак, калі pH даводзілі да 6,5, амінагрупы на хітазане дэпратанавалі, што прыводзіла да згортвання хітазану. Такім чынам, высокі pH прыводзіць да меншага ўздзеяння амінаіёнаў на TPP і інсулін, што прыводзіць да меншага зшывання, большага канчатковага сярэдняга памеру часціц і меншай EE.
Аналіз марфалагічных уласцівасцей наначасціц, атрыманых шляхам сублімацыі і распылення, можа дапамагчы ў выбары лепшых метадаў дэгідратацыі і фарміравання парашка. Пераважны метад павінен забяспечваць стабільнасць лекавага сродку, аднастайную форму часціц, высокую загрузку лекавага сродку і добрую растваральнасць у зыходным растворы. У гэтым даследаванні, каб лепш параўнаць два метады, падчас дэгідратацыі выкарыстоўваліся наначасціцы інсуліну з 1% манітолам або без яго. Манітол выкарыстоўваецца ў якасці напаўняльніка або крыяпратэктара ў розных сухіх парашковых прэпаратах для сублімацыі і распылення. Для ліяфілізаваных наначасціц інсуліну без манітолу, як паказана на малюнку 2a, пад сканіруючай электроннай мікраскапіяй (SEM) назіралася высокапорыстая структура парашка з вялікімі, няроўнымі і шурпатымі паверхнямі. Пасля дэгідратацыі ў парашку было выяўлена некалькі асобных часціц (мал. 2e). Гэтыя вынікі паказваюць, што большасць наначасціц расклаліся падчас сублімацыі без якога-небудзь крыяпратэктара. Для сублімаваных і распыляльна-сушаных наначасціц інсуліну, якія змяшчаюць 1% манітолу, назіраліся сферычныя наначасціцы з гладкімі паверхнямі (мал. 2b,d,f,h). Наначасціцы інсуліну, высушаныя распыленнем без манітолу, заставаліся сферычнымі, але... маршчыністая паверхня (мал. 2c). Сферычныя і маршчыністыя паверхні больш падрабязна абмяркоўваюцца ў тэстах на паводзіны вызвалення і паглынанне клеткамі ніжэй. Зыходзячы з бачнага выгляду высушаных наначасціц, як распыляльна-сушаныя наначасціцы без манітолу, так і наначасціцы, высушаныя сублімацыйным шляхам і распыляльна-сушаныя з манітолам, далі дробныя парашкі наначасціц (мал. 2f,g,h). Чым большая плошча паверхні паміж паверхнямі часціц, тым вышэйшая растваральнасць і, такім чынам, вышэйшая хуткасць вызвалення.
Марфалогія розных дэгідратаваных наначасціц інсуліну: (a) SEM-выява ліяфілізаваных наначасціц інсуліну без манітолу; (b) SEM-выява ліяфілізаваных наначасціц інсуліну з манітолам; (c) высушаныя распыленнем наначасціцы інсуліну без манітолу; SEM-выява; (d) SEM-выява наначасціц інсуліну, высушаных распыленнем з манітолам; (e) выява ліяфілізаванага парашка наначасціц інсуліну без манітолу; (f) выява ліяфілізаваных наначасціц інсуліну з манітолам; (g) выява высушанага распыленнем парашка наначасціц інсуліну без манітолу; (h) выява высушанага распыленнем парашка наначасціц інсуліну з манітолам.
Падчас сублімацыйнай сушкі маніт дзейнічае як крыяпратэктар, захоўваючы наначасціцы ў аморфнай форме і прадухіляючы пашкоджанне крышталямі лёду19. Наадварот, падчас распыляльнай сушкі няма этапу замарожвання. Таму маніт у гэтым метадзе не патрабуецца. Фактычна, распыляльна-сушаныя наначасціцы без манітолу далі больш дробныя наначасціцы, як апісана раней. Аднак маніт усё яшчэ можа выступаць у якасці напаўняльніка ў працэсе распыляльнай сушкі, надаючы наначасціцам больш сферычную структуру20 (мал. 2d), што дапамагае дасягнуць раўнамернага вызвалення такіх інкапсуляваных наначасціц. Акрамя таго, відавочна, што некаторыя буйныя часціцы можна выявіць як у сублімацыйна-сушаных, так і ў распыляльна-сушаных наначасціцах інсуліну, якія змяшчаюць маніт (мал. 2b,d), што можа быць звязана з назапашваннем манітолу ў асяродку часціцы разам з інкапсуляваным інсулінам. Пласт хітазану. Варта адзначыць, што ў гэтым даследаванні, каб гарантаваць захаванне сферычнай структуры пасля дэгідратацыі, суадносіны манітолу і хітазану захоўваюцца на ўзроўні 5:1, так што вялікая колькасць напаўняльніка таксама можа павялічыць памер часціц высушаных наначасціц.
