Розныя тэорыі абароны раслін даюць важныя тэарэтычныя рэкамендацыі для тлумачэння заканамернасцей спецыялізаванага метабалізму раслін, але іх ключавыя прагнозы яшчэ патрабуюць праверкі. Тут мы выкарысталі непрадузяты тандэмны мас-спектрометрычны (MS/MS) аналіз для сістэматычнага вывучэння метабалома аслабленых штамаў тытуню ад асобных раслін да папуляцый і блізкароднасных відаў, а таксама апрацавалі вялікую колькасць тэорый мас-спектрометрычных прыкмет, заснаваных на складаных спектрах у інфармацыі. Структура для праверкі ключавых прагнозаў тэорый аптымальнай абароны (OD) і рухомай мішэні (MT). Інфармацыйны кампанент метабаломікі раслін адпавядае тэорыі OD, але супярэчыць асноўнаму прагнозу тэорыі MT адносна дынамікі метабаломікі, выкліканай траваеднымі жывёламі. Ад мікра- да макраўзроўню эвалюцыі сігнал жасманата быў ідэнтыфікаваны як асноўны дэтэрмінант OD, у той час як сігнал этылену забяспечваў тонкую наладу спецыфічнай для траваедных рэакцыі, анатаванай малекулярнай сеткай MS/MS.
Спецыяльныя метабаліты з разнастайнай структурай з'яўляюцца асноўнымі ўдзельнікамі адаптацыі раслін да навакольнага асяроддзя, асабліва ў абароне ад ворагаў (1). Дзіўная дыверсіфікацыя спецыяльнага метабалізму, які сустракаецца ў раслін, стымулявала дзесяцігоддзі паглыбленых даследаванняў яго шматлікіх аспектаў экалагічных функцый і сфармавала доўгі спіс тэорый абароны раслін, якія з'яўляюцца эвалюцыйным і экалагічным развіццём узаемадзеяння раслін і насякомых. Эмпірычныя даследаванні даюць важныя рэкамендацыі (2). Аднак гэтыя тэорыі абароны раслін не ішлі па нарматыўным шляху гіпатэтычных дэдуктыўных разважанняў, у якіх ключавыя прагнозы знаходзіліся на адным узроўні аналізу (3) і былі правераны эксперыментальна для прасоўвання наступнага цыклу тэарэтычнай распрацоўкі (4). Тэхнічныя абмежаванні абмяжоўваюць збор дадзеных канкрэтнымі метабалічнымі катэгорыямі і выключаюць усебаковы аналіз спецыялізаваных метабалітаў, тым самым перашкаджаючы міжкатэгорыйным параўнанням, якія неабходныя для тэарэтычнай распрацоўкі (5). Адсутнасць усебаковых метабалічных дадзеных і агульнай валюты для параўнання працоўнага працэсу апрацоўкі метабалічнай прасторы паміж рознымі групамі раслін перашкаджае навуковай сталасці гэтай галіны.
Найноўшыя распрацоўкі ў галіне метабаломікі тандэмнай мас-спектрометрыі (МС/МС) дазваляюць усебакова характарызаваць метабалічныя змены ўнутры і паміж відамі дадзенай сістэмнай клады і могуць быць спалучаны з вылічальнымі метадамі для разліку структурнага падабенства паміж гэтымі складанымі сумесямі. Папярэднія веды па хіміі (5). Спалучэнне перадавых тэхналогій у аналізе і вылічэннях забяспечвае неабходную аснову для доўгатэрміновай праверкі многіх прагнозаў, зробленых экалагічнымі і эвалюцыйнымі тэорыямі метабалічнай разнастайнасці. Шэнан (6) упершыню прадставіў тэорыю інфармацыі ў сваім фундаментальным артыкуле ў 1948 годзе, заклаўшы аснову для матэматычнага аналізу інфармацыі, які выкарыстоўваўся ў многіх галінах, акрамя свайго першапачатковага прымянення. У геноміцы тэорыя інфармацыі была паспяхова ўжыта для колькаснай ацэнкі кансерватыўнай інфармацыі аб паслядоўнасці (7). У даследаваннях транскрыптомікі тэорыя інфармацыі аналізуе агульныя змены ў транскрыптоме (8). У папярэдніх даследаваннях мы ўжылі статыстычную аснову тэорыі інфармацыі да метабаломікі для апісання метабалічнай экспертызы на ўзроўні тканін у раслін (9). Тут мы спалучаем працоўны працэс на аснове MS/MS са статыстычнай структурай тэорыі інфармацыі, якая характарызуецца метабалічнай разнастайнасцю ў агульнай валюце, каб параўнаць ключавыя прагнозы тэорыі абароны раслін метабалома, індукаванага траваеднымі жывёламі.
Тэарэтычныя асновы абароны раслін звычайна ўзаемна ўключальныя і могуць быць падзеленыя на дзве катэгорыі: тыя, якія спрабуюць растлумачыць размеркаванне спецыфічных для раслін метабалітаў на аснове ахоўных функцый, такіх як аптымальная абарона (АД) (10), рухомая мішэнь (РМ) (11) і тэорыя знешняга выгляду (12), у той час як іншыя шукаюць механічныя тлумачэнні таго, як змены ў даступнасці рэсурсаў уплываюць на рост раслін і назапашванне спецыялізаваных метабалітаў, такіх як вуглярод: гіпотэза балансу пажыўных рэчываў (13), гіпотэза хуткасці росту (14) і гіпотэза раўнавагі росту і дыферэнцыяцыі (15). Два наборы тэорый знаходзяцца на розных узроўнях аналізу (4). Аднак дзве тэорыі, якія тычацца абарончых функцый на функцыянальным узроўні, дамінуюць у размовах аб канстытутыўнай і індуцыбельнай абароне раслін: тэорыя АД, якая мяркуе, што расліны ўкладваюць сродкі ў сваю дарагую хімічную абарону толькі тады, калі гэта неабходна, напрыклад, калі яны праглынаюцца. Калі травяная жывёла атакуе, таму, у залежнасці ад магчымасці будучай атакі, прызначаецца злучэнне з абарончай функцыяй (10); Гіпотэза МТ мяркуе, што няма восі накіраванага змянення метабаліту, але метабаліт змяняецца выпадковым чынам, ствараючы тым самым магчымасць перашкаджаць метабалічнай «мішэні руху» атакуючых траваедных жывёл. Іншымі словамі, гэтыя дзве тэорыі робяць супрацьлеглыя прагнозы адносна метабалічнай перабудовы, якая адбываецца пасля нападу траваедных жывёл: сувязь паміж аднанакіраваным назапашваннем метабалітаў з абарончай функцыяй (АД) і ненакіраванымі метабалічнымі зменамі (МТ) (11).
Гіпотэзы АД і МТ ахопліваюць не толькі індукаваныя змены ў метабаломе, але і экалагічныя і эвалюцыйныя наступствы назапашвання гэтых метабалітаў, такія як адаптыўныя выдаткі і выгады ад гэтых метабалічных змен у пэўным экалагічным асяроддзі (16). Нягледзячы на ​​тое, што абедзве гіпотэзы прызнаюць абарончую функцыю спецыялізаваных метабалітаў, якія могуць быць дарагімі ці не, ключавы прагноз, які адрознівае гіпотэзы АД і МТ, заключаецца ў накіраванасці індукаваных метабалічных змен. Прадказанне тэорыі АД атрымала найбольшую эксперыментальную ўвагу да гэтага часу. Гэтыя тэсты ўключаюць вывучэнне прамых або ўскосных абарончых функцый розных тканак пэўных злучэнняў у цяпліцах і натуральных умовах, а таксама змены ў стадыі развіцця раслін (17-19). Аднак да гэтага часу, з-за адсутнасці працоўнага працэсу і статыстычнай асновы для глабальнага комплекснага аналізу метабалічнай разнастайнасці любога арганізма, асноўнае прадказанне адрозненняў паміж двума тэорыямі (гэта значыць кірунак метабалічных змен) яшчэ трэба праверыць. Тут мы прадстаўляем такі аналіз.
Адной з найбольш значных характарыстык раслін-спецыфічных метабалітаў з'яўляецца іх надзвычайная структурная разнастайнасць на ўсіх узроўнях, ад асобных раслін і папуляцый да падобных відаў (20). Шматлікія колькасныя змены ў спецыялізаваных метабалітах можна назіраць на ўзроўні папуляцыі, у той час як моцныя якасныя адрозненні звычайна захоўваюцца на ўзроўні відаў (20). Такім чынам, метабалічная разнастайнасць раслін з'яўляецца асноўным аспектам функцыянальнай разнастайнасці, які адлюстроўвае адаптыўнасць да розных ніш, асабліва да тых ніш з рознымі магчымасцямі ўварвання спецыяльных насякомых і звычайных траваедных жывёл (21). З моманту публікацыі рэвалюцыйнага артыкула Фрэнкеля (22) пра прычыны існавання раслін-спецыфічных метабалітаў узаемадзеянне з рознымі насякомымі разглядалася як важны фактар ​​​​адбору, і лічыцца, што гэта ўзаемадзеянне фармавала расліны падчас эвалюцыі. Метабалічны шлях (23). Міжвідавыя адрозненні ў разнастайнасці спецыялізаваных метабалітаў могуць таксама адлюстроўваць фізіялагічны баланс, звязаны з канстытутыўнай і індуцыбельнай абаронай раслін ад траваедных стратэгій, паколькі гэтыя два віды часта адмоўна карэлююць адзін з адным (24). Нягледзячы на ​​тое, што падтрыманне добрай абароны можа быць карысным увесь час, своечасовыя метабалічныя змены, звязаныя з абаронай, даюць відавочныя перавагі, дазваляючы раслінам размеркаваць каштоўныя рэсурсы на іншыя фізіялагічныя інвестыцыі (19, 24) і пазбягаць неабходнасці сімбіёзу. Супутняя шкода (25). Акрамя таго, гэтыя рэарганізацыі спецыялізаваных метабалітаў, выкліканыя траваеднымі насякомымі, могуць прывесці да дэструктыўнага размеркавання ў папуляцыі (26) і могуць адлюстроўваць прамыя паказанні істотных натуральных змен у сігнале жасманічнай кіслаты (JA), які можа падтрымлівацца ў папуляцыі. Высокія і нізкія сігналы JA з'яўляюцца кампрамісамі паміж абаронай ад траваедных і канкурэнцыяй з пэўнымі відамі (27). Акрамя таго, спецыялізаваныя шляхі біясінтэзу метабалітаў будуць хутка губляцца і трансфармавацца падчас эвалюцыі, што прывядзе да нераўнамернага размеркавання метабалізму сярод блізкароднасных відаў (28). Гэтыя палімарфізмы могуць хутка ўсталёўвацца ў адказ на змены ў структуры траваедных (29), што азначае, што ваганні супольнасцей траваедных з'яўляюцца ключавым фактарам, які стымулюе метабалічную неаднароднасць.
Тут мы вырашылі наступныя задачы. (I) Як траваеднае насякомае перабудоўвае метабалом расліны? (Ii) Якія асноўныя інфармацыйныя кампаненты метабалічнай пластычнасці можна колькасна ацаніць для праверкі прагнозаў тэорыі доўгатэрміновай абароны? (Iii) Ці варта перапраграмаваць метабалом расліны унікальным для атакуючага, і калі так, то якую ролю адыгрывае раслінны гармон у фарміраванні канкрэтнай метабалічнай рэакцыі, і якія метабаліты спрыяюць відавой спецыфічнасці абароны? (Iv) Паколькі прагнозы, зробленыя многімі тэорыямі абароны, могуць быць распаўсюджаны на ўсе ўзроўні біялагічных тканак, мы задаліся пытаннем, наколькі паслядоўнай з'яўляецца выкліканая метабалічная рэакцыя ад унутранага параўнання да міжвідавага параўнання? З гэтай мэтай мы сістэматычна вывучалі метабалом лісця тытуню, які з'яўляецца экалагічнай мадэльнай раслінай з багатым спецыялізаваным метабалізмам і эфектыўны супраць лічынак двух мясцовых траваедных жывёл: Lepidoptera Datura (Ms) (вельмі агрэсіўныя, у асноўным ядуць). На Solanaceae і Spodoptera littoralis (Sl) баваўняныя лісцевыя чарвякі з'яўляюцца своеасаблівым «родам» з раслінамі-гаспадарамі Solanaceae і іншымі гаспадарамі іншых родаў і сямействаў. Мы прааналізавалі спектр метабаломікі MS/MS і вынялі статыстычныя дэскрыптары інфармацыйнай тэорыі для параўнання тэорый аптычнай шчыльнасці (OD) і механічнай шчыльнасці (MT). Створылі карты спецыфічнасці, каб выявіць ідэнтычнасць ключавых метабалітаў. Аналіз быў пашыраны на мясцовую папуляцыю N. nasi і блізкароднасныя віды тытуню для далейшага аналізу каварыяцыі паміж сігналізацыяй раслінных гармонаў і індукцыяй аптычнай шчыльнасці (OD).
Каб атрымаць агульную карту пластычнасці і структуры метабалома лісця траваеднага тытуню, мы выкарысталі раней распрацаваны працоўны працэс аналізу і разліку для комплекснага збору і дэканвалюцыі дадзеных высокага разрознення, атрыманых з дапамогай незалежных спектраў MS/MS з раслінных экстрактаў (9). Гэты недыферэнцыяваны метад (які называецца MS/MS) дазваляе ствараць нелішнія спектры злучэнняў, якія затым можна выкарыстоўваць для ўсіх аналізаў на ўзроўні злучэнняў, апісаных тут. Гэтыя дэканвалюцыяваныя раслінныя метабаліты бываюць розных тыпаў і складаюцца з сотняў і тысяч метабалітаў (тут каля 500-1000 с/MS/MS). Тут мы разглядаем метабалічную пластычнасць у рамках тэорыі інфармацыі і колькасна ацэньваем разнастайнасць і прафесіяналізм метабалома на аснове энтрапіі Шэнана размеркавання метабалічных частот. Выкарыстоўваючы раней рэалізаваную формулу (8), мы разлічылі набор паказчыкаў, якія можна выкарыстоўваць для колькаснай ацэнкі разнастайнасці метабалома (індыкатар Hj), спецыялізацыі метабалічнага профілю (індыкатар δj) і метабалічнай спецыфічнасці асобнага метабаліту (індыкатар Si). Акрамя таго, мы ўжылі індэкс пластычнасці адноснай адлегласці (RDPI) для колькаснай ацэнкі індуцыбельнасці метабалома траваедных (Малюнак 1A) (30). У рамках гэтай статыстычнай структуры мы разглядаем спектр MS/MS як асноўную інфармацыйную адзінку і апрацоўваем адносную колькасць MS/MS у карту размеркавання частот, а затым выкарыстоўваем энтрапію Шэнана для ацэнкі разнастайнасці метабалома па ёй. Спецыялізацыя метабалома вымяраецца сярэдняй спецыфічнасцю асобнага спектру MS/MS. Такім чынам, павелічэнне колькасці некаторых класаў MS/MS пасля індукцыі траваедных трансфармуецца ў спектральную індуцыбельнасць, RDPI і спецыялізацыю, гэта значыць павелічэнне індэкса δj, таму што выпрацоўваецца больш спецыялізаваных метабалітаў і ўтвараецца высокі індэкс Si. Зніжэнне індэкса разнастайнасці Hj адлюстроўвае тое, што альбо памяншаецца колькасць згенераваных MS/MS, альбо размеркаванне частот профілю змяняецца ў менш аднастайным кірунку, адначасова зніжаючы яго агульную нявызначанасць. Дзякуючы разліку індэкса Si можна вылучыць, якія MS/MS індукуюцца пэўнымі траваеднымі жывёламі, і наадварот, якія MS/MS не рэагуюць на індукцыю, што з'яўляецца ключавым паказчыкам для адрознення прагназавання MT і OD.
(A) Статыстычныя дэскрыптары, якія выкарыстоўваюцца для індуцыбельнасці дадзеных MS/MS (RDPI), разнастайнасці (індэкс Hj), спецыялізацыі (індэкс δj) і спецыфічнасці метабалітаў (індэкс Si) траваедных (H1 да Hx). Павелічэнне ступені спецыялізацыі (δj) паказвае, што ў сярэднім будзе выпрацоўвацца больш спецыфічных для траваедных метабалітаў, у той час як зніжэнне разнастайнасці (Hj) паказвае на зніжэнне вытворчасці метабалітаў або нераўнамернае размеркаванне метабалітаў на карце размеркавання. Значэнне Si ацэньвае, ці з'яўляецца метабаліт спецыфічным для дадзенай умовы (тут, траваедных), ці, наадварот, застаецца на тым жа ўзроўні. (B) Канцэптуальная схема прадказання тэорыі абароны з выкарыстаннем восі тэорыі інфармацыі. Тэорыя OD прагназуе, што атака траваедных павялічыць колькасць метабалітаў абароны, тым самым павялічваючы δj. У той жа час Hj памяншаецца, таму што профіль рэарганізаваны ў бок зніжэння нявызначанасці метабалічнай інфармацыі. Тэорыя MT прагназуе, што атака траваедных выкліча ненакіраваныя змены ў метабаломе, тым самым павялічваючы Hj як індыкатар павышэння нявызначанасці метабалічнай інфармацыі і выклікаючы выпадковае размеркаванне Si. Мы таксама прапанавалі змешаную мадэль, найлепшую МТ, у якой некаторыя метабаліты з больш высокімі абарончымі значэннямі будуць асабліва павышаны (высокае значэнне Si), у той час як іншыя праяўляюць выпадковыя рэакцыі (ніжэйшае значэнне Si).
Выкарыстоўваючы дэскрыптары тэорыі інфармацыі, мы інтэрпрэтуем тэорыю АД, каб прадказаць, што выкліканыя траваеднымі зменамі спецыяльных метабалітаў у неіндукаваным канстытутыўным стане прывядуць да (i) павелічэння метабалічнай спецыфічнасці (індэкс Si), што прывядзе да метабанамічнай спецыфічнасці (індэкс δj) (павелічэнне) пэўных спецыяльных груп метабалітаў з больш высокай абарончай значнасцю, і (ii) зніжэння разнастайнасці метабалома (індэкс Hj) з-за змены размеркавання метабалічнай частаты ў бок большага размеркавання па лептынавых целах. На ўзроўні асобнага метабаліту чакаецца ўпарадкаванае размеркаванне Si, дзе метабаліт будзе павялічваць значэнне Si ў адпаведнасці са сваім абарончым значэннем (Малюнак 1B). У гэтым ключы мы тлумачым тэорыю МТ, каб прадказаць, што ўзбуджэнне прывядзе да (i) ненакіраваных змен у метабалітах, што прывядзе да зніжэння індэкса δj, і (ii) павелічэння індэкса Hj з-за павелічэння метабалічнай нявызначанасці, або выпадковасці, якую можна колькасна ацаніць энтрапіяй Шэнана ў выглядзе абагульненай разнастайнасці. Што тычыцца метабалічнага складу, тэорыя МТ будзе прадказваць выпадковае размеркаванне Si. Улічваючы, што некаторыя метабаліты знаходзяцца ў пэўных умовах пры пэўных умовах, а іншыя ўмовы не знаходзяцца ў пэўных умовах, і іх ахоўная каштоўнасць залежыць ад навакольнага асяроддзя, мы таксама прапанавалі мадэль змешанай абароны, у якой δj і Hj размеркаваны ўздоўж Si па дзвюх частках. Пры павелічэнні ва ўсіх напрамках толькі пэўныя групы метабалітаў, якія маюць больш высокія ахоўныя значэнні, будуць асабліва павялічваць Si, у той час як іншыя будуць мець выпадковае размеркаванне (Малюнак 1B).
Каб праверыць прадказанне перавызначанай тэорыі абароны на восі дэскрыптара тэорыі інфармацыі, мы стварылі экспертныя (Ms) або універсальныя (Sl) лічынкі траваедных насякомых на лісці Nepenthes pallens (малюнак 2A). З дапамогай аналізу MS/MS мы атрымалі 599 нелішніх спектраў MS/MS (файл дадзеных S1) з метанольных экстрактаў тканіны лісця, сабраных пасля кармлення вусеняў. Выкарыстанне індэксаў RDPI, Hj і δj для візуалізацыі рэканфігурацыі інфармацыйнага зместу ў файлах канфігурацыі MS/MS выяўляе цікавыя заканамернасці (малюнак 2B). Агульная тэндэнцыя заключаецца ў тым, што, як апісана інфармацыйным дэскрыптарам, па меры таго, як вусені працягваюць есці лісце, ступень усёй метабалічнай рэарганізацыі павялічваецца з цягам часу: праз 72 гадзіны пасля таго, як траваедная жывёла паесць, RDPI значна павялічваецца. У параўнанні з непашкоджаным кантролем, Hj быў значна зніжаны, што было звязана з павышэннем ступені спецыялізацыі метабалічнага профілю, якая была колькасна вызначана індэксам δj. Гэтая відавочная тэндэнцыя адпавядае прагнозам тэорыі арганічнага разлажэння (ОР), але супярэчыць асноўным прагнозам тэорыі МТ, якая лічыць, што выпадковыя (ненакіраваныя) змены ўзроўню метабалітаў выкарыстоўваюцца ў якасці абарончага камуфляжу (малюнак 1B). Нягледзячы на ​​тое, што змест элісітара ротавай сакрэцыі (ОР) і харчовыя паводзіны гэтых двух траваедных істот адрозніваюцца, іх непасрэднае кармленне прывяло да падобных змен у напрамках Hj і δj падчас 24-гадзіннага і 72-гадзіннага перыядаў збору ўраджаю. Адзінае адрозненне назіралася праз 72 гадзіны пасля RDPI. У параўнанні з метабалізмам, выкліканым кармленнем Ms, агульны метабалізм, выкліканы кармленнем Sl, быў вышэйшым.
(A) Эксперыментальная планіроўка: звычайныя свінні (S1) або экспертныя (Ms) траваедныя жывёлы кормяцца апраснёным лісцем раслін-збалончыкаў, у той час як для мадэлявання траваеднасці для апрацоўкі праколаў стандартызаваных пазiцый лісця выкарыстоўваецца OS Ms (W + OSMs). S1 (W + OSSl) лічынкі або вада (W + W). Кантроль (C) - непашкоджаны ліст. (B) Індэкс індуцыбельнасці (RDPI у параўнанні з кантрольнай картай), разнастайнасці (індэкс Hj) і спецыялізацыі (індэкс δj), разлічаны для карты спецыяльных метабалітаў (599 MS/MS; файл дадзеных S1). Зорачкі паказваюць значныя адрозненні паміж непасрэдным кармленнем траваеднымі жывёламі і кантрольнай групай (t-крытэрый Сцьюдэнта з парным t-крытэрыем, *P<0,05 і ***P<0,001). ns - неістотна. (C) Індэкс часовага разрознення асноўнага (сіняя рамка, амінакіслата, арганічная кіслата і цукар; файл дадзеных S2) і спецыяльнага спектру метабалітаў (чырвоная рамка 443 MS/MS; файл дадзеных S1) пасля мадэлявання апрацоўкі траваеднымі жывёламі. Каляровая паласа адносіцца да 95% давернага інтэрвалу. Зорачка паказвае значную розніцу паміж апрацоўкай і кантролем [квадратычны дысперсійны аналіз (ANOVA), а затым сумленна значная розніца Цьюкі (HSD) для post hoc множных параўнанняў, *P<0,05, **P<0,01 і *** P <0,001]. (D) Спецыялізацыя дыяграм рассейвання і профіляў спецыяльных метабалітаў (паўторныя ўзоры з рознымі апрацоўкамі).
Каб высветліць, ці адлюстроўваецца перабудова метабалома, выкліканая траваеднымі жывёламі, у зменах узроўню асобных метабалітаў, мы спачатку засяродзіліся на метабалітах, якія раней вывучаліся ў лісці Nepenthes pallens з даказанай устойлівасцю да траваедных. Фенольныя аміды - гэта кан'югаты гідраксіцынаміду і поліаміну, якія назапашваюцца падчас траваеднага харчавання насякомых і, як вядома, зніжаюць іх прадукцыйнасць (32). Мы прааналізавалі папярэднікі адпаведнай MS/MS і пабудавалі іх кумулятыўныя кінетычныя крывыя (малюнак S1). Не дзіўна, што вытворныя фенолу, якія не ўдзельнічаюць непасрэдна ў абароне ад траваедных, такія як хларагенавая кіслата (CGA) і рутын, пасля траваеднага харчавання зніжаюцца. Наадварот, траваедныя могуць зрабіць феноламіды вельмі эфектыўнымі. Бесперапыннае кармленне дзвюх траваедных жывёл прывяло да практычна аднолькавага спектру ўзбуджэння феналамідаў, і гэтая заканамернасць была асабліва відавочнай для de novo сінтэзу феналамідаў. Такая ж з'ява будзе назірацца пры вывучэнні шляху 17-гідраксігераніл-нонандыёл-дытэрпенавых гліказідаў (17-HGL-DTG), які ўтварае вялікую колькасць ацыклічных дытэрпенаў з эфектыўнымі антытраваеднымі функцыямі (33), з якіх кармленне Ms з Sl выклікала падобны профіль экспрэсіі (малюнак S1).
Магчымым недахопам эксперыментаў з прамым кармленнем траваеднымі жывёламі з'яўляецца розніца ў хуткасці спажывання лісця і часе кармлення траваеднымі жывёламі, што ўскладняе ліквідацыю спецыфічных для траваедных эфектаў, выкліканых ранамі і траваеднымі жывёламі. Каб лепш вырашыць відавую спецыфічнасць індукаванай метабалічнай рэакцыі лісця ў траваедных жывёл, мы мадэлявалі кармленне лічынак Ms і Sl, неадкладна наносячы свежасабраныя OS (OSM і OSS1) на стандартны пракол W у аднолькавых пазіцыях лісця. Гэтая працэдура называецца апрацоўка W + OS, і яна стандартызуе індукцыю шляхам дакладнага вызначэння часу пачатку рэакцыі, выкліканай траваеднай жывёлай, без выклікання змешвальных эфектаў адрозненняў у хуткасці або колькасці страты тканін (малюнак 2A) (34). Выкарыстоўваючы канвеер аналізу і разліку MS/MS, мы атрымалі 443 спектры MS/MS (файл дадзеных S1), якія перакрываліся са спектрамі, раней сабранымі з эксперыментаў з прамым кармленнем. Аналіз інфармацыі гэтага набору дадзеных MS/MS паказаў, што перапраграмаванне спецыялізаваных на лісці метабаломаў шляхам мадэлявання траваедных жывёл прадэманстравала спецыфічныя для OS стымулы (малюнак 2C). У прыватнасці, у параўнанні з апрацоўкай OSS1, OSM выклікаў павышэнне спецыялізацыі метабалома праз 4 гадзіны. Варта адзначыць, што ў параўнанні з эксперыментальным наборам дадзеных аб непасрэдным кармленні траваеднымі жывёламі, метабалічная кінетыка, візуалізаваная ў двухмернай прасторы з выкарыстаннем каардынат Hj і δj, і накіраванасць спецыялізацыі метабалома ў адказ на мадэляванае харчаванне траваеднымі жывёламі з цягам часу павялічваліся паслядоўна (малюнак 2D). Адначасова мы колькасна вызначылі ўтрыманне амінакіслот, арганічных кіслот і цукроў (файл дадзеных S2), каб даследаваць, ці звязана гэта мэтанакіраванае павелічэнне экспертызы метабалома з пераканфігурацыяй цэнтральнага вугляроднага метабалізму ў адказ на мадэляванае харчаванне траваеднымі жывёламі (малюнак S2). Каб лепш растлумачыць гэтую заканамернасць, мы дадаткова кантралявалі кінетыку метабалічнага назапашвання раней абмеркаваных шляхоў феналаміду і 17-HGL-DTG. Спецыфічная для OS індукцыя траваедных жывёл трансфармуецца ў дыферэнцыяльную схему перабудовы ў метабалізме феналаміду (малюнак S3). Фенольныя аміды, якія змяшчаюць кумарынавыя і кафеільныя фрагменты, пераважна індукуюцца OSS1, у той час як OSM запускаюць спецыфічную індукцыю ферулільных кан'югатаў. Для шляху 17-HGL-DTG была выяўлена дыферэнцыяльная індукцыя OS прадуктамі маланілявання і дыманілявання ніжэй па плыні (малюнак S3).
Далей мы вывучылі пластычнасць транскрыптома, індукаваную OS, выкарыстоўваючы набор дадзеных мікрачыпаў з часовым ходам, які мадэлюе выкарыстанне OSM для апрацоўкі лісця разетачных раслін у траваедных. Кінетыка выбаркі ў асноўным супадае з кінетыкай, выкарыстанай у гэтым метабалічным даследаванні (35). У параўнанні з рэканфігурацыяй метабалома, пры якой метабалічная пластычнасць асабліва павялічваецца з цягам часу, мы назіраем часовыя транскрыпцыйныя ўсплёскі ў лісці, выкліканыя Ms, дзе індуцыбельнасць транскрыптома (RDPI) і спецыялізацыя (δj) знаходзяцца на ўзроўні 1. Адбылося значнае павелічэнне гадзін і разнастайнасці (Hj) у гэты момант часу, экспрэсія BMP1 значна знізілася, а затым адбылося паслабленне спецыялізацыі транскрыптома (малюнак S4). Сямействы метабалічных генаў (такія як P450, гліказілтрансфераза і BAHD ацылтрансфераза) удзельнічаюць у працэсе зборкі спецыяльных метабалітаў са структурных адзінак, атрыманых з першаснага метабалізму, прытрымліваючыся вышэйзгаданай ранняй мадэлі высокай спецыялізацыі. У якасці прыкладу быў прааналізаваны шлях фенілаланіну. Аналіз пацвердзіў, што асноўныя гены метабалізму феналаміду ў траваедных жывёл у параўнанні з раслінамі, якія не прыцягваюцца да гэтага, высока індукуюцца АС, і іх характары экспрэсіі цесна звязаны. Транскрыпцыйны фактар ​​MYB8 і структурныя гены PAL1, PAL2, C4H і 4CL у пачатку гэтага шляху паказалі раннюю ініцыяцыю транскрыпцыі. Ацылтрансферазы, якія гуляюць ролю ў канчатковай зборцы феналаміду, такія як AT1, DH29 і CV86, дэманструюць працяглы характар ​​рэгуляцыі ўверх (малюнак S4). Вышэйзгаданыя назіранні паказваюць, што ранняя ініцыяцыя спецыялізацыі транскрыптома і пазнейшае ўзмацненне спецыялізацыі метабаломікі з'яўляюцца спалучаным рэжымам, што можа быць звязана з сінхроннай рэгуляторнай сістэмай, якая ініцыюе магутную ахоўную рэакцыю.
Рэканфігурацыя ў сігналізацыі раслінных гармонаў дзейнічае як рэгуляторны пласт, які інтэгруе інфармацыю ад траваедных для перапраграмавання фізіялогіі раслін. Пасля мадэлявання траваедных мы вымералі кумулятыўную дынаміку ключавых катэгорый раслінных гармонаў і візуалізавалі часовую суэкспрэсію паміж імі [каэфіцыент карэляцыі Пірсана (PCC) > 0,4] (Малюнак 3А). Як і чакалася, раслінныя гармоны, звязаныя з біясінтэзам, звязаны ў сетцы суэкспрэсіі раслінных гармонаў. Акрамя таго, метабалічная спецыфічнасць (індэкс Si) адлюстравана на гэтай сетцы, каб вылучыць раслінныя гармоны, выкліканыя рознымі апрацоўкамі. Выдзелены дзве асноўныя вобласці спецыфічнага адказу траваедных: адна знаходзіцца ў кластары JA, дзе JA (яго біялагічна актыўная форма JA-Ile) і іншыя вытворныя JA паказваюць найвышэйшы бал Si; другая - этылен (ET). Гіберелін паказаў толькі ўмеранае павелічэнне спецыфічнасці для траваедных, у той час як іншыя раслінныя гармоны, такія як цытакінін, аўксін і абсцызінавая кіслата, мелі нізкую спецыфічнасць індукцыі для траваедных. У параўнанні з выкарыстаннем толькі W + W, узмацненне пікавага значэння вытворных JA праз прымяненне OS (W + OS) можа быць фактычна пераўтворана ў моцны спецыфічны індыкатар JA. Нечакана, вядома, што OSM і OSS1 з розным утрыманнем элісітара выклікаюць падобнае назапашванне JA і JA-Ile. У адрозненне ад OSS1, OSM спецыфічна і моцна індукуецца OSM, у той час як OSS1 не ўзмацняе рэакцыю базальных ран (Малюнак 3B).
(A) Аналіз сеткі сумеснай экспрэсіі на аснове разліку PCC для мадэлявання кінетыкі назапашвання гармонаў раслін, выкліканых траваеднымі жывёламі. Вузел прадстаўляе адзін раслінны гармон, а памер вузла прадстаўляе індэкс Si, спецыфічны для расліннага гармона паміж апрацоўкамі. (B) Назапашванне JA, JA-Ile і ET у лісці, выкліканае рознымі апрацоўкамі, пазначана рознымі колерамі: абрыкосавы, W + OSM; сіні, W + OSSl; чорны, W + W; шэры, C (кантроль). Зорачкі паказваюць значныя адрозненні паміж апрацоўкай і кантролем (двухфактарны ANOVA з наступным post hoc множным параўнаннем Tukey HSD, *** P <0,001). Аналіз тэорыі інфармацыі (C)697 MS/MS (файл дадзеных S1) у біясінтэзе JA і спектры парушэнняў успрымання (irAOC і irCOI1) і (D)585 MS/MS (файл дадзеных S1) у ETR1 з парушэннем сігналу ET. Дзве мадэляваныя апрацоўкі траваеднымі жывёламі актывавалі лініі раслін і кантрольныя расліны з пустым транспартным сродкам (EV). Зорачкі паказваюць значныя адрозненні паміж апрацоўкай W+OS і непашкоджаным кантролем (двухфактарны ANOVA з наступным множным параўнаннем Tukey HSD post hoc, *P<0,05, **P<0,01 і ***P<0,001). (E) Рассеяныя графікі рассеянай апазіцыі да спецыялізацыі. Колеры прадстаўляюць розныя генетычна мадыфікаваныя штамы; сімвалы прадстаўляюць розныя метады апрацоўкі: трохвугольнік, W + OSS1; прастакутнік, W + OSM; круг C
Далей мы выкарыстоўваем генетычна мадыфікаваны штам аслабленых Nepenthes (irCOI1 і sETR1) на ключавых этапах біясінтэзу JA і ET (irAOC і irACO) і ўспрымання (irCOI1 і sETR1) для аналізу метабалізму гэтых двух раслінных гармонаў на траваедных. Адносны ўклад перапраграмавання. У адпаведнасці з папярэднімі эксперыментамі, мы пацвердзілі індукцыю травяных раслін-OS у пустых носьбітаў (EV) (Малюнак 3, C-D) і агульнае зніжэнне індэкса Hj, выкліканае OSM, у той час як індэкс δj павялічыўся. Рэакцыя больш выяўленая, чым рэакцыя, выкліканая OSS1. Двухлінейны графік з выкарыстаннем Hj і δj у якасці каардынат паказвае спецыфічную дэрэгуляцыю (Малюнак 3E). Найбольш відавочная тэндэнцыя заключаецца ў тым, што ў штамах, якія не маюць сігналу JA, разнастайнасць метабалома і змены спецыялізацыі, выкліканыя траваеднымі, амаль цалкам ліквідуюцца (Малюнак 3C). Наадварот, бясшумнае ўспрыманне ET у раслін sETR1, хоць агульны ўплыў на змены метабалізму траваедных значна ніжэйшы, чым уплыў сігналізацыі JA, аслабляе розніцу ў індэксах Hj і δj паміж узбуджэннямі OSM і OSS1 (малюнак 3D і малюнак S5). Гэта сведчыць аб тым, што акрамя асноўнай функцыі трансдукцыі сігналу JA, трансдукцыя сігналу ET таксама служыць тонкай наладкай відаспецыфічнага метабалічнага адказу траваедных. У адпаведнасці з гэтай функцыяй тонкай налады, не было выяўлена ніякіх змен у агульнай індуцыбельнасці метабалома ў раслін sETR1. З іншага боку, у параўнанні з раслінамі sETR1, расліны irACO індукавалі падобную агульную амплітуду метабалічных змен, выкліканых траваеднымі, але паказалі значна розныя паказчыкі Hj і δj паміж выклікамі OSM і OSS1 (малюнак S5).
Каб вызначыць спецыялізаваныя метабаліты, якія ўносяць важны ўклад у відаспецыфічную рэакцыю траваедных жывёл, і тонка наладзіць іх выпрацоўку праз сігналы ET, мы выкарысталі раней распрацаваны структурны метад MS/MS. Гэты метад абапіраецца на метад бікластэрызацыі для паўторнага вываду метабалічнага сямейства з фрагментаў MS/MS [нармаваны скалярны здабытак (NDP)] і бала падабенства на аснове нейтральных страт (NL). Набор дадзеных MS/MS, пабудаваны шляхам аналізу трансгенных ліній ET, даў 585 MS/MS (файл дадзеных S1), якія былі падзелены шляхам кластэрызацыі ў сем асноўных модуляў MS/MS (M) (Малюнак 4A). Некаторыя з гэтых модуляў шчыльна запоўненыя раней характарызаванымі спецыяльнымі метабалітамі: напрыклад, M1, M2, M3, M4 і M7 багатыя рознымі фенольнымі вытворнымі (M1), флаваноіднымі гліказідамі (M2), ацыльнымі цукрамі (M3 і M4) і 17-HGL-DTG (M7). Акрамя таго, разлічваецца спецыфічная для метабалізму інфармацыя (індэкс Si) асобнага метабаліту ў кожным модулі, і яго размеркаванне Si можна ўбачыць інтуітыўна. Карацей кажучы, спектры MS/MS, якія дэманструюць высокую спецыфічнасць да траваеднасці і генатыпу, характарызуюцца высокімі значэннямі Si, а статыстыка эксцессу паказвае размеркаванне поўсці ў правым куце хваста. Адно такое размеркаванне калоідаў было выяўлена ў M1, у якім феноламід паказаў найвышэйшую долю Si (малюнак 4B). Вышэй згаданы траваедны індуцыбельны 17-HGL-DTG у M7 паказаў умераны бал Si, што сведчыць аб умеранай ступені дыферэнцыяльнай рэгуляцыі паміж двума тыпамі OS. Наадварот, большасць канстытутыўна прадуцыраваных спецыялізаваных метабалітаў, такіх як рутын, CGA і ацыльныя цукры, маюць адны з самых нізкіх балаў Si. Каб лепш даследаваць структурную складанасць і размеркаванне Si паміж спецыяльнымі метабалітамі, для кожнага модуля была пабудавана малекулярная сетка (малюнак 4B). Важным прадказаннем тэорыі АД (падсумавана на малюнку 1B) з'яўляецца тое, што рэарганізацыя спецыяльных метабалітаў пасля траваедных насякомых павінна прывесці да аднабаковых змен у метабалітах з высокай абарончай каштоўнасцю, асабліва за кошт павелічэння іх спецыфічнасці (у адрозненне ад выпадковага размеркавання). Рэжым) Абарончы метабаліт, прадказаны тэорыяй МТ. Большасць фенольных вытворных, назапашаных у М1, функцыянальна звязаны са зніжэннем прадукцыйнасці насякомых (32). Пры параўнанні значэнняў Si ў метабалітах М1 паміж індуцыраванымі лісцем і складовым лісцем кантрольных раслін EV праз 24 гадзіны мы назіралі, што метабалічная спецыфічнасць многіх метабалітаў пасля траваедных насякомых мае значную тэндэнцыю да павелічэння (малюнак 4C). Спецыфічнае павелічэнне значэння Si было выяўлена толькі ў абарончых феналамідах, але павелічэння значэння Si не было выяўлена ў іншых фенолах і невядомых метабалітах, якія суіснуюць у гэтым модулі. Гэта спецыялізаваная мадэль, якая звязана з тэорыяй АД. Асноўныя прагнозы метабалічных змен, выкліканых траваеднымі насякомымі, з'яўляюцца паслядоўнымі. Каб праверыць, ці была гэтая асаблівасць спектру феналаміду выклікана спецыфічным для АС-ЭТ, мы пабудавалі графік індэкса метабаліту Si і выклікалі дыферэнцыяльнае значэнне экспрэсіі паміж OSM і OSS1 у генатыпах EV і sETR1 (малюнак 4D). У sETR1 індукаваная фенамідам розніца паміж OSM і OSS1 была значна зменшана. Метад бікластэрызацыі быў таксама ўжыты да дадзеных MS/MS, сабраных у штамах з недастатковай колькасцю JA, каб высветліць асноўныя модулі MS/MS, звязаныя з метабалічнай спецыялізацыяй, рэгуляванай JA (малюнак S6).
(A) Вынікі кластэрызацыі 585 MS/MS на аснове агульных фрагментаў (падабенства NDP) і агульных нейтральных страт (падабенства NL) прыводзяць да таго, што модуль (M) адпавядае вядомаму сямейству злучэнняў або невядомаму ці дрэнна метабалізаванаму складу метабалітаў. Побач з кожным модулем паказана спецыфічнае размеркаванне метабалітаў (MS/MS) (Si). (B) Мадульная малекулярная сетка: вузлы прадстаўляюць MS/MS і рэбры, NDP (чырвоны) і NL (сіні) балы MS/MS (парог > 0,6). Градуяваны індэкс спецыфічнасці метабалітаў (Si) афарбаваны ў залежнасці ад модуля (злева) і адлюстраваны ў малекулярнай сетцы (справа). (C) Модуль M1 расліны EV у канстытутыўным (кантрольным) і індукаваным стане (мадэляваная траваедная жывёла) праз 24 гадзіны: дыяграма малекулярнай сеткі (значэнне Si - памер вузла, абарончы феналамід выдзелены сінім колерам). (D) Дыяграма малекулярнай сеткі M1 спектральнай лініі sETR1 з парушэннем успрымання EV і ET: фенольнае злучэнне, прадстаўленае зялёным кругавым вузлом, і значная розніца (значэнне P) паміж апрацоўкамі W + OSM і W + OSS1 у якасці памеру вузла. CP, N-кафеоіл-тыразін; CS, N-кафеоіл-спермідын; FP, N-ферулавы эфір кіслаты-мачавая кіслата; FS, N-феруліл-спермідын; CoP, N', N “-кумароліл-тыразін; DCS, N', N”-дыкафеоіл-спермідын; CFS, N', N”-кафеоіл, ферулоіл-спермідын; Lycium barbarum у ваўчынай ягадзе Son; Nick. O-AS, O-ацыльны цукар.
Мы пашырылі аналіз з аднаго аслабленага генатыпу Nepenthes на натуральныя папуляцыі, дзе раней былі апісаны моцныя ўнутрывідавыя змены ўзроўняў JA ў траваедных і ўзроўняў спецыфічных метабалітаў у натуральных папуляцыях (26). Выкарыстайце гэты набор дадзеных, каб ахапіць 43 зародкавыя плазмы. Гэтыя зародкавыя плазмы складаюцца са 123 відаў раслін N. pallens. Гэтыя расліны былі ўзятыя з насення, сабранага ў розных натуральных асяроддзях пражывання ў штатах Юта, Невада, Арызона і Каліфорнія (малюнак S7), мы разлічылі разнастайнасць метабалома (тут называецца ўзроўнем папуляцыі) β-разнастайнасць і спецыялізацыю, выкліканую OSM. У адпаведнасці з папярэднімі даследаваннямі, мы назіралі шырокі дыяпазон метабалічных змен уздоўж восяў Hj і δj, што сведчыць аб тым, што зародкавыя плазмы маюць значныя адрозненні ў пластычнасці сваіх метабалічных рэакцый на траваедных (малюнак S7). Такая арганізацыя нагадвае папярэднія назіранні аб дынамічным дыяпазоне змяненняў JA, выкліканых траваеднымі, і захавала вельмі высокае значэнне ў адной папуляцыі (26, 36). Выкарыстоўваючы JA і JA-Ile для праверкі агульнай карэляцыі ўзроўняў паміж Hj і δj, мы выявілі, што існуе значная станоўчая карэляцыя паміж JA і разнастайнасцю і індэксам спецыялізацыі метабалома β (малюнак S7). Гэта сведчыць аб тым, што выкліканая траваеднымі жывёламі гетэрагеннасць у індукцыі JA, выяўленая на ўзроўні папуляцыі, можа быць абумоўлена ключавымі метабалічнымі палімарфізмамі, выкліканымі адборам ад насякомых-траваедных.
Папярэднія даследаванні паказалі, што віды тытуню значна адрозніваюцца па тыпу і адноснай залежнасці ад індукаванай і канстытутыўнай метабалічнай абароны. Лічыцца, што гэтыя змены ў перадачы сігналаў супраць траваедных і абарончых здольнасцях рэгулююцца ціскам папуляцыі насякомых, жыццёвым цыклам раслін і выдаткамі на вытворчасць абароны ў нішы, дзе расце дадзены від. Мы вывучалі паслядоўнасць перабудовы метабалома лісця, выкліканай траваеднымі шасці відаў Nicotiana, якія растуць у Паўночнай і Паўднёвай Амерыцы. Гэтыя віды цесна звязаны з Nepenthes North America, а менавіта Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, лінейны тытунь, тытунь (Nicotiana spegazzinii) і тытунёвы ліставы тытунь (Nicotiana obtusifolia) (Малюнак 5А) (37). Шэсць з гэтых відаў, у тым ліку добра характарызаваны від N. please, з'яўляюцца аднагадовымі раслінамі клады petunia, а obtusifolia N. - шматгадовымі раслінамі сястрынскай клады Trigonophyllae (38). Пасля гэтага на гэтых сямі відах была праведзена індукцыя W + W, W + OSM і W + OSS1 для вывучэння метабалічнай перабудовы харчавання насякомых на ўзроўні віду.
(A) Філагенетычнае дрэва бутстрэпа, заснаванае на максімальнай праўдападобнасці [для сінтэзу ядзернага глутаміна (38)] і геаграфічным размеркаванні сямі блізкароднасных відаў Nicotiana (розныя колеры) (37). (B) Дыяграма рассейвання спецыялізаванай разнастайнасці для метабалічных профіляў сямі відаў Nicotiana (939 MS/MS; файл дадзеных S1). На відавым узроўні разнастайнасць метабалома адмоўна карэлюе са ступенню спецыялізацыі. Аналіз карэляцыі на відавым узроўні паміж метабалічнай разнастайнасцю і спецыялізацыяй і назапашваннем JA паказаны на малюнку 2. S9. Колер, розныя тыпы; трохвугольнік, W + OSS1; прастакутнік, W + OSM; (C) Дынаміка JA і JA-Ile Nicotiana ранжыравана ў адпаведнасці з амплітудай узбуджэння OS (двухбаковы ANOVA і Tukey HSD пасля множнага параўнання, * P <0,05, ** P <0,01 і * ** Для параўнання W + OS і W + W, P <0,001). Скрынкавая дыяграма (D) разнастайнасці і (E) спецыялізацыі кожнага віду пасля мадэлявання траваедных і метыл-JA (MeJA). Зорачка паказвае значную розніцу паміж W + OS і W + W або ланалінам плюс W (Lan + W) або Lan плюс MeJA (Lan + MeJa) і кантролем Lan (двухфактарны дысперсійны аналіз з наступным множным параўнаннем па метаду Цьюкі HSD post hoc, *P<0,05, **P<0,01 і ***P<0,001).
Выкарыстоўваючы метад падвойных кластараў, мы вызначылі 9 модуляў з 939 MS/MS (файл дадзеных S1). Склад MS/MS, пераканфігураваных рознымі апрацоўкамі, значна адрозніваецца ў розных модулях паміж відамі (малюнак S8). Візуалізацыя Hj (тут званая γ-разнастайнасцю на ўзроўні віду) і δj паказвае, што розныя віды аб'ядноўваюцца ў вельмі розныя групы ў метабалічнай прасторы, дзе падзел на ўзроўні віду звычайна больш прыкметны, чым узбуджэнне. За выключэннем N. linear і N. obliquus, яны дэманструюць шырокі дынамічны дыяпазон індукцыйных эфектаў (малюнак 5B). Наадварот, такія віды, як N. purpurea і N. obtusifolia, маюць менш відавочную метабалічную рэакцыю на апрацоўку, але метабалом больш разнастайны. Відаспецыфічнае размеркаванне індукаванай метабалічнай рэакцыі прывяло да значнай адмоўнай карэляцыі паміж спецыялізацыяй і гама-разнастайнасцю (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Змены ўзроўняў JA, выкліканыя АС, станоўча карэлююць са спецыялізацыяй метабалома і адмоўна карэлююць з метабалічнай гама-разнастайнасцю, якую праяўляе кожны від (малюнак 5B і малюнак S9). Варта адзначыць, што віды, якія на малюнку 5C у размоўнай мове называюць відамі з «сігнальным рэагаваннем», такія як Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute і Nepenthes attenuated, выклікалі значныя прыкметы праз 30 хвілін. Нядаўнія ўспышкі JA і JA-Ile, спецыфічныя для АС, у той час як іншыя бактэрыі, якія называюцца «сігнальна нерэактыўнымі», такія як Nepenthes mills, Nepenthes powdery і N. obtusifolia, паказваюць толькі індукцыю JA-Ile Edge без якой-небудзь спецыфічнасці да АС (малюнак 5C). На метабалічным узроўні, як згадвалася вышэй, для аслабленых Nepenthes рэчывы, якія рэагуюць на сігнал, праявілі спецыфічнасць да АС і значна павялічылі δj, адначасова зніжаючы Hj. Гэты спецыфічны для АС эфект праймінгу не быў выяўлены ў відаў, класіфікаваных як віды, якія не рэагуюць на сігнал (малюнак 5, D і E). Спецыфічныя для АС метабаліты часцей падзяляюцца паміж відамі, якія рэагуюць на сігнал, і гэтыя сігнальныя кластары кластарызуюцца з відамі са слабейшымі сігнальнымі рэакцыямі, у той час як віды са слабейшымі сігнальнымі рэакцыямі дэманструюць меншую ўзаемазалежнасць (малюнак S8). Гэты вынік сведчыць аб тым, што спецыфічная для АС індукцыя JA і спецыфічная для АС рэканфігурацыя ніжэйшага метабалома звязаны на ўзроўні віду.
Далей мы выкарысталі ланаліновую пасту, якая змяшчае метылJA (MeJA), для апрацоўкі раслін, каб даследаваць, ці абмяжоўваюцца гэтыя рэжымы спалучэння даступнасцю JA, унесенага экзагенным JA, які будзе знаходзіцца ў цытаплазме раслін. Хуткая дээстэрыфікацыя - гэта JA. Мы выявілі такую ​​ж тэндэнцыю паступовага пераходу ад відаў, якія рэагуюць на сігнал, да відаў, якія не рэагуюць на сігнал, выкліканую бесперапынным паступленнем JA (Малюнак 5, D і E). Карацей кажучы, апрацоўка MeJA моцна перапраграмавала метабаломы лінейных нематод, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens і N. mikimotoi, што прывяло да значнага павелічэння δj і зніжэння Hj. Толькі N. purpurea паказала павелічэнне δj, але не Hj. N. obtusifolia, якая, як было паказана раней, назапашвае надзвычай нізкія ўзроўні JA, таксама дрэнна рэагуе на апрацоўку MeJA з пункту гледжання рэканфігурацыі метабалома. Гэтыя вынікі паказваюць, што прадукцыя JA або трансдукцыя сігналу фізіялагічна абмежаваная ў відаў, якія не рэагуюць на сігнал. Каб праверыць гэтую гіпотэзу, мы вывучылі чатыры віды (N. pallens, N. mills, N. pink і N. microphylla), індукаваныя транскрыптомамі W + W, W + OSM і W + OSS1 (39). У адпаведнасці з характарам перабудовы метабалома, віды добра падзеленыя ў транскрыптомнай прасторы, сярод якіх N. attenuated паказаў найвышэйшы RDPI, індукаваны OS, у той час як N. gracilis - найменшы (малюнак 6A). Аднак было выяўлена, што разнастайнасць транскрыптомаў, індукаваная N. oblonga, была найменшай сярод чатырох відаў, насуперак найвышэйшай метабанамічнай разнастайнасці N. oblonga, раней паказанай у сямі відаў. Папярэднія даследаванні паказалі, што набор генаў, звязаных з раннімі абарончымі сігналамі, у тым ліку сігналамі JA, тлумачыць спецыфічнасць ранніх абарончых рэакцый, індукаваных элісітарамі, звязанымі з траваеднымі, у відаў Nicotiana (39). Параўнанне сігнальных шляхоў JA паміж гэтымі чатырма відамі выявіла цікавую заканамернасць (малюнак 6B). Большасць генаў гэтага шляху, такія як AOC, OPR3, ACX і COI1, прадэманстравалі адносна высокі ўзровень індукцыі ў гэтых чатырох відаў. Аднак ключавы ген, JAR4, пераўтварае JA ў яго біялагічна актыўную форму назапашаных транскрыптаў JA-Ile, і яго ўзровень транскрыпцыі вельмі нізкі, асабліва ў N. mills, Nepenthes pieris і N. microphylla. Акрамя таго, у N. bifidum не быў выяўлены толькі транскрыпт іншага гена AOS. Гэтыя змены ў экспрэсіі генаў могуць быць адказнымі за экстрэмальныя фенатыпы, выкліканыя нізкай прадукцыяй JA ў сігнальна-анергічных відаў і індукцыяй N. gracilis.
(А) Аналіз тэорыі інфармацыі па перапраграмаванні ранніх транскрыпцыйных рэакцый чатырох блізкароднасных відаў тытуню, адабраных праз 30 хвілін пасля індукцыі траваеднасці. RDPI разлічваецца шляхам параўнання лісця, індукаванага траваеднай асобінай, з кантрольнай групай з раневай мутацыяй. Колеры паказваюць розныя віды, а сімвалы — розныя метады апрацоўкі. (Б) Аналіз экспрэсіі генаў у сігнальных шляхах JA сярод чатырох відаў. Спрошчаны шлях JA паказаны побач з скрынкавай дыяграмай. Розныя колеры паказваюць розныя метады апрацоўкі. Зорачка паказвае, што існуе значная розніца паміж апрацоўкай W + OS і кантролем W + W (для t-крытэрыя Стьюдэнта для парных адрозненняў, *P<0,05, **P<0,01 і ***P<0,001). OPDA, 12-оксофітадыенавая кіслата; OPC-8: 0,3-оксо-2(2′(Z)-пентэніл)-цыклапентан-1-актанавая кіслата.
У апошняй частцы мы вывучалі, як відаспецыфічная перабудова метабалома розных відаў раслін у залежнасці ад віду насякомых можа быць устойлівай да траваедных. Папярэднія даследаванні сканцэнтраваны на родзе Nicotiana. Іх устойлівасць да Ms і лічынак значна адрозніваецца (40). Тут мы вывучалі сувязь паміж гэтай мадэллю і іх метабалічнай пластычнасцю. Выкарыстоўваючы вышэйзгаданыя чатыры віды тытуню і правяраючы карэляцыю паміж разнастайнасцю і спецыялізацыяй метабалома, выкліканага траваеднымі, і ўстойлівасцю раслін да Ms і Sl, мы выявілі, што ўстойлівасць, разнастайнасць і спецыялізацыя да універсальнага Sl станоўча карэлююць, у той час як карэляцыя паміж устойлівасцю да экспертных дам і спецыялізацыяй слабая, а карэляцыя з разнастайнасцю неістотная (малюнак S10). Што тычыцца ўстойлівасці да S1, то як аслаблены N. chinensis, так і N. gracilis, якія, як было паказана раней, дэманструюць як узровень трансдукцыі сігналу JA, так і пластычнасць метабалома, мелі вельмі розныя рэакцыі на індукцыю траваеднымі, і яны таксама прадэманстравалі падобную высокую ўстойлівасць. Пол.
За апошнія шэсцьдзесят гадоў тэорыя абароны раслін забяспечыла тэарэтычную базу, на аснове якой даследчыкі прадказалі значную колькасць эвалюцыі і функцый спецыялізаваных метабалітаў раслін. Большасць з гэтых тэорый не прытрымліваюцца звычайнай працэдуры моцных высноў (41). Яны прапануюць ключавыя прагнозы (3) на адным узроўні аналізу. Калі праверка ключавых прагнозаў дазваляе прааналізаваць канкрэтныя тэорыі, гэта зробіць поле рухаецца наперад. Можна падтрымаць, але адхіліць іншыя (42). Замест гэтага новая тэорыя робіць прагнозы на розных узроўнях аналізу і дадае новы пласт апісальных меркаванняў (42). Аднак дзве тэорыі, прапанаваныя на функцыянальным узроўні, МТ і АД, можна лёгка растлумачыць як важныя прагнозы спецыялізаваных метабалічных змен, выкліканых траваеднымі жывёламі: тэорыя АД лічыць, што змены ў спецыялізаванай метабалічнай «прасторы» маюць высокую накіраванасць. Тэорыя МТ лічыць, што гэтыя змены будуць ненакіраванымі і выпадкова размешчанымі ў метабалічнай прасторы, і, як правіла, маюць метабаліты з высокай абарончай каштоўнасцю. Папярэднія даследаванні прагнозаў АД і МТ былі правераны з выкарыстаннем вузкага набору апрыёрных «абарончых» злучэнняў. Гэтыя метабаліт-арыентаваныя тэсты выключаюць магчымасць аналізу ступені і траекторыі рэканфігурацыі метабалома падчас траваеднасці і не дазваляюць праводзіць тэставанне ў рамках паслядоўнай статыстычнай структуры, каб патрабаваць ключавых прагнозаў, якія можна разглядаць як цэлае. Колькасная ацэнка змен у метабаломе раслін. Тут мы выкарысталі інавацыйную тэхналогію ў метабаломе, заснаваную на вылічальнай мас-спектрометрыі (МС), і правялі дэканвалюцыйны МС-аналіз у агульнай валюте дэскрыптараў тэорыі інфармацыі, каб праверыць адрозненне паміж імі, прапанаванае на глабальным узроўні метабаломікі. Ключавы прагноз гэтай тэорыі. Тэорыя інфармацыі ўжывалася ў многіх галінах, асабліва ў кантэксце даследаванняў біяразнастайнасці і патоку пажыўных рэчываў (43). Аднак, наколькі нам вядома, гэта першае прымяненне, якое выкарыстоўваецца для апісання метабалічнай інфармацыйнай прасторы раслін і вырашэння экалагічных праблем, звязаных з часовымі метабалічнымі зменамі ў адказ на сігналы навакольнