Артыкул з'яўляецца часткай даследчай тэмы «Павышэнне ўстойлівасці бабовых да патагенаў і шкоднікаў», праглядзець усе 5 артыкулаў
Узбуджальнік грыбковай хваробы раслін некрозу Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary выкарыстоўвае шмат'ярусную стратэгію для заражэння розных раслін-гаспадароў. У гэтым даследаванні прапануецца выкарыстоўваць дыямін L-арніцін, небялковую амінакіслату, якая стымулюе сінтэз іншых незаменных амінакіслот, у якасці альтэрнатыўнай стратэгіі барацьбы з узмацненнем малекулярных, фізіялагічных і біяхімічных рэакцый Phaseolus vulgaris L. на белую цвіль, выкліканую Pseudomonas sclerotiorum. Эксперыменты in vitro паказалі, што L-арніцін значна інгібіруе рост міцэлію S. pyrenoidosa дозазалежным чынам. Больш за тое, ён можа значна знізіць цяжкасць белай цвілі ў цяплічных умовах. Акрамя таго, L-арніцін стымуляваў рост апрацаваных раслін, што сведчыць аб тым, што правераныя канцэнтрацыі L-арніціну не былі фітатаксічнымі для апрацаваных раслін. Акрамя таго, L-арніцін павялічыў экспрэсію неферментыўных антыаксідантаў (агульная колькасць растваральных фенольных злучэнняў і флаваноідаў) і ферментыўных антыаксідантаў (каталаза (CAT), пераксідаза (POX) і поліфенолаксідаза (PPO)), а таксама павялічыў экспрэсію трох генаў, звязаных з антыаксідантамі (PvCAT1, PvSOD і PvGR). Больш за тое, аналіз in silico выявіў наяўнасць меркаванага бялку аксалаацэтылгідралазы (SsOAH) у геноме S. sclerotiorum, які быў вельмі падобны да бялкоў аксалаацэтылгідралазы (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) і Penicillium sp. (PlOAH) з пункту гледжання функцыянальнага аналізу, кансерватыўных даменаў і тапалогіі. Цікава, што даданне L-арніціну да асяроддзя бульбянога дэкстрознага булёна (PDB) значна знізіла экспрэсію гена SsOAH у міцэліі S. sclerotiorum. Падобным чынам, экзагеннае ўжыванне L-арніціну значна знізіла экспрэсію гена SsOAH у грыбковым міцэліі, сабраным з апрацаваных раслін. Нарэшце, ужыванне L-арніціну значна знізіла сакрэцыю шчаўевай кіслаты як у асяроддзі PDB, так і ў заражаным лісці. У заключэнне, L-арніцін адыгрывае ключавую ролю ў падтрыманні акісляльна-аднаўленчага статусу, а таксама ў павышэнні ахоўнай рэакцыі заражаных раслін. Вынікі гэтага даследавання могуць дапамагчы ў распрацоўцы інавацыйных, экалагічна чыстых метадаў барацьбы з белай цвіллю і змякчэння яе ўплыву на ўраджайнасць бабоў і іншых сельскагаспадарчых культур.
Белая цвіль, выкліканая некратрофным грыбком Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, — гэта разбуральная хвароба, якая зніжае ўраджай і ўяўляе сур'ёзную пагрозу для сусветнай вытворчасці фасолі (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum — адзін з самых складаных для кантролю глебавых грыбковых патагенаў раслін, які перадаецца праз глебу. Ён мае шырокі спектр гаспадароў, які налічвае больш за 600 відаў раслін, і здольнасць хутка разбураць тканіны гаспадара неспецыфічным чынам (Liang and Rollins, 2018). Пры неспрыяльных умовах ён праходзіць крытычную фазу свайго жыццёвага цыклу, застаючыся ў стане спакою на працягу доўгага часу ў выглядзе чорных, цвёрдых, падобных на насенне структур, якія называюцца «склероцыямі» ў глебе, або ў выглядзе белых, пухнатых нарастаў у грыбніцы або скуре сцябла заражаных раслін (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum здольны ўтвараць склероцыі, што дазваляе яму выжываць на заражаных палях працяглы час і захоўвацца падчас хваробы (Schwartz et al., 2005). Склероцыі багатыя пажыўнымі рэчывамі, могуць захоўвацца ў глебе працяглы час і служаць асноўным інакулятам для наступных інфекцый (Schwartz et al., 2005). Пры спрыяльных умовах склероцыі прарастаюць і ўтвараюць споры, якія перадаюцца па паветры, і якія могуць заразіць усе надземныя часткі расліны, у тым ліку, але не абмяжоўваючыся імі, кветкі, сцеблы або струкі (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum выкарыстоўвае шмат'ярусную стратэгію заражэння раслін-гаспадароў, якая ўключае шэраг скаардынаваных падзей, ад прарастання склерацый да развіцця сімптомаў. Спачатку S. sclerotiorum выпрацоўвае ўзважаныя споры (якія называюцца аскаспорамі) з грыбападобных структур, якія называюцца апотэцыямі, якія трапляюць у паветра і развіваюцца ў нерухомыя склерацыі на заражаных раслінных рэштках (Bolton et al., 2006). Затым грыб вылучае шчаўевую кіслату, фактар ​​вірулентнасці, для кантролю pH клеткавай сценкі расліны, садзейнічання ферментатыўнай дэградацыі і інвазіі ў тканіны (Hegedus and Rimmer, 2005), а таксама для падаўлення акісляльнага выбуху расліны-гаспадара. Гэты працэс падкіслення аслабляе клеткавую сценку расліны, ствараючы спрыяльнае асяроддзе для нармальнай і эфектыўнай працы ферментаў, якія дэградуюць клеткавую сценку грыбоў (CWDE), дазваляючы патагену пераадолець фізічны бар'ер і пранікнуць у тканіны гаспадара (Marciano et al., 1983). Пасля пранікнення S. sclerotiorum вылучае шэраг CWDE, такіх як полігалактураназа і цэлюлаза, якія спрыяюць яго распаўсюджванню ў заражаных тканінах і выклікаюць некроз тканін. Прагрэсаванне паражэнняў і гіфальных матаў прыводзіць да характэрных сімптомаў белай цвілі (Hegedus and Rimmer, 2005). Тым часам расліны-гаспадары распазнаюць малекулярныя патэрны, звязаныя з патагенам (PAMP), праз рэцэптары распазнавання патэрнаў (PRR), запускаючы серыю сігнальных падзей, якія ў канчатковым выніку актывуюць ахоўныя рэакцыі.
Нягледзячы на ​​дзесяцігоддзі намаганняў па барацьбе з хваробамі, у фасолі, як і ў іншых камерцыйных культур, захоўваецца дэфіцыт адэкватнай устойлівай зародкавай плазмы з-за ўстойлівасці, выжывальнасці і адаптыўнасці патагена. Таму барацьба з хваробамі з'яўляецца надзвычай складанай і патрабуе інтэграванай, шматграннай стратэгіі, якая ўключае спалучэнне агратэхнічных мер, біялагічнага кантролю і хімічных фунгіцыдаў (O'Sullivan et al., 2021). Хімічны кантроль белай цвілі з'яўляецца найбольш эфектыўным, таму што фунгіцыды пры правільным і своечасовым ужыванні могуць эфектыўна кантраляваць распаўсюджванне хваробы, зніжаць цяжкасць інфекцыі і мінімізаваць страты ўраджаю. Аднак празмернае выкарыстанне і празмерная залежнасць ад фунгіцыдаў можа прывесці да з'яўлення ўстойлівых штамаў S. sclerotiorum і негатыўна паўплываць на немэтавыя арганізмы, здароўе глебы і якасць вады (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Таму пошук экалагічна чыстых альтэрнатыў стаў галоўным прыярытэтам.
Паліаміны (ПА), такія як путрэсцын, спермідын, спермін і кадаверын, могуць служыць перспектыўнымі альтэрнатывамі супраць глебавых патагенаў раслін, тым самым цалкам або часткова зніжаючы выкарыстанне небяспечных хімічных фунгіцыдаў (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). У вышэйшых раслін ПА ўдзельнічаюць у многіх фізіялагічных працэсах, у тым ліку, але не абмяжоўваючыся імі, у дзяленні клетак, дыферэнцыяцыі і рэакцыі на абіятычныя і біятычныя стрэсы (Killiny and Nehela, 2020). Яны могуць выступаць у якасці антыаксідантаў, дапамагаць звязваць актыўныя формы кіслароду (АФК), падтрымліваць акісляльна-аднаўленчы гамеастаз (Nehela and Killiny, 2023), індуцыраваць гены, звязаныя з абаронай (Romero et al., 2018), рэгуляваць розныя метабалічныя шляхі (Nehela and Killiny, 2023), мадуляваць эндагенныя фітагармоны (Nehela and Killiny, 2019), усталёўваць сістэмную набытую рэзістэнтнасць (СНР) і рэгуляваць узаемадзеянне раслін з патагенамі (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Варта адзначыць, што канкрэтныя механізмы і ролі ПА ў абароне раслін адрозніваюцца ў залежнасці ад віду раслін, патагенаў і ўмоў навакольнага асяроддзя. Найбольш распаўсюджаная ПА ў раслінах біясінтэзуецца з незаменнага поліаміну L-арніціну (Killiny and Nehela, 2020).
L-арніцін гуляе мноства роляў у росце і развіцці раслін. Напрыклад, папярэднія даследаванні паказалі, што ў рысу (Oryza sativa) арніцін можа быць звязаны з рэцыркуляцыяй азоту (Liu et al., 2018), ураджайнасцю, якасцю і водарам рысу (Lu et al., 2020), а таксама рэакцыяй на водны стрэс (Yang et al., 2000). Акрамя таго, экзагеннае ўжыванне L-арніціну значна павысіла засухаўстойлівасць цукровых буракоў (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) і паменшыла салёны стрэс у раслін цыбулі (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu і Çavuşoǧlu, 2021) і кешью (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Патэнцыйная роля L-арніціну ў абароне ад абіятычнага стрэсу можа быць звязана з яго ўдзелам у назапашванні праліну ў апрацаваных раслінах. Напрыклад, раней паведамлялася, што гены, звязаныя з метабалізмам праліну, такія як гены арніціндэльта-амінатрансферазы (дэльта-OAT) і праліндэгідрагеназы (ProDH1 і ProDH2), удзельнічаюць у абароне Nicotiana benthamiana і Arabidopsis thaliana ад штамаў Pseudomonas syringae, якія не з'яўляюцца гаспадарамі (Senthil-Kumar і Mysore, 2012). З іншага боку, грыбковая арніціндэкарбаксілаза (ODC) неабходная для росту патагена (Singh et al., 2020). Таргетнае ўздзеянне на ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici праз індукаванае гаспадаром глушэнне генаў (HIGS) значна павысіла ўстойлівасць раслін таматаў да фузарыёзнага ўвядання (Singh et al., 2020). Аднак патэнцыйная роля экзагеннага прымянення арніціну ў барацьбе з біятычнымі стрэсамі, такімі як фітапатагены, недастаткова вывучана. Што яшчэ больш важна, уплыў арніціну на ўстойлівасць да хвароб і звязаныя з гэтым біяхімічныя і фізіялагічныя з'явы застаюцца ў значнай ступені невывучанымі.
Разуменне складанасці інфекцыі бабовых культур, выкліканай S. sclerotiorum, важна для распрацоўкі эфектыўных стратэгій барацьбы з ёй. У гэтым даследаванні мы імкнуліся вызначыць патэнцыйную ролю дыяміну L-арніціну як ключавога фактару ва ўзмацненні ахоўных механізмаў і ўстойлівасці бабовых раслін да інфекцыі Sclerotinia sclerotiorum. Мы выказваем гіпотэзу, што, акрамя ўзмацнення ахоўных рэакцый заражаных раслін, L-арніцін таксама адыгрывае ключавую ролю ў падтрыманні акісляльна-аднаўленчага статусу. Мы мяркуем, што патэнцыйныя эфекты L-арніціну звязаны з рэгуляцыяй ферментатыўных і неферментыўных антыаксідантных ахоўных механізмаў і ўмяшаннем у фактары патагеннасці/вірулентнасці грыбоў і звязаныя з імі бялкі. Гэтая двайная функцыянальнасць L-арніціну робіць яго перспектыўным кандыдатам для ўстойлівай стратэгіі змякчэння ўздзеяння белай цвілі і павышэння ўстойлівасці распаўсюджаных бабовых культур да гэтага магутнага грыбковага патагена. Вынікі гэтага даследавання могуць дапамагчы ў распрацоўцы інавацыйных, экалагічна чыстых метадаў барацьбы з белай цвіллю і змякчэння яе ўздзеяння на вытворчасць бабовых.
У гэтым даследаванні ў якасці эксперыментальнага матэрыялу выкарыстоўваўся ўспрымальны камерцыйны гатунак фасолі звычайнай Гіза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Здаровае насенне было ласкава прадастаўлена Аддзелам даследаванняў бабовых культур Навукова-даследчага інстытута палявых культур (FCRI), Сельскагаспадарчым даследчым цэнтрам (ARC), Егіпет. Пяць насення былі пасеяны ў пластыкавыя гаршкі (унутраны дыяметр 35 см, глыбіня 50 см), запоўненыя глебай, заражанай S. sclerotiorum, ва ўмовах цяпліцы (25 ± 2 °C, адносная вільготнасць 75 ± 1%, 8 гадзін святла/16 гадзін цемры). Праз 7–10 дзён пасля пасеву расаду прарэджвалі, каб у кожным гаршку засталося толькі дзве расады з раўнамерным ростам і трыма цалкам развітымі лістамі. Усе расліны ў гаршках палівалі адзін раз на два тыдні і штомесяц угнойвалі ў рэкамендаванай для дадзенага гатунку норме.
Для падрыхтоўкі L-арнітындыяміну (таксама вядомага як (+)-(S)-2,5-дыамінапентановая кіслата; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германія) у канцэнтрацыі 500 мг/л спачатку растварылі 50 мг у 100 мл стэрыльнай дыстыляванай вады. Затым маткавы раствор развялі і выкарысталі ў наступных эксперыментах. Карацей кажучы, шэсць серый канцэнтрацый L-арнітыну (12,5, 25, 50, 75, 100 і 125 мг/л) былі пратэставаны in vitro. Акрамя таго, стэрыльная дыстыляваная вада выкарыстоўвалася ў якасці адмоўнага кантролю (малы), а камерцыйны фунгіцыд «Rizolex-T» 50% змочвальны парашок (таклафос-метыл 20% + тырам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Кафр-эль-Заят, губернатарства Гарбія, Егіпет) выкарыстоўваўся ў якасці станоўчага кантролю. Камерцыйны фунгіцыд «Рызалекс-Т» быў пратэставаны in vitro ў пяці канцэнтрацыях (2, 4, 6, 8 і 10 мг/л).
Узоры сцеблаў і струкоў звычайнай фасолі з тыповымі сімптомамі белай цвілі (узровень заражэння: 10–30%) былі сабраны з камерцыйных ферм. Нягледзячы на ​​тое, што большасць заражаных раслінных матэрыялаў была ідэнтыфікавана па відах/гатунках (адчувальны камерцыйны гатунак Giza 3), іншыя, асабліва тыя, што былі атрыманы на мясцовых рынках, былі невядомых відаў. Спачатку сабраныя заражаныя матэрыялы былі павярхоўна дэзінфікаваны 0,5% растворам гіпахларыту натрыю на працягу 3 хвілін, затым некалькі разоў прамыты стэрыльнай дыстыляванай вадой і выцерты насуха стэрыльнай фільтравальнай паперай для выдалення лішняй вады. Затым заражаныя органы былі разрэзаны на дробныя кавалкі з сярэдняй тканкі (паміж здаровай і заражанай тканкамі), культываваны на бульбяным дэкстрозным агары (PDA) і інкубаваны пры тэмпературы 25 ± 2 °C з цыклам 12 гадзін святло/12 гадзін цемра на працягу 5 дзён для стымулявання ўтварэння склероцый. Метад міцэліальнай верхавіны таксама выкарыстоўваўся для ачысткі грыбковых ізалятаў са змешаных або забруджаных культур. Ачышчаны грыбковы ізалят быў спачатку ідэнтыфікаваны на аснове яго культуральных марфалагічных характарыстык, а затым пацверджаны як S. sclerotiorum на аснове мікраскапічных асаблівасцей. Нарэшце, усе ачышчаныя ізаляты былі правераны на патагеннасць на ўспрымальным сарце фасолі звычайнай Giza 3, каб адпавядаць пастулатам Коха.
Акрамя таго, найбольш інвазіўны ізалят S. sclerotiorum (ізалят № 3) быў дадаткова пацверджаны на аснове секвенавання ўнутранага транскрыбаванага спейсера (ITS), як апісана White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Карацей кажучы, ізаляты культывавалі ў бульбяным дэкстрозным булёне (PDB) і інкубавалі пры тэмпературы 25 ± 2 °C на працягу 5–7 дзён. Затым збіралі грыбковы міцэлій, фільтравалі праз марлю, двойчы прамывалі стэрыльнай вадой і сушылі стэрыльнай фільтравальнай паперай. Геномную ДНК вылучалі з дапамогай набору Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Затым вобласць ITS рДНК была ампліфікавана з выкарыстаннем спецыфічнай пары праймераў ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; чаканы памер: 540 пар асноў) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Ачышчаныя прадукты ПЦР былі адпраўлены на секвенаванне (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Паслядоўнасці ITS рДНК былі секвенаваны ў двух напрамках з выкарыстаннем метаду секвенавання Сангера. Сабраныя паслядоўнасці запытаў затым былі параўнаны з апошнімі дадзенымі ў GenBank і Нацыянальным цэнтры біятэхналагічнай інфармацыі (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння BLASTn. Паслядоўнасць запытаў параўноўвалася з 20 іншымі штамамі/ізалятамі S. sclerotiorum, атрыманымі з апошніх дадзеных у NCBI GenBank (Дадатковая табліца S1), з выкарыстаннем ClustalW у пакеце малекулярнага эвалюцыйнага генетычнага аналізу (MEGA-11; версія 11) (Kumar et al., 2024). Эвалюцыйны аналіз быў выкананы з выкарыстаннем метаду максімальнай праўдападобнасці і агульнай мадэлі замяшчэння нуклеатыдаў з адваротным часам (Nei and Kumar, 2000). Паказана дрэва з найвышэйшай лагарыфмічнай праўдападобнасцю. Пачатковае дрэва для эўрыстычнага пошуку выбіраецца шляхам выбару дрэва з найвышэйшай лагарыфмічнай праўдападобнасцю паміж дрэвам злучэння суседзяў (NJ) (Kumar et al., 2024) і дрэвам максімальнай эканоміі (MP). NJ-дрэва было пабудавана з выкарыстаннем парнай матрыцы адлегласцей, разлічанай з выкарыстаннем агульнай мадэлі з адваротным часам (Nei and Kumar, 2000).
Антыбактэрыйную актыўнасць L-арніціну і бактэрыцыду «Рызалекс-Т» вызначалі in vitro метадам дыфузіі ў агар. Метад: Узяць адпаведную колькасць маткавага раствора L-арніціну (500 мг/л) і старанна змяшаць яго з 10 мл пажыўнага асяроддзя PDA для падрыхтоўкі раствораў з канчатковай канцэнтрацыяй 12,5, 25, 50, 75, 100 і 125 мг/л адпаведна. У якасці кантролю выкарыстоўвалі пяць канцэнтрацый фунгіцыду «Рызалекс-Т» (2, 4, 6, 8 і 10 мг/л) і стэрыльную дыстыляваную ваду. Пасля зацвярдзення асяроддзя ў цэнтр чашкі Петры пераносілі свежапрыгатаваны міцэліальны корак культуры Sclerotinia sclerotiorum дыяметрам 4 мм і культывавалі пры тэмпературы 25±2°C, пакуль міцэлій не пакрыў усю кантрольную чашку Петры, пасля чаго фіксавалі рост грыба. Разлічыце працэнт інгібіравання радыяльнага росту S. sclerotiorum, выкарыстоўваючы ўраўненне 1:
Эксперымент паўтарылі двойчы, з шасцю біялагічнымі паўтарэннямі для кожнай кантрольнай/эксперыментальнай групы і пяццю гаршкамі (па дзве расліны ў гаршку) для кожнага біялагічнага паўтарэння. Кожны біялагічны паўтарэнне прааналізавалі двойчы (дзве тэхнічныя паўтарэнні), каб забяспечыць дакладнасць, надзейнасць і ўзнаўляльнасць эксперыментальных вынікаў. Акрамя таго, для разліку паловы максімальнай інгібіруючай канцэнтрацыі (IC50) і IC99 выкарыстоўвалі прабіт-рэгрэсійны аналіз (Prentice, 1976).
Каб ацаніць патэнцыял L-арніціну ў цяплічных умовах, былі праведзены два паслядоўныя эксперыменты ў гаршках. Карацей кажучы, гаршкі былі запоўнены стэрылізаванай глініста-пяшчанай глебай (3:1) і засеяны свежапрыгатаванай культурай S. sclerotiorum. Спачатку найбольш інвазіўны ізалят S. sclerotiorum (ізалят № 3) культывавалі, разразаючы адзін склероцый напалову, размяшчаючы яго тварам уніз на PDA і інкубуючы пры тэмпературы 25°C у пастаяннай цемры (24 гадзіны) на працягу 4 дзён для стымуляцыі росту міцэлію. Затым з пярэдняга краю былі ўзяты чатыры агаравыя пробкі дыяметрам 5 мм і засеяны 100 г стэрыльнай сумесі пшанічных і рысавых вотруб'я (1:1, аб'ём/аб'ём), і ўсе колбы інкубавалі пры тэмпературы 25 ± 2°C у цыкле 12 гадзін святло/12 гадзін цемра на працягу 5 дзён для стымуляцыі ўтварэння склероцый. Змест усіх колбаў старанна змяшалі для забеспячэння аднастайнасці перад даданнем глебы. Затым у кожны гаршчок дадалі па 100 г каланізацыйнай сумесі вотруб'я, каб забяспечыць пастаянную канцэнтрацыю патагенаў. Засеяныя гаршкі палілі для актывацыі росту грыбоў і змясцілі ў цяпліцу на 7 дзён.
Затым у кожны гаршчок высейвалі па пяць насення гатунку Giza 3. Для гаршкоў, апрацаваных L-арніцінам і фунгіцыдам Rizolex-T, стэрылізаванае насенне спачатку замочвалі на дзве гадзіны ў водным растворы двух злучэнняў з канчатковай канцэнтрацыяй IC99 каля 250 мг/л і 50 мг/л адпаведна, а затым сушылі на паветры на працягу адной гадзіны перад пасевам. З іншага боку, насенне замочвалі ў стэрыльнай дыстыляванай вадзе ў якасці адмоўнага кантролю. Праз 10 дзён, перад першым палівам, расаду прарэджвалі, пакінуўшы ў кожным гаршку толькі дзве акуратныя расады. Акрамя таго, каб забяспечыць заражэнне S. sclerotiorum, сцеблы раслін фасолі на адной стадыі развіцця (10 дзён) зразалі ў двух розных месцах з дапамогай стэрылізаванага скальпеля, і ў кожную рану змяшчалі прыблізна 0,5 г каланізацыйнай сумесі вотруб'я, а затым падтрымлівалі высокую вільготнасць для стымулявання інфекцыі і развіцця хваробы ва ўсіх інакуляваных раслінах. Кантрольныя расліны былі пашкоджаныя падобным чынам, і такая ж колькасць (0,5 г) стэрыльнай, некаланізаванай сумесі вотруб'я была змешчана ў рану і падтрымлівалася пры высокай вільготнасці, каб імітаваць асяроддзе для развіцця хваробы і забяспечыць паслядоўнасць паміж групамі лячэння.
Метад апрацоўкі: расаду фасолі палівалі 500 мл воднага раствора L-арніціну (250 мг/л) або фунгіцыду Rizolex-T (50 мг/л) шляхам арашэння глебы, затым апрацоўку паўтаралі тры разы з інтэрвалам у 10 дзён. Кантрольныя групы, якія атрымлівалі плацебо, палівалі 500 мл стэрыльнай дыстыляванай вады. Усе апрацоўкі праводзіліся ў цяплічных умовах (25 ± 2°C, адносная вільготнасць 75 ± 1% і фотаперыяд 8 гадзін святла/16 гадзін цемры). Усе гаршкі палівалі раз на два тыдні і штомесяц апрацоўвалі збалансаваным угнаеннем NPK (20-20-20, з 3,6% серы і мікраэлементамі TE; Zain Seeds, Егіпет) у канцэнтрацыі 3–4 г/л шляхам ліставага апырсквання ў адпаведнасці з рэкамендацыямі для канкрэтнага гатунку і інструкцыямі вытворцы. Калі не пазначана іншае, цалкам разрослыя лісты (2-гі і 3-ці ліст зверху) збіралі з кожнага біялагічнага паўтаральніка праз 72 гадзіны пасля апрацоўкі, гамагенізавалі, аб'ядноўвалі і захоўвалі пры тэмпературы -80 °C для далейшага аналізу, у тым ліку, але не абмяжоўваючыся гэтым, гістахімічнай лакалізацыі індыкатараў акісляльнага стрэсу in situ, перакіснага акіслення ліпідаў, ферментатыўных і неферментных антыаксідантаў і экспрэсіі генаў.
Інтэнсіўнасць заражэння белай цвіллю ацэньвалася штотыдзень праз 21 дзень пасля інакуляцыі (dpi) з выкарыстаннем шкалы ад 1 да 9 (Дадатковая табліца S2), заснаванай на шкале Петцольдта і Дыксана (1996) у мадыфікацыі Тэрана і інш. (2006). Карацей кажучы, сцеблы і галіны фасолі даследаваліся, пачынаючы з месца інакуляцыі, каб прасачыць прагрэсаванне паражэнняў уздоўж міжвузлоў і вузлоў. Затым вымяралася адлегласць паражэння ад месца інакуляцыі да самай далёкай кропкі ўздоўж сцябла або галіны, і бал ад 1 да 9 прысвойваўся ў залежнасці ад месцазнаходжання паражэння, дзе (1) паказваў на адсутнасць бачнай інфекцыі паблізу месца інакуляцыі, а (2–9) паказваў на паступовае павелічэнне памеру паражэння і прагрэсаванне ўздоўж вузлоў/міжвузлоў (Дадатковая табліца S2). Інтэнсіўнасць заражэння белай цвіллю затым пераўтваралася ў працэнты з выкарыстаннем формулы 2:
Акрамя таго, плошча пад крывой прагрэсавання хваробы (AUDPC) была разлічана па формуле (Shaner and Finney, 1977), якая нядаўна была адаптавана для белай гнілі звычайнай фасолі (Chauhan et al., 2020) з выкарыстаннем ураўнення 3:
Дзе Yi = цяжар захворвання ў момант часу ti, Yi+1 = цяжар захворвання ў наступны момант часу ti+1, ti = час першага вымярэння (у днях), ti+1 = час наступнага вымярэння (у днях), n = агульная колькасць кропак часу або пунктаў назірання. Параметры росту раслін фасолі, у тым ліку вышыня расліны (см), колькасць галін на расліну і колькасць лісця на расліну, фіксаваліся штотыдзень на працягу 21 дня ва ўсіх біялагічных паўторах.
У кожнай біялагічнай паўторнасці ўзоры лісця (другі і трэці цалкам развітыя лісце зверху) збіралі на 45-ы дзень пасля апрацоўкі (праз 15 дзён пасля апошняй апрацоўкі). Кожная біялагічная паўторнасць складалася з пяці гаршкоў (па дзве расліны ў гаршку). Каля 500 мг здробненай тканіны выкарыстоўвалі для экстракцыі фотасінтэтычных пігментаў (хларафіла а, хларафіла b і каратыноідаў) з выкарыстаннем 80% ацэтону пры тэмпературы 4 °C у цемры. Праз 24 гадзіны ўзоры цэнтрыфугавалі, і супернатант збіралі для каларыметрычнага вызначэння ўтрымання хларафіла а, хларафіла b і каратыноідаў з выкарыстаннем спектрафатометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія) згодна з метадам (Lichtenthaler, 1987) шляхам вымярэння паглынання пры трох розных даўжынях хваль (A470, A646 і A663 нм). Нарэшце, утрыманне фотасінтэтычных пігментаў разлічвалі па наступных формулах 4–6, апісаных Ліхтэнталерам (1987).
Праз 72 гадзіны пасля апрацоўкі (г.зн. г.) з кожнага біялагічнага паўтара збіралі лісце (другі і трэці цалкам развітыя лісце зверху) для гістахімічнай лакалізацыі in situ перакісу вадароду (H2O2) і супераксіднага аніёна (O2•−). Кожны біялагічны паўтор складаўся з пяці гаршкоў (дзве расліны ў гаршку). Кожны біялагічны паўтор аналізаваўся ў двух тэхнічных паўторах, каб забяспечыць дакладнасць, надзейнасць і ўзнаўляльнасць метаду. H2O2 і O2•− вызначалі з выкарыстаннем 0,1% 3,3′-дыамінабензідыну (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германія) або нітрасіняга тэтразолію (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германія) адпаведна, згодна з метадамі, апісанымі Romero-Puertas et al. (2004) і Adam et al. (1989) з невялікімі мадыфікацыямі. Для гістахімічнай лакалізацыі H2O2 in situ створкі інфільтравалі ў вакууме 0,1% DAB у 10 мМ Tris-буферы (pH 7,8), а затым інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на святла на працягу 60 хвілін. Створкі адбельвалі ў 0,15% (аб./аб.) TCA ў этаноле:хлараформе 4:1 (аб./аб.) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каір, Егіпет), а затым падвяргалі ўздзеянню святла да пацямнення. Аналагічна, клапаны інфільтравалі ў вакууме 10 мМ калій-фасфатным буферам (pH 7,8), які змяшчае 0,1 w/v % HBT, для гістахімічнай лакалізацыі O2•− in situ. Створкі інкубавалі на святла пры пакаёвай тэмпературы на працягу 20 хвілін, затым адбельвалі, як апісана вышэй, і асвятлялі да з'яўлення цёмна-сініх/фіялетавых плям. Інтэнсіўнасць атрыманага карычневага (у якасці індыкатара H2O2) або сіне-фіялетавага (у якасці індыкатара O2•−) колеру ацэньвалася з выкарыстаннем версіі пакета апрацоўкі малюнкаў ImageJ для Фіджы (http://fiji.sc; дата доступу: 7 сакавіка 2024 г.).
Малондыяльдэгід (МДА; як маркер перакіснага акіслення ліпідаў) вызначалі паводле метаду Ду і Брамладжа (1992) з невялікімі мадыфікацыямі. Лісце з кожнага біялагічнага паўтарэння (другі і трэці цалкам развітыя лісце зверху) збіралі праз 72 гадзіны пасля апрацоўкі (г.п.). Кожны біялагічны паўтор уключаў пяць гаршкоў (дзве расліны ў гаршку). Кожны біялагічны паўтор аналізавалі ў двух дублікатах (дзве тэхнічныя паўторы), каб гарантаваць дакладнасць, надзейнасць і ўзнаўляльнасць метаду. Карацей кажучы, 0,5 г здробненай тканіны лісця выкарыстоўвалі для экстракцыі МДА з 20% трыхларуксуснай кіслатой (TCA; MilliporeSigma, Берлінгтан, Масачусэтс, ЗША), якая змяшчала 0,01% буціляванага гідраксіталуолу (BHT; Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША). Затым змест МДА ў супернатанце вызначалі каларыметрычна, вымяраючы паглынанне пры 532 і 600 нм з дапамогай спектрафатометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія), а затым выказвалі ў нмоль г−1 FW.
Для ацэнкі неферментыўных і ферментыўных антыаксідантаў лісце (другі і трэці цалкам развітыя лісце зверху) збіралі з кожнага біялагічнага ўзору праз 72 гадзіны пасля апрацоўкі (г.п.). Кожны біялагічны ўзор складаўся з пяці гаршкоў (дзве расліны ў гаршку). Кожны біялагічны ўзор аналізаваўся ў двух дублікатах (два тэхнічныя ўзоры). Два лісце здрабнялі вадкім азотам і выкарыстоўвалі непасрэдна для вызначэння ферментыўных і неферментыўных антыаксідантаў, агульнай колькасці амінакіслот, утрымання праліну, экспрэсіі генаў і колькаснага вызначэння аксалату.
Агульны ўтрыманне растваральных фенольных злучэнняў вызначалі з выкарыстаннем рэагента Фоліна-Чокальтэу (Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША) з невялікімі мадыфікацыямі метаду, апісанага Кахканенам і інш. (1999). Карацей кажучы, прыблізна 0,1 г гамагенізаванай тканіны лісця экстрагавалі 20 мл 80% метанолу ў цемры на працягу 24 гадзін, а супернатант збіралі пасля цэнтрыфугавання. 0,1 мл экстракта ўзору змешвалі з 0,5 мл рэагента Фоліна-Чокальтэу (10%), страсяналі на працягу 30 секунд і пакідалі ў цемры на 5 хвілін. Затым у кожную прабірку дадавалі 0,5 мл 20% раствора карбанату натрыю (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каір, Егіпет), старанна змешвалі і інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы ў цемры на працягу 1 гадзіны. Пасля інкубацыі паглынанне рэакцыйнай сумесі вымяралі пры 765 нм з выкарыстаннем спектрафатометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія). Канцэнтрацыя агульных растваральных фенолаў у экстрактах узораў вызначалася з выкарыстаннем калібровачнай крывой галавай кіслаты (Fisher Scientific, Хэмптан, Нью-Гэмпшыр, ЗША) і выражалася ў міліграмах эквівалента галавай кіслаты на грам свежай вагі (мг GAE г-1 свежай вагі).
Агульны ўтрыманне растваральных флаваноідаў вызначалі паводле метаду Джэрыдана і інш. (2006) з невялікімі зменамі. Карацей кажучы, 0,3 мл вышэйзгаданага метанольнага экстракта змяшалі з 0,3 мл 5% раствора хларыду алюмінію (AlCl3; Fisher Scientific, Хэмптан, Нью-Гэмпшыр, ЗША), энергічна перамяшалі і затым інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 5 хвілін, пасля чаго дадалі 0,3 мл 10% раствора ацэтату калію (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каір, Егіпет), старанна змяшалі і інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін у цемры. Пасля інкубацыі паглынанне рэакцыйнай сумесі вымяралі пры 430 нм з дапамогай спектрафатометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія). Канцэнтрацыю агульных растваральных флаваноідаў у экстрактах узораў вызначалі з дапамогай калібровачнай крывой рутыну (TCI America, Портленд, Арэгон, ЗША), а затым выказвалі ў міліграмах эквівалента рутыну на грам свежай вагі (мг RE г-1 свежай вагі).
Агульны ўтрыманне свабодных амінакіслот у лісці фасолі вызначалі з выкарыстаннем мадыфікаванага рэагента нінгідрыну (Thermo Scientific Chemicals, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША) на аснове метаду, прапанаванага Ёкаямай і Хірамацу (2003) і мадыфікаванага Санам і інш. (2006). Карацей кажучы, 0,1 г здробненай тканіны экстрагавалі буферам з pH 5,4, і 200 мкл супернатанту рэагавалі з 200 мкл нінгідрыну (2%) і 200 мкл пірыдыну (10%; Spectrum Chemical, Нью-Брансўік, Нью-Джэрсі, ЗША), інкубавалі ў кіпячай вадзяной лазні на працягу 30 хвілін, затым астуджалі і вымяралі пры 580 нм з выкарыстаннем спектрафатометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія). З іншага боку, пралін вызначалі метадам Бэйтса (Bates et al., 1973). Пралін экстрагавалі 3% сульфасаліцылавай кіслатой (Thermo Scientific Chemicals, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША) і пасля цэнтрыфугавання 0,5 мл супернатанту змешвалі з 1 мл ледзяной воцатнай кіслаты (Fisher Scientific, Хэмптан, Нью-Гэмпшыр, ЗША) і нінгідрынавым рэагентам, інкубавалі пры 90°C на працягу 45 хвілін, астуджалі і вымяралі пры 520 нм з выкарыстаннем таго ж спектрафатометра, што і вышэй. Агульная колькасць свабодных амінакіслот і праліну ў экстрактах лісця вызначалі з выкарыстаннем калібровачных крывых гліцыну і праліну (Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША) адпаведна і выказвалі ў мг/г свежай вагі.
Для вызначэння ферментатыўнай актыўнасці антыаксідантных ферментаў прыблізна 500 мг гамагенізаванай тканіны экстрагавалі 3 мл 50 мМ Tris-буфера (pH 7,8), які змяшчае 1 мМ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША) і 7,5% полівінілпіралідону (PVP; Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША), цэнтрыфугавалі пры 10 000 × g на працягу 20 хвілін у халадзільніку (4 °C), і збіралі супернатант (неачышчаны экстракт фермента) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Затым каталазу (CAT) падвяргалі рэакцыі з 2 мл 0,1 М фасфатнага буфера натрыю (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША) і 100 мкл раствора H2O2 канцэнтрацыяй 269 мМ для вызначэння яе ферментатыўнай актыўнасці ў адпаведнасці з метадам Aebi (1984) з невялікімі мадыфікацыямі (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ферментатыўную актыўнасць гваякол-залежнай пераксідазы (POX) вызначалі з выкарыстаннем метаду Harrach et al. (2009). (2008) з нязначнымі мадыфікацыямі (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), а ферментатыўную актыўнасць поліфенол-аксідазы (PPO) вызначалі пасля рэакцыі з 2,2 мл 100 мМ фасфатнага буфера натрыю (pH 6,0), 100 мкл гваяколу (TCI chemicals, Портленд, Арэгон, ЗША) і 100 мкл 12 мМ H2O2. Метад быў нязначна мадыфікаваны ў параўнанні з (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Аналіз праводзілі пасля рэакцыі з 3 мл раствора катэхолу (Thermo Scientific Chemicals, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША) (0,01 М), свежапрыгатаванага ў 0,1 М фасфатным буферы (pH 6,0). Актыўнасць CAT вымяралася шляхам маніторынгу раскладання H2O2 пры 240 нм (A240), актыўнасць POX вымяралася шляхам маніторынгу павелічэння паглынання пры 436 нм (A436), а актыўнасць PPO вымяралася шляхам рэгістрацыі ваганняў паглынання пры 495 нм (A495) кожныя 30 секунд на працягу 3 хвілін з выкарыстаннем спектрафатометра UV-160A (Shimadzu, Японія).
Для выяўлення ўзроўняў транскрыптаў трох генаў, звязаных з антыаксідантамі, у тым ліку пераксісомальнай каталазы (PvCAT1; нумар доступу GenBank KF033307.1), супераксіддысмутазы (PvSOD; нумар доступу GenBank XM_068639556.1) і глутатыёнрэдуктазы (PvGR; нумар доступу GenBank KY195009.1), у лісці фасолі (другі і трэці цалкам развітыя лісці зверху) праз 72 гадзіны пасля апошняй апрацоўкі выкарыстоўвалі ПЦР у рэжыме рэальнага часу. Карацей кажучы, РНК вылучалі з выкарыстаннем набору Simply P Total RNA Extraction Kit (кат. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Кітай) у адпаведнасці з пратаколам вытворцы. Затым кДНК сінтэзавалі з выкарыстаннем набору TOP script™ cDNA Synthesis Kit у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Паслядоўнасці праймераў вышэйзгаданых трох генаў пералічаны ў дадатковай табліцы S3. У якасці гена хатняга ўтрымання выкарыстоўваўся PvActin-3 (нумар у GenBank: XM_068616709.1), а адносная экспрэсія гена была разлічана з выкарыстаннем метаду 2-ΔΔCT (Livak і Schmittgen, 2001). Была прадэманстравана стабільнасць актына ва ўмовах біятычнага стрэсу (несумяшчальнае ўзаемадзеянне паміж распаўсюджанымі бабовымі раслінамі і антракнозным грыбком Colletotrichum lindemuthianum) і абіятычнага стрэсу (засуха, засоленасць, нізкая тэмпература) (Borges et al., 2012).
Спачатку мы правялі паўнагеномны in silico аналіз бялкоў оксалаацэтылгідралазы (OAH) у S. sclerotiorum з выкарыстаннем інструмента бялок-бялковы BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Карацей кажучы, мы выкарысталі OAH з Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксід: 1191702; нумар доступу GenBank XP_040799428.1; 342 амінакіслоты) і Penicillium lagena (PlOAH; таксід: 94218; нумар доступу GenBank XP_056833920.1; 316 амінакіслот) у якасці запытных паслядоўнасцей для картаграфавання гамалагічнага бялку ў S. sclerotiorum (таксід: 5180). BLASTp быў праведзены з выкарыстаннем самых апошніх даступных дадзеных геному S. sclerotiorum з GenBank на вэб-сайце Нацыянальнага цэнтра біятэхналагічнай інфармацыі (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Акрамя таго, прадказаны ген OAH з S. sclerotiorum (SsOAH), а таксама эвалюцыйны аналіз і філагенетычнае дрэва AfOAH з A. fijiensis CBS 313.89 і PlOAH з P. lagena былі атрыманы з выкарыстаннем метаду максімальнай праўдападобнасці ў MEGA11 (Tamura et al., 2021) і мадэлі на аснове матрыцы JTT (Jones et al., 1992). Філагенетычнае дрэва было аб'яднана з аналізам множнага выраўноўвання бялковых паслядоўнасцей усіх прадказаных генаў OAH (SsOAH) з S. sclerotiorum і запытнай паслядоўнасці з выкарыстаннем інструмента выраўноўвання на аснове абмежаванняў (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007). Акрамя таго, найлепшыя амінакіслотныя паслядоўнасці SsOAH з S. sclerotiorum былі выраўнаваны з запытанымі паслядоўнасцямі (AfOAH і PlOAH) (Larkin et al., 2007) з выкарыстаннем ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), а кансерватыўныя вобласці ў выраўноўванні былі візуалізаваны з выкарыстаннем інструмента ESPript (версія 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Акрамя таго, прадказаныя функцыянальныя прадстаўнічыя дамены і кансерватыўныя ўчасткі S. sclerotiorum SsOAH былі інтэрактыўна класіфікаваны па розных сямействах з дапамогай інструмента InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Нарэшце, трохмернае (3D) мадэляванне структуры прадказанага S. sclerotiorum SsOAH было выканана з выкарыстаннем механізму распазнавання гамалогій/аналогій бялкоў (сервер Phyre2 версіі 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) і праверана з дапамогай сервера SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Прадказаныя трохмерныя структуры (фармат PDB) былі інтэрактыўна візуалізаваны з выкарыстаннем пакета UCSF-Chimera (версія 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Для вызначэння ўзроўню транскрыпцыі оксалаацэтылгідралазы (SsOAH; нумар доступу GenBank: XM_001590428.1) у міцэліі Sclerotinia sclerotiorum выкарыстоўвалі колькасную флуарэсцэнтную ПЛР у рэжыме рэальнага часу. Карацей кажучы, S. sclerotiorum інакулявалі ў колбу, якая змяшчала PDB, і змяшчалі ў інкубатар з вібрацыяй (мадэль: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ЗША) пры тэмпературы 25 ± 2 °C на 24 гадзіны пры 150 аб/мін і ў пастаяннай цемры (24 гадзіны) для стымуляцыі росту міцэлію. Пасля гэтага клеткі апрацоўвалі L-арніцінам і фунгіцыдам Rizolex-T у канчатковых канцэнтрацыях IC50 (прыблізна 40 і 3,2 мг/л адпаведна), а затым культывавалі яшчэ 24 гадзіны ў тых жа ўмовах. Пасля інкубацыі культуры цэнтрыфугавалі пры 2500 аб/мін на працягу 5 хвілін, і супернатант (грыбны міцэлій) збіралі для аналізу экспрэсіі генаў. Аналагічна, грыбны міцэлій збіралі праз 0, 24, 48, 72, 96 і 120 гадзін пасля заражэння з заражаных раслін, якія ўтварылі белую цвіль і баваўняны міцэлій на паверхні заражаных тканін. РНК экстрагавалі з грыбнога міцэлію, а затым сінтэзавалі кДНК, як апісана вышэй. Паслядоўнасці праймераў для SsOAH прыведзены ў дадатковай табліцы S3. SsActin (нумар доступу GenBank: XM_001589919.1) выкарыстоўвалі ў якасці гена хатняга ўтрымання, а адносная экспрэсія генаў разлічвалі з выкарыстаннем метаду 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001).
Шчаўевую кіслату вызначалі ў дэкстрозным булёне бульбы (PDB) і ўзорах раслін, якія змяшчалі грыбковы патаген Sclerotinia sclerotiorum, згодна з метадам Сюй і Чжана (2000) з невялікімі мадыфікацыямі. Карацей кажучы, ізаляты S. sclerotiorum высейвалі ў колбы, якія змяшчалі PDB, а затым культывавалі ў інкубатары з вібрацыяй (мадэль I2400, New Brunswick Scientific Co., Эдысан, Нью-Джэрсі, ЗША) пры 150 аб/мін пры тэмпературы 25 ± 2 °C на працягу 3-5 дзён у пастаяннай цемры (24 гадзіны) для стымуляцыі росту міцэлію. Пасля інкубацыі грыбковую культуру спачатку фільтравалі праз фільтравальную паперу Whatman #1, а затым цэнтрыфугавалі пры 2500 аб/мін на працягу 5 хвілін для выдалення рэшткавага міцэлію. Супернатант збіралі і захоўвалі пры тэмпературы 4 °C для далейшага колькаснага вызначэння аксалату. Для падрыхтоўкі ўзораў раслін прыблізна 0,1 г фрагментаў расліннай тканіны тройчы экстрагавалі дыстыляванай вадой (па 2 мл кожны раз). Затым узоры цэнтрыфугавалі пры 2500 абаротаў у хвіліну на працягу 5 хвілін, супернатант фільтравалі насуха праз фільтравальную паперу Whatman № 1 і збіралі для далейшага аналізу.
Для колькаснага аналізу шчаўевай кіслаты рэакцыйную сумесь рыхтавалі ў шкляной прабірцы з коркам у наступным парадку: 0,2 мл узору (або фільтрата культуры PDB, або стандартнага раствора шчаўевай кіслаты), 0,11 мл бромфенол-сіняга (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Пітсбург, Пенсільванія, ЗША), 0,198 мл 1 М сернай кіслаты (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каір, Егіпет) і 0,176 мл 100 мМ дыхрамату калію (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портленд, Арэгон, ЗША), а затым раствор разводзілі да 4,8 мл дыстыляванай вадой, энергічна змешвалі і неадкладна змяшчалі ў вадзяную лазню з тэмпературай 60 °C. Праз 10 хвілін рэакцыю спынялі, дадаючы 0,5 мл раствора гідраксіду натрыю (NaOH; 0,75 М). Паглынанне (A600) рэакцыйнай сумесі вымяралі пры 600 нм з дапамогай спектрафатометра UV-160 (Shimadzu Corporation, Японія). PDB і дыстыляваная вада выкарыстоўваліся ў якасці кантролю для колькаснага вызначэння фільтратаў культур і ўзораў раслін адпаведна. Канцэнтрацыі шчаўевай кіслаты ў фільтратах культур, выражаныя ў мікраграмах шчаўевай кіслаты на мілілітр асяроддзя PDB (мкг·мл−1), і ў экстрактах лісця, выражаныя ў мікраграмах шчаўевай кіслаты на грам свежай вагі (мкг·г−1 FW), вызначалі з дапамогай калібравальнай крывой шчаўевай кіслаты (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Уолтэм, Масачусэтс, ЗША).
На працягу ўсяго даследавання ўсе эксперыменты былі распрацаваны па цалкам рандомізірованному дызайне (CRD) з шасцю біялагічнымі паўторамі на апрацоўку і пяццю гаршкамі на біялагічную паўтору (дзве расліны ў гаршку), калі не пазначана іншае. Біялагічныя паўторы аналізаваліся ў двух дублікатах (дзве тэхнічныя паўторы). Тэхнічныя паўторы выкарыстоўваліся для праверкі ўзнаўляльнасці аднаго і таго ж эксперыменту, але не выкарыстоўваліся ў статыстычным аналізе, каб пазбегнуць ілжывых паўтораў. Дадзеныя былі статыстычна прааналізаваны з дапамогай дысперсійнага аналізу (ANOVA) з наступным тэстам на значную розніцу Цьюкі-Крамера (HSD) (p ≤ 0,05). Для эксперыментаў in vitro значэнні IC50 і IC99 былі разлічаны з выкарыстаннем прабіт-мадэлі і 95% даверныя інтэрвалы.
Усяго чатыры ізаляты былі сабраны з розных соевых палёў у правінцыі Эль-Габія, Егіпет. На асяроддзі PDA ўсе ізаляты ўтварылі крэмава-белы міцэлій, які хутка змяняўся на ватопадобны белы (малюнак 1А), а затым на стадыі склероцый станавіўся бэжавым або карычневым. Склероцыі звычайна шчыльныя, чорныя, сферычнай або няправільнай формы, маюць даўжыню ад 5,2 да 7,7 мм і дыяметр ад 3,4 да 5,3 мм (малюнак 1B). Нягледзячы на ​​тое, што ў чатырох ізалятаў пасля 10-12 дзён інкубацыі пры тэмпературы 25 ± 2 °C на краі культуральнага асяроддзя развіўся краявы малюнак склероцый (малюнак 1А), колькасць склероцый на пласцінку значна адрознівалася паміж імі (P < 0,001), прычым ізалят 3 меў найбольшую колькасць склероцый (32,33 ± 1,53 склероцыі на пласцінку; мал. 1C). Падобным чынам, ізалят № 3 выпрацоўваў больш шчаўевай кіслаты ў PDB, чым іншыя ізаляты (3,33 ± 0,49 мкг/мл−1; Мал. 1D). Ізалят № 3 прадэманстраваў тыповыя марфалагічныя і мікраскапічныя характарыстыкі фітапатагеннага грыба Sclerotinia sclerotiorum. Напрыклад, на PDA калоніі ізалята № 3 хутка раслі, былі крэмава-белымі (Малюнак 1A), адваротна-бэжавымі або светла-ласосева-жоўта-карычневымі, і ім патрабавалася 6-7 дзён пры тэмпературы 25 ± 2°C, каб цалкам пакрыць паверхню пласціны дыяметрам 9 см. На падставе вышэйзгаданых марфалагічных і мікраскапічных характарыстык ізалят № 3 быў ідэнтыфікаваны як Sclerotinia sclerotiorum.
Малюнак 1. Характарыстыкі і патагеннасць ізалятаў S. sclerotiorum з звычайных бабовых культур. (A) Рост міцэлію чатырох ізалятаў S. sclerotiorum на асяроддзі PDA, (B) склероцыі чатырох ізалятаў S. sclerotiorum, (C) колькасць склероцый (на пласцінку), (D) сакрэцыя шчаўевай кіслаты на асяроддзі PDB (мкг·мл−1) і (E) ступень цяжкасці захворвання (%) чатырох ізалятаў S. sclerotiorum на адчувальным камерцыйным сарце бабовых Giza 3 у цяплічных умовах. Значэнні прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± SD пяці біялагічных паўтораў (n = 5). Розныя літары паказваюць статыстычна значныя адрозненні паміж апрацоўкамі (p < 0,05). (F–H) Тыповыя сімптомы белай цвілі з'явіліся на надземных сцеблах і стручках адпаведна праз 10 дзён пасля інакуляцыі ізалятам № 3 (dpi). (I) Эвалюцыйны аналіз вобласці ўнутранага транскрыбаванага спэйсера (ITS) ізаляту S. sclerotiorum № 3 быў праведзены з выкарыстаннем метаду максімальнай праўдападобнасці і параўнаны з 20 эталоннымі ізалятамі/штамамі, атрыманымі з базы дадзеных Нацыянальнага цэнтра біятэхналагічнай інфармацыі (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Лічбы над лініямі кластэрызацыі паказваюць пакрыццё вобласці (%), а лічбы пад лініямі кластэрызацыі паказваюць даўжыню галіны.
Акрамя таго, для пацверджання патагеннасці чатыры атрыманыя ізаляты S. sclerotiorum былі выкарыстаны для інакуляцыі адчувальнага камерцыйнага гатунку фасолі Giza 3 ва ўмовах цяпліцы, што адпавядае пастулатам Коха (мал. 1E). Нягледзячы на ​​тое, што ўсе атрыманыя грыбковыя ізаляты былі патагеннымі і маглі заразіць зялёную фасолю (гатунак Giza 3), выклікаючы тыповыя сімптомы белай цвілі на ўсіх надземных частках (мал. 1F), асабліва на сцеблах (мал. 1G) і струках (мал. 1H) праз 10 дзён пасля інакуляцыі (dpi), ізалят 3 быў найбольш агрэсіўным ізалятам у двух незалежных эксперыментах. Ізалят 3 меў найвышэйшую ступень цяжкасці захворвання (%) на раслінах фасолі (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 і 76,7 ± 3,1 праз 7, 14 і 21 дзень пасля заражэння адпаведна; мал. 1F).
Ідэнтыфікацыя найбольш інвазіўнага ізаляту S. sclerotiorum №3 была дадаткова пацверджана на аснове секвенавання ўнутранага транскрыбаванага спейсера (ITS) (мал. 1I). Філагенетычны аналіз паміж ізалятам №3 і 20 эталоннымі ізалятамі/штамамі паказаў высокае падабенства (>99%) паміж імі. Варта адзначыць, што ізалят S. sclerotiorum №3 (533 пар асноў) мае высокае падабенства з амерыканскім ізалятам S. sclerotiorum LPM36, выдзеленым з сухога насення гароху (нумар доступу ў GenBank MK896659.1; 540 пар асноў), і кітайскім ізалятам S. sclerotiorum YKY211 (нумар доступу ў GenBank OR206374.1; 548 пар асноў), які выклікае гніль сцябла фіялкі (Matthiola incana), усе з якіх згрупаваны асобна ўверсе дендраграмы (малюнак 1I). Новая паслядоўнасць была ўнесена ў базу дадзеных NCBI і атрымала назву «Sclerotinia sclerotiorum – ізалят YN-25» (нумар рэгістрацыі GenBank PV202792). Відаць, што ізалят 3 з'яўляецца найбольш інвазіўным ізалятам; таму гэты ізалят быў абраны для даследавання ва ўсіх наступных эксперыментах.
Антыбактэрыйная актыўнасць дыяміну L-арніціну (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германія) пры розных канцэнтрацыях (12,5, 25, 50, 75, 100 і 125 мг/л) супраць ізаляту 3 S. sclerotiorum была даследавана in vitro. Варта адзначыць, што L-арніцін аказваў антыбактэрыйны эфект і паступова інгібіраваў радыяльны рост гіф S. sclerotiorum дозазалежным чынам (малюнак 2A, B). Пры найвышэйшай пратэставанай канцэнтрацыі (125 мг/л) L-арніцін прадэманстраваў найвышэйшы ўзровень інгібіравання росту міцэлію (99,62 ± 0,27%; малюнак 2B), што было эквівалентна камерцыйнаму фунгіцыду Rizolex-T (узровень інгібіравання 99,45 ± 0,39%; малюнак 2C) пры найвышэйшай пратэставанай канцэнтрацыі (10 мг/л), што сведчыць аб падобнай эфектыўнасці.
Малюнак 2. Антыбактэрыйная актыўнасць L-арніціну супраць Sclerotinia sclerotiorum in vitro. (A) Параўнанне антыбактэрыйнай актыўнасці розных канцэнтрацый L-арніціну супраць S. sclerotiorum з дапамогай камерцыйнага фунгіцыду Rizolex-T (10 мг/л). (B, C) Хуткасць інгібіравання (%) росту міцэлію S. sclerotiorum пасля апрацоўкі рознымі канцэнтрацыямі L-арніціну (12,5, 25, 50, 75, 100 і 125 мг/л) або Rizolex-T (2, 4, 6, 8 і 10 мг/л) адпаведна. Значэнні прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± SD пяці біялагічных паўтораў (n = 5). Розныя літары абазначаюць статыстычныя адрозненні паміж апрацоўкамі (p < 0,05). (D, E) Рэгрэсійны аналіз мадэлі Probit L-арніціну і камерцыйнага фунгіцыду Rizolex-T адпаведна. Лінія рэгрэсіі мадэлі пробіт паказана суцэльнай сіняй лініяй, а даверны інтэрвал (95%) — чырвонай пункцірнай лініяй.
Акрамя таго, быў праведзены прабіт-рэгрэсійны аналіз, і адпаведныя графікі паказаны ў Табліцы 1 і на Малюнках 2D,E. Карацей кажучы, прымальнае значэнне нахілу (y = 2,92x − 4,67) і звязаная з ім значная статыстыка (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 і p < 0,0001; Малюнак 2D) L-арніціну сведчылі пра павышаную супрацьгрыбковую актыўнасць супраць S. sclerotiorum у параўнанні з камерцыйным фунгіцыдам Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 і p < 0,0001) (Табліца 1).
Табліца 1. Значэнні паловы максімальнай інгібіруючай канцэнтрацыі (IC50) і IC99 (мг/л) L-арніціну і камерцыйнага фунгіцыду «Рызалекс-Т» супраць S. sclerotiorum.
У цэлым, L-арніцін (250 мг/л) значна знізіў развіццё і цяжкасць захворвання белай цвіллю на апрацаваных раслінах фасолі звычайнай у параўнанні з неапрацаванымі раслінамі, заражанымі S. sclerotiorum (кантроль; малюнак 3А). Карацей кажучы, хоць цяжкасць захворвання неапрацаваных кантрольных раслін паступова павялічвалася (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 і 92,33 ± 3,06%), L-арніцін значна знізіў цяжкасць захворвання (%) на працягу ўсяго эксперыменту (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 і 26,36 ± 3,07) праз 7, 14 і 21 дзень пасля апрацоўкі (dpt) адпаведна (малюнак 3А). Падобным чынам, калі расліны фасолі, заражаныя S. sclerotiorum, былі апрацаваны L-арніцінам у дозе 250 мг/л, плошча пад крывой прагрэсавання хваробы (AUDPC) знізілася з 1274,33 ± 33,13 у неапрацаваным кантролі да 281,03 ± 7,95, што было крыху ніжэй, чым у станоўчага кантролю з фунгіцыдам Rizolex-T у дозе 50 мг/л (183,61 ± 7,71; Малюнак 3B). Такая ж тэндэнцыя назіралася і ў другім эксперыменце.
Мал. 3. Уплыў экзагеннага прымянення L-арніціну на развіццё белай гнілі фасолі звычайнай, выкліканай Sclerotinia sclerotiorum, ва ўмовах цяпліцы. (A) Крывая прагрэсавання хваробы белай гнілі фасолі звычайнай пасля апрацоўкі 250 мг/л L-арніціну. (B) Плошча пад крывой прагрэсавання хваробы (AUDPC) белай гнілі фасолі звычайнай пасля апрацоўкі L-арніціну. Значэнні прадстаўляюць сярэдняе ± SD пяці біялагічных паўтораў (n = 5). Розныя літары абазначаюць статыстычна значныя адрозненні паміж апрацоўкамі (p < 0,05).
Экзагеннае ўнясенне 250 мг/л L-арніціну паступова павялічвала вышыню раслін (мал. 4А), колькасць галін на расліну (мал. 4В) і колькасць лісця на расліну (мал. 4С) праз 42 дні. У той час як камерцыйны фунгіцыд Rizolex-T (50 мг/л) аказаў найбольшы ўплыў на ўсе даследаваныя параметры харчавання, экзагеннае ўнясенне 250 мг/л L-арніціну аказала другі па велічыні эфект у параўнанні з неапрацаванымі кантрольнымі групамі (мал. 4А–С). З іншага боку, апрацоўка L-арніцінам не аказала істотнага ўплыву на ўтрыманне фотасінтэтычных пігментаў хларафіла a (мал. 4D) і хларафіла b (мал. 4E), але нязначна павялічыла агульнае ўтрыманне каратыноідаў (0,56 ± 0,03 мг/г свабоднай вагі) у параўнанні з адмоўным кантролем (0,44 ± 0,02 мг/г свабоднай вагі) і станоўчым кантролем (0,46 ± 0,02 мг/г свабоднай вагі; мал. 4F). У цэлым, гэтыя вынікі паказваюць, што L-арніцін не з'яўляецца фітатаксічным для апрацаваных бабовых культур і нават можа стымуляваць іх рост.
Мал. 4. Уплыў экзагеннага прымянення L-арніціну на характарыстыкі росту і фотасінтэтычныя пігменты лісця фасолі, заражанага Sclerotinia sclerotiorum, ва ўмовах цяпліцы. (A) Вышыня расліны (см), (B) Колькасць галін на расліну, (C) Колькасць лісця на расліну, (D) Утрыманне хларафіла а (мг г-1 сырой вагі), (E) Утрыманне хларафіла b (мг г-1 сырой вагі), (F) Агульнае ўтрыманне каратыноідаў (мг г-1 сырой вагі). Значэнні прадстаўлены сярэднім значэннем ± стандартнае адхіленне пяці біялагічных паўтораў (n = 5). Розныя літары паказваюць статыстычна значныя адрозненні паміж варыянтамі (p < 0,05).
Гістахімічная лакалізацыя in situ актыўных формаў кіслароду (ROS; выражаных у выглядзе перакісу вадароду [H2O2]) і свабодных радыкалаў (выражаных у выглядзе супераксідных аніёнаў [O2•−]) паказала, што экзагеннае ўжыванне L-арніціну (250 мг/л) значна знізіла назапашванне H2O2 (96,05 ± 5,33 нмоль·г−1 FW; мал. 5A) і O2•− (32,69 ± 8,56 нмоль·г−1 FW; мал. 5B) у параўнанні з назапашваннем як у неапрацаваных заражаных раслінах (173,31 ± 12,06 і ​​149,35 ± 7,94 нмоль·г−1 FW адпаведна), так і ў раслінах, апрацаваных 50 мг/л камерцыйнага фунгіцыду Rizolex-T (170,12 ± 9,50 і 157,00 ± 7,81 нмоль·г−1 fr wt адпаведна) праз 72 гадзіны. Высокі ўзровень H2O2 і O2•− назапашваўся пры высокатэмпературнай перакіснай апрацоўцы (мал. 5A, B). Падобным чынам, аналіз маландовага дыяльдэгіду (MDA) на аснове TCA паказаў, што заражаныя S. sclerotiorum расліны фасолі назапашвалі больш высокі ўзровень MDA (113,48 ± 10,02 нмоль/г сырой вагі) у сваім лісці (мал. 5C). Аднак экзагеннае ўжыванне L-арніціну значна знізіла перакіснае акісленне ліпідаў, пра што сведчыць зніжэнне ўтрымання MDA ў апрацаваных раслінах (33,08 ± 4,00 нмоль/г сырой вагі).
Мал. 5. Уплыў экзагеннага прымянення L-арніціну на асноўныя маркеры акісляльнага стрэсу і неферментатыўныя механізмы антыаксідантнай абароны ў лісці фасолі, заражаным S. sclerotiorum, праз 72 гадзіны пасля заражэння ў цяплічных умовах. (A) Перакіс вадароду (H2O2; нмоль г−1 FW) пры 72 hpt, (B) супераксідны аніён (O2•−; нмоль г−1 FW) пры 72 hpt, (C) маландавы дыяльдэгід (MDA; нмоль г−1 FW) пры 72 hpt, (D) агульная колькасць растваральных фенолаў (мг GAE г−1 FW) пры 72 hpt, (E) агульная колькасць растваральных флаваноідаў (мг RE г−1 FW) пры 72 hpt, (F) агульная колькасць свабодных амінакіслот (мг г−1 FW) пры 72 hpt і (G) утрыманне праліну (мг г−1 FW) пры 72 hpt. Значэнні прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне (сярэдняе ± SD) 5 біялагічных паўтораў (n = 5). Розныя літары паказваюць статыстычна значныя адрозненні паміж апрацоўкамі (p < 0,05).