Інфрачырвоная спектраскапія з поўным адлюстраваннем з пераўтварэннем Фур'е ў інфрачырвоным выпраменьванні з аслабленым пераўтварэннем Фур'е (FTIR-ATR) характарызавала фізічную сумесь свабоднага інсуліну, хітазану, хітазану, TPP і інсуліну. Усе дэгідратаваныя наначасціцы былі ахарактарызаваны з дапамогай FTIR-ATR спектраскапіі. Прыкметна, што інтэнсіўнасць палос 1641, 1543 і 1412 см-1 назіралася ў інкапсуляваных наначасціцах, высушаных сублімацыяй з манітолам, і ў наначасціцах, высушаных распыленнем з манітолам і без яго (мал. 3). Як паведамлялася раней, гэта павелічэнне трываласці было звязана са зшываннем паміж хітазанам, TPP і інсулінам. Даследаванне ўзаемадзеяння паміж хітазанам і інсулінам паказала, што ў FTIR-спектрах наначасціц хітазану, загружаных інсулінам, паласа хітазану перакрывалася з паласой інсуліну, павялічваючы інтэнсіўнасць карбанільнай (1641 см-1) і амінавай (1543 см-1) паласы. Трыполіфасфатныя групы TPP звязаны з амоніевымі групамі ў хітазане, утвараючы паласу пры 1412 см-1.
Спектры ІЧ-ПДВЧ свабоднага інсуліну, хітазану, фізічных сумесяў хітазан/ТФП/інсулін і наначасціц, абязводжаных рознымі метадамі.
Акрамя таго, гэтыя вынікі адпавядаюць вынікам сканіруючай электроннай мікраскапіі (СЭМ), якая паказала, што інкапсуляваныя наначасціцы заставаліся цэлымі як пры распыленні, так і пры ліафілізацыі з манітолам, але пры адсутнасці манітолу толькі распыляльная сушка ўтварала інкапсуляваныя часціцы. Наадварот, спектральныя вынікі ІЧ-ПДВЧ-спектраскапіі для наначасціц, высушаных ліафілізацыяй без манітолу, былі вельмі падобныя на фізічную сумесь хітазану, ТФП і інсуліну. Гэты вынік сведчыць аб тым, што злучэнні паміж хітазанам, ТФП і інсулінам больш не прысутнічаюць у наначасціцах, высушаных ліафілізацыяй без манітолу. Структура наначасціц была разбурана падчас ліафілізацыі без крыяпратэктара, што можна ўбачыць у выніках СЭМ (мал. 2а). Зыходзячы з марфалогіі і вынікаў ІЧ-спектраскапіі (ФРЭ) дэгідратаваных наначасціц інсуліну, для эксперыментаў па рэканстытуцыі выкарыстоўваліся толькі ліяфілізаваныя, высушаныя распыленнем і без манітолу наначасціцы, а для наначасціц без манітолу — з-за раскладання наначасціц без манітолу падчас дэгідратацыі. Абмяркуйце далей.
Дэгідратацыя выкарыстоўваецца для працяглага захоўвання і перапрацоўкі ў іншыя прэпараты. Здольнасць сухіх наначасціц да аднаўлення пасля захоўвання мае вырашальнае значэнне для іх выкарыстання ў розных прэпаратах, такіх як таблеткі і плёнкі. Мы заўважылі, што сярэдні памер часціц высушаных распыленнем наначасціц інсуліну без манітолу павялічыўся толькі нязначна пасля аднаўлення. З іншага боку, памер часціц высушаных распыленнем і ліафілізаваных наначасціц інсуліну з манітолам значна павялічыўся (табліца 1). PDI і EE істотна не змяніліся (p > 0,05) пасля рэкамбінацыі ўсіх наначасціц у гэтым даследаванні (табліца 1). Гэты вынік паказвае, што большасць часціц засталіся цэлымі пасля паўторнага растварэння. Аднак даданне манітолу прывяло да значнага зніжэння інсулінавай нагрузкі ліяфілізаваных і высушаных распыленнем наначасціц манітолу (табліца 1). Наадварот, утрыманне інсулінавай нагрузкі ў наначасціцах, высушаных распыленнем без манітолу, засталося такім жа, як і раней (табліца 1).
Добра вядома, што загрузка наначасціц мае вырашальнае значэнне пры выкарыстанні для дастаўкі лекаў. Для наначасціц з нізкай загрузкай патрабуецца вельмі вялікая колькасць матэрыялу для дасягнення тэрапеўтычнага парога. Аднак высокая глейкасць такіх высокіх канцэнтрацый наначасціц прыводзіць да нязручнасцей і цяжкасцей пры пероральным прыёме і ін'екцыйных прэпаратах, адпаведна 22. Акрамя таго, наначасціцы інсуліну таксама можна выкарыстоўваць для вырабу таблетак і глейкіх біяплёнак 23, 24, што патрабуе выкарыстання вялікай колькасці наначасціц пры нізкіх узроўнях загрузкі, у выніку чаго ўтвараюцца вялікія таблеткі і тоўстыя біяплёнкі, якія не падыходзяць для перорального прымянення. Такім чынам, абязводжаныя наначасціцы з высокай нагрузкай інсуліну вельмі пажаданыя. Нашы вынікі сведчаць аб тым, што высокая нагрузка інсуліну ў наначасціцах, высушаных распыленнем без манітолу, можа прапанаваць шмат прывабных пераваг для гэтых альтэрнатыўных метадаў дастаўкі.
Усе абязводжаныя наначасціцы захоўваліся ў халадзільніку на працягу трох месяцаў. Вынікі SEM паказалі, што марфалогія ўсіх абязводжаных наначасціц істотна не змянілася на працягу трох месяцаў захоўвання (мал. 4). Пасля аднаўлення ў вадзе ўсе наначасціцы прадэманстравалі нязначнае зніжэнне EE і вызвалілі прыблізна невялікую колькасць (~5%) інсуліну на працягу трохмесячнага перыяду захоўвання (табліца 2). Аднак сярэдні памер часціц усіх наначасціц павялічыўся. Памер часціц наначасціц, высушаных распыленнем без манітолу, павялічыўся да 525 нм, у той час як памер часціц наначасціц, высушаных распыленнем і сублімацыяй з манітолам, павялічыўся да 872 і 921 нм адпаведна (табліца 2).
Марфалогія розных дэгідратаваных наначасціц інсуліну, якія захоўваліся на працягу трох месяцаў: (а) SEM-выява ліяфілізаваных наначасціц інсуліну з манітолам; (б) SEM-выява высушаных распыленнем наначасціц інсуліну без манітолу; (в) без манітолу SEM-выявы высушаных распыленнем наначасціц інсуліну.
Акрамя таго, у адноўленых наначасціцах інсуліну, высушаных распыленнем з манітолам і замарожвальнай сушкай (мал. S2), назіраліся асадкі. Гэта можа быць выклікана тым, што буйныя часціцы не належным чынам суспендуюцца ў вадзе. Усе вышэйзгаданыя вынікі паказваюць, што тэхніка распыляльнай сушкі можа абараніць наначасціцы інсуліну ад абязводжвання і што высокія загружанні наначасціц інсуліну можна атрымаць без якіх-небудзь напаўняльнікаў або крыяпратэктараў.
Затрымка інсуліну была праверана ў асяроддзі з pH = 2,5 з пепсінам, трыпсінам і α-хіматрыпсінам, каб прадэманстраваць ахоўную здольнасць наначасціц супраць ферментатыўнага пераварвання пасля дэгідратацыі. Затрымка інсуліну дэгідратаванымі наначасціцамі параўноўвалася з затрымкай інсуліну свежапрыгатаванымі наначасціцамі, а свабодны інсулін выкарыстоўваўся ў якасці адмоўнага кантролю. У гэтым даследаванні свабодны інсулін прадэманстраваў хуткую элімінацыю інсуліну на працягу 4 гадзін ва ўсіх трох ферментатыўных апрацоўках (мал. 5a-c). Наадварот, тэставанне элімінацыі інсуліну наначасціц, высушаных ліафіляцыйным шляхам з манітолам, і наначасціц, высушаных распыленнем з манітолам або без яго, паказала значна больш высокую абарону гэтых наначасціц ад ферментатыўнага пераварвання, якая была падобная да абароны свежапрыгатаваных наначасціц інсуліну (малюнак 1).5a-c). З дапамогай наначасціц у пепсіне, трыпсіне і α-хіматрыпсіне больш за 50%, 60% і 75% інсуліну маглі быць абаронены на працягу 4 гадзін адпаведна (мал. 5a-c). Гэтая інсулінаахоўная здольнасць можа павялічыць верагоднасць больш высокага ўсмоктвання інсуліну ў кроў25. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што распыленне... Сушка з манітолам або без яго, а таксама ліафілізацыя з манітолам могуць захаваць інсулінаахоўную здольнасць наначасціц пасля дэгідратацыі.
Абарона і вызваленне дэгідратаваных наначасціц інсуліну: (а) абарона інсуліну ў растворы пепсіну; (б) абарона інсуліну ў растворы трыпсіну; (в) абарона інсуліну растворам α-хіматрыпсіну; (г) Вызваленне дэгідратаваных наначасціц у растворы з pH = 2,5; (д) Вызваленне дэгідратаваных наначасціц у растворы з pH = 6,6; (е) Вызваленне дэгідратаваных наначасціц у растворы з pH = 7,0.
Свежапрыгатаваныя і адноўленыя сухія наначасціцы інсуліну інкубавалі ў розных буферах (pH = 2,5, 6,6, 7,0) пры тэмпературы 37 °C, імітуючы pH-асяроддзе страўніка, дванаццаціперснай кішкі і верхняй часткі тонкай кішкі, каб вывучыць уплыў інсуліну на інсулінарэзістэнтнасць. Паводзіны вызвалення ў розных асяроддзях. Фрагмент страўнікава-кішачнага тракту. Пры pH = 2,5 наначасціцы, загружаныя інсулінам, і растваральныя сухія наначасціцы інсуліну прадэманстравалі першапачатковае выбуховае вызваленне на працягу першай гадзіны, а затым павольнае вызваленне на працягу наступных 5 гадзін (мал. 5d). Гэта хуткае вызваленне ў пачатку, хутчэй за ўсё, з'яўляецца вынікам хуткай паверхневай дэсорбцыі малекул бялку, якія не цалкам імабілізаваны ва ўнутранай структуры часціцы. Пры pH = 6,5 наначасціцы, загружаныя інсулінам, і адноўленыя сухія наначасціцы інсуліну прадэманстравалі плаўнае і павольнае вызваленне на працягу 6 гадзін, паколькі pH тэставага раствора быў падобны да pH раствора, прыгатаванага з наначасціц (мал. 5e). Пры pH = 7 наначасціцы былі нестабільнымі і амаль цалкам расклаліся на працягу першых двух гадзін (мал. 5f). Гэта звязана з тым, што дэпратанацыя хітазану адбываецца пры больш высокім pH, што прыводзіць да менш кампактнай палімернай сеткі і вызвалення загружанага інсуліну.
Акрамя таго, наначасціцы інсуліну, высушаныя распыленнем без манітолу, прадэманстравалі больш хуткі профіль вызвалення, чым іншыя дэгідратаваныя наначасціцы (мал. 5d–f). Як апісана раней, адноўленыя наначасціцы інсуліну, высушаныя без манітолу, прадэманстравалі найменшы памер часціц. Дробныя часціцы забяспечваюць большую плошчу паверхні, таму большая частка адпаведнага прэпарата будзе знаходзіцца на паверхні часціц або паблізу яе, што прывядзе да хуткага вызвалення прэпарата26.
Цытатоксічнасць наначасціц даследавалася з дапамогай МТТ-аналізу. Як паказана на малюнку S4, усе дэгідратаваныя наначасціцы не аказвалі істотнага ўплыву на жыццяздольнасць клетак пры канцэнтрацыях 50–500 мкг/мл, што сведчыць аб тым, што ўсе дэгідратаваныя наначасціцы можна бяспечна выкарыстоўваць для дасягнення тэрапеўтычнага акна.
Печань — галоўны орган, праз які інсулін выконвае свае фізіялагічныя функцыі. Клеткі HepG2 — гэта лінія клетак гепатомы чалавека, якая звычайна выкарыстоўваецца ў якасці мадэлі паглынання гепатацытамі in vitro. Тут клеткі HepG2 выкарыстоўваліся для ацэнкі паглынання клеткамі наначасціц, абязводжаных метадамі сублімацыйнай і распыляльнай сушкі. Паглынанне клеткамі вызначалася канфакальным лазерным сканаваннем з выкарыстаннем праточнай цытаметрыі і зроку пасля некалькіх гадзін інкубацыі са свабодным інсулінам FITC у канцэнтрацыі 25 мкг/мл, свежапрыгатаванымі наначасціцамі, загружанымі інсулінам FITC, і абязводжанымі наначасціцамі, загружанымі інсулінам FITC, пры аднолькавых канцэнтрацыях інсуліну. Былі праведзены назіранні з дапамогай колькаснай мікраскапіі (CLSM). Ліяфілізаваныя наначасціцы без манітолу былі разбураны падчас абязводжвання і не ацэньваліся ў гэтым тэсце. Інтэнсіўнасць унутрыклеткавай флуарэсцэнцыі свежапрыгатаваных наначасціц, загружаных інсулінам, ліяфілізаваных наначасціц з манітолам і распыляльна-высушаных наначасціц з манітолам і без яго (мал. 6a) была ў 4,3, 2,6, 2,4 і 4,1 разы вышэй, чым у свабодных. Група FITC-інсулін адпаведна. (Мал. 6b). Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што інкапсуляваны інсулін больш эфектыўна паглынаецца клеткамі, чым свабодны інсулін, галоўным чынам з-за меншага памеру наначасціц, загружаных інсулінам, якія былі атрыманы ў даследаванні.
Паглынанне клеткамі HepG2 пасля 4 гадзін інкубацыі са свежапрыгатаванымі наначасціцамі і абязводжанымі наначасціцамі: (а) Размеркаванне паглынання FITC-інсуліну клеткамі HepG2. (б) Сярэдняе геаметрычнае значэнне інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі, прааналізаванае з дапамогай праточнай цытаметрыі (n = 3), *P < 0,05 у параўнанні са свабодным інсулінам.
Аналагічным чынам, выявы CLSM паказалі, што інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі FITC свежапрыгатаваных наначасціц, загружаных FITC інсулінам, і наначасціц, высушаных распыленнем, загружаных FITC інсулінам (без манітолу), была значна мацнейшай, чым у іншых узораў (мал. 6a). Акрамя таго, з даданнем манітолу больш высокая глейкасць раствора павялічвала супраціўленне клеткаваму паглынанню, што прыводзіла да зніжэння праліферацыі інсуліну. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што наначасціцы, высушаныя распыленнем без манітолу, праяўлялі найвышэйшую эфектыўнасць клеткавага паглынання, паколькі памер іх часціц быў меншым, чым у ліафілізаваных наначасціц пасля паўторнага растварэння.
Хітазан (сярэдняя малекулярная маса 100 кДа, 75–85% дэацэтыляваны) быў набыты ў Sigma-Aldrich (Оквіл, Антарыё, Канада). Трыпаліфасфат натрыю (TPP) быў набыты ў VWR (Раднор, Пенсільванія, ЗША). Рэкамбінантны чалавечы інсулін, які выкарыстоўваўся ў гэтым даследаванні, быў атрыманы ад Fisher Scientific (Уолтэм, Масачусэтс, ЗША). Чалавечы інсулін, мечаны флуарэсцэінізатыяцыянатам (FITC), і 4',6-дыямідына-2-феніліндол дыгідрахларыд (DAPI) былі набыты ў Sigma-Aldrich (Оквіл, Антарыё, Канада). Клетачная лінія HepG2 была атрымана ад ATCC (Манасас, Вірджынія, ЗША). Усе астатнія рэагенты былі аналітычнага або храматаграфічнага класа.
Прыгатуйце раствор CS з канцэнтрацыяй 1 мг/мл, растварыўшы яго ў двайной дыстыляванай вадзе (DD-вада), якая змяшчае 0,1% воцатнай кіслаты. Прыгатуйце растворы TPP і інсуліну з канцэнтрацыяй 1 мг/мл, растварыўшы іх у DD-вадзе і 0,1% воцатнай кіслаце адпаведна. Папярэдняя эмульсія была падрыхтавана з дапамогай хуткаснага гамагенізатара Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ЗША). Працэс падрыхтоўкі наступны: спачатку 2 мл раствора TPP дадаюць да 4 мл раствора інсуліну і сумесь змешваюць на працягу 30 хвілін да поўнага змешвання. Затым змяшаны раствор дадаюць па кроплях да раствора CS праз шпрыц пры хуткасным перамешванні (10 000 абаротаў у хвіліну). Сумесі вытрымліваюць пры хуткасным перамешванні (15 000 абаротаў у хвіліну) на ледзяной лазні на працягу 30 хвілін і даводзяць да пэўнага pH для атрымання зшытых наначасціц інсуліну. Для далейшай гамагенізацыі і памяншэння памеру часціц наначасціц інсуліну іх апрацоўваюць ультрагукам яшчэ 30 хвілін у... ледзяная ванна з выкарыстаннем ультрагукавога апарата зондавага тыпу (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Тэльтаў, Германія).
Наначасціцы інсуліну былі пратэставаны на Z-сярэдні дыяметр, індэкс полідысперснасці (PDI) і дзета-патэнцыял з выкарыстаннем вымярэнняў дынамічнага рассейвання святла (DLS) з выкарыстаннем Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Аўстрыя) шляхам развядзення іх у вадзе DD пры тэмпературы 25°C. Марфалогія і размеркаванне памераў былі ахарактарызаваны з дапамогай прасвечвальнага электроннага мікраскопа (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Токіо, Японія), а выявы былі пасля прааналізаваны з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння для візуалізацыі Hitachi (Hitachi, Токіо, Японія). Для ацэнкі эфектыўнасці інкапсуляцыі (EE) і ёмістасці загрузкі (LC) наначасціц інсуліну, наначасціцы былі піпеткай перанесены ў ультрафільтрацыйныя прабіркі з малекулярнай масай 100 кДа і цэнтрыфугаваны пры 500 x g на працягу 30 хвілін. Неінкапсуляваны інсулін у фільтраце быў колькасна вызначаны з выкарыстаннем сістэмы ВЭЖХ Agilent серыі 1100 (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, ЗША), якая складаецца з чацвярцічнага помпы, аўтаматычнага самаадводчыка, награвальніка калонкі і дэтэктара DAD. Інсулін быў прааналізаваны. з дапамогай калонкі C18 (Zorbax, 3,5 мкм, 4,6 мм × 150 мм, Agilent, ЗША) і выяўленне пры 214 нм. Рухомай фазай былі ацэтанітрыл і вада, якія змяшчалі 0,1% TFA, градыентныя суадносіны ад 10/90 да 100/0, і працавалі 10 хвілін. Рухомая фаза прапампоўвалася з хуткасцю патоку 1,0 мл/мін. Тэмпература калонкі была ўстаноўлена на 20 °C. Разлічыце працэнты EE і LC, выкарыстоўваючы ўраўненні (1) і ўраўненне (2).
Для аптымізацыі наначасціц інсуліну былі пратэставаны розныя суадносіны CS/інсулін у дыяпазоне ад 2,0 да 4,0. Падчас падрыхтоўкі дадаваліся розныя колькасці раствора CS, пры гэтым сумесь інсуліну/TPP падтрымлівалася пастаяннай. Наначасціцы інсуліну рыхтавалі ў дыяпазоне pH ад 4,0 да 6,5 шляхам стараннага кантролю pH сумесі пасля дадання ўсіх раствораў (інсуліну, TPP і CS). Энергетическая каштоўнасць (EE) і памер часціц наначасціц інсуліну ацэньваліся пры розных значэннях pH і масавых суадносінах CS/інсуліну для аптымізацыі ўтварэння наначасціц інсуліну.
Аптымізаваныя наначасціцы інсуліну былі размешчаны на алюмініевым кантэйнеры і пакрыты тканінай, зацягнутай скотчам. Пасля гэтага кантэйнеры з закручанымі вечкамі былі змешчаны ў сублімацыйную сушылку Labconco FreeZone (Labconco, Канзас-Сіці, штат Місуры, ЗША), абсталяваную латковай сушылкай. Тэмпература і вакуумны ціск былі ўсталяваны на ўзроўні -10 °C, 0,350 Торр на працягу першых 2 гадзін і 0 °C, 0,120 Торр на працягу астатніх 22 гадзін з 24 гадзін для атрымання сухіх наначасціц інсуліну.
Для атрымання інкапсуляванага інсуліну выкарыстоўвалася міні-распыляльная сушылка Buchi B-290 (BÜCHI, Флавіль, Швейцарыя). Выбраныя параметры сушкі былі наступнымі: тэмпература 100 °C, паток падачы 3 л/мін і паток газу 4 л/мін.
Наначасціцы інсуліну да і пасля дэгідратацыі былі ахарактарызаваны з дапамогай ІЧ-Фур'е-АТР-спектраскапіі. Дэгідратаваныя наначасціцы, а таксама свабодны інсулін і хітазан былі прааналізаваны з дапамогай ІЧ-Фур'е-спектрафатометра Spectrum 100 (PerkinElmer, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША), абсталяванага універсальным прыстасаваннем для адбору пробаў у рэжыме АТР (PerkinElmer, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША). Усярэдненыя значэнні сігналу былі атрыманы з 16 сканаванняў з дазволам 4 см² у дыяпазоне частот 4000-600 см².
Марфалогія сухіх наначасціц інсуліну ацэньвалася з дапамогай SEM-выяў ліафілізаваных і распыляльна-высушаных наначасціц інсуліну, атрыманых з дапамогай сканіруючага электроннага мікраскопа з факусаваным іённым праменем (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Хілсбара, Арэгон, ЗША). Асноўнымі параметрамі былі напружанне 5 кэВ і ток 30 мА.
Усе абязводжаныя наначасціцы інсуліну былі зноў раствараны ў дэгідратаванай вадзе. Памер часціц, PDI, EE і LC былі зноў пратэставаны з выкарыстаннем таго ж метаду, што і раней, для ацэнкі іх якасці пасля абязводжвання. Стабільнасць наначасціц ангідраінсуліну таксама вымяралася шляхам тэставання ўласцівасцей наначасціц пасля працяглага захоўвання. У гэтым даследаванні ўсе наначасціцы пасля абязводжвання захоўваліся ў халадзільніку на працягу трох месяцаў. Пасля трох месяцаў захоўвання наначасціцы былі пратэставаны на марфалагічны памер часціц, PDI, EE і LC.
Растварыце 5 мл адноўленых наначасціц у 45 мл, якія змяшчаюць імітаваную страўнікавую вадкасць (pH 1,2, якая змяшчае 1% пепсіну), кішачную вадкасць (pH 6,8, якая змяшчае 1% трыпсіну) або раствор хіматрыпсіну (100 г/мл, у фасфатным буферы, pH 7,8), каб ацаніць эфектыўнасць інсуліну ў абароне наначасціц пасля дэгідратацыі. Іх інкубавалі пры тэмпературы 37°C са хуткасцю перамешвання 100 аб/мін. 500 мкл раствора збіралі ў розныя моманты часу, і канцэнтрацыю інсуліну вызначалі з дапамогай ВЭЖХ.
Паводзіны вызвалення свежапрыгатаваных і абязводжаных наначасціц інсуліну in vitro былі правераны метадам дыялізнага мяшка (парога малекулярнай масы 100 кДа, Spectra Por Inc.). Свежапрыгатаваныя і адноўленыя сухія наначасціцы былі дыялізаваны ў вадкасцях пры pH 2,5, pH 6,6 і pH 7,0 (0,1 М фасфатна-буферны фізраствор, PBS) для мадэлявання pH асяроддзя страўніка, дванаццаціперснай кішкі і верхняй часткі тонкай кішкі адпаведна. Усе ўзоры інкубавалі пры тэмпературы 37 °C пры бесперапынным страсенні са хуткасцю 200 аб/мін. Аспіруйце вадкасць па-за 5-мілілітровым дыялізным мяшком у наступны час: 0,5, 1, 2, 3, 4 і 6 гадзін і неадкладна папаўняйце аб'ём свежым дыялізатам. Забруджванне інсулінам у вадкасці было прааналізавана з дапамогай ВЭЖХ, і хуткасць вызвалення інсуліну з наначасціц была разлічана па суадносінах вызваленага свабоднага інсуліну да агульнага інсуліну, інкапсуляванага ў наначасціцах (раўнанне 3).
Клеткі лініі клетак гепатацэлюлярнай карцыномы чалавека HepG2 вырошчвалі ў чашках дыяметрам 60 мм з выкарыстаннем мадыфікаванага асяроддзя Ігла Дульбека (DMEM), якое змяшчала 10% фетальнай бычынай сыроваткі, 100 МЕ/мл пеніцыліну і 100 мкг/мл стрэптаміцыну29. Культуры падтрымлівалі пры тэмпературы 37°C, адноснай вільготнасці 95% і 5% CO2. Для аналізу паглынання клеткі HepG2 высейвалі ў колькасці 1 × 105 клетак/мл на 8-лункавую сістэму слайдаў Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, Нью-Ёрк, ЗША). Для аналізу цытатаксічнасці іх высейвалі ў 96-лункавыя планшэты (Corning, Нью-Ёрк, ЗША) пры шчыльнасці 5 × 104 клетак/мл.
Для ацэнкі цытатаксічнасці свежапрыгатаваных і дэгідратаваных наначасціц інсуліну30 выкарыстоўвалі МТТ-аналіз. Клеткі HepG2 высейвалі ў 96-лункавыя пласціны пры шчыльнасці 5 × 10⁴ клетак/мл і культывавалі на працягу 7 дзён перад тэставаннем. Наначасціцы інсуліну разводзілі да розных канцэнтрацый (ад 50 да 500 мкг/мл) у культуральным асяроддзі, а затым уводзілі ў клеткі. Пасля 24 гадзін інкубацыі клеткі тройчы прамывалі PBS і інкубавалі з асяроддзем, якое змяшчала 0,5 мг/мл МТТ, на працягу дадатковых 4 гадзін. Цытатаксічнасць ацэньвалі шляхам вымярэння ферментатыўнага аднаўлення жоўтага тэтразоліевага МТТ да фіялетавага фармазану пры 570 нм з выкарыстаннем спектрафатометра Tecan infinite M200 pro (Tecan, Манэдорф, Швейцарыя).
Эфектыўнасць паглынання наначасціц клеткамі была праверана з дапамогай канфакальнай лазернай сканіруючай мікраскапіі і праточнай цытаметрыі. Кожную лунку сістэмы камерных слайдаў Nunc Lab-Tek апрацоўвалі свабодным FITC-інсулінам, наначасціцамі, загружанымі FITC-інсулінам, і аднаўлялі 25 мкг/мл дэгідратаваных наначасціц FITC-інсуліну ў той жа канцэнтрацыі і інкубавалі на працягу 4 гадзін. Клеткі прамывалі 3 разы PBS і фіксавалі 4% парафармальдэгідам. Ядры афарбоўвалі 4',6-дыямідзіна-2-феніліндолам (DAPI). Лакалізацыя інсуліну назіралася з дапамогай лазернага сканіруючага/двухфатоннага канфакальнага мікраскопа Olympus FV1000 (Olympus, горад Сіндзюку, Токіо, Японія). Для праточнай цытаметрыі тыя ж канцэнтрацыі 10 мкг/мл свабоднага FITC-інсуліну, наначасціц, загружаных FITC-інсулінам, і рэсалюбілізаваных дэгідратаваных наначасціц FITC-інсуліну дадавалі ў 96-лункавыя планшэты, засеяныя клеткамі HepG2, і інкубавалі на працягу 4 гадзін. Пасля 4 гадзін інкубацыі клеткі выдалялі і тройчы прамывалі FBS. 5 × 10⁴ клетак на ўзор аналізавалі з дапамогай праточнага цытаметра BD LSR II (BD, Франклін-Лэйкс, Нью-Джэрсі, ЗША).
Усе значэнні прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне. Параўнанні паміж усімі групамі ацэньваліся з дапамогай аднафактарнага дысперсійнага аналізу або t-крытэрыя з выкарыстаннем праграмы IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Нью-Ёрк, ЗША), і значэнне p < 0,05 лічылася статыстычна значным.
Гэта даследаванне дэманструе гнуткасць і здольнасць распыляльнай сушкі дэгідратаваць зшытыя наначасціцы хітазан/TPP/інсулін з лепшым аднаўленнем у параўнанні са стандартнымі метадамі сублімацыйнай сушкі з выкарыстаннем напаўняльнікаў або крыяпратэктараў і больш высокай грузападымальнасцю. Аптымізаваныя наначасціцы інсуліну далі сярэдні памер часціц 318 нм і эфектыўнасць інкапсуляцыі 99,4%. Вынікі SEM і FTIR пасля дэгідратацыі паказалі, што сферычная структура захоўвалася толькі ў распыляльна-сушаных наначасціцах з манітолам і без яго, а таксама ліяфілізаваных з манітолам, але ліяфілізаваныя наначасціцы без манітолу раскладаліся падчас дэгідратацыі. У тэсце на здольнасць да аднаўлення наначасціцы інсуліну, высушаныя распыленнем без манітолу, паказалі найменшы сярэдні памер часціц і найбольшую нагрузку пры аднаўленні. Паводзіны вызвалення ўсіх гэтых дэгідратаваных наначасціц паказалі, што яны хутка вызваляліся ў растворах з pH = 2,5 і pH = 7 і вельмі стабільныя ў растворы з pH = 6,5. У параўнанні з іншымі паўторна растворанымі дэгідратаванымі наначасціцамі, распыляльна-сушаныя наначасціцы без манітолу паказалі найбольшую хуткасць. вызваленне. Гэты вынік адпавядае вынікам, якія назіраліся ў аналізе клеткавага паглынання, паколькі высушаныя распыленнем наначасціцы ў адсутнасць манітолу амаль цалкам захавалі эфектыўнасць клеткавага паглынання свежапрыгатаваных наначасціц. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што сухія наначасціцы інсуліну, падрыхтаваныя распыляльнай сушкай без манітолу, найбольш падыходзяць для далейшай перапрацоўкі ў іншыя бязводныя лекавыя формы, такія як таблеткі для прыёму ўнутр або біяадгезіўныя плёнкі.
З-за праблем інтэлектуальнай уласнасці наборы даных, створаныя і/або прааналізаваныя падчас гэтага даследавання, не з'яўляюцца публічна даступнымі, але могуць быць атрыманы ад адпаведных аўтараў па разумным запыце.
Каган, А. Дыябет 2 тыпу: сацыяльнае і навуковае паходжанне, медыцынскія ўскладненні і наступствы для пацыентаў і іншых. (McFarlane, 2009).
Сінгх, А.П., Го, Ю., Сінгх, А., Се, У. і Цзян, П. Распрацоўка інкапсуляцыі інсуліну: ці магчыма цяпер пероральнае ўвядзенне? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Вонг, К.Й., Аль-Саламі, Х. і Дас, К.Р. Апошнія дасягненні ў галіне пероральных сістэм дастаўкі інсуліну з ліпасомамі для лячэння дыябету. Інтэрпрэтацыя. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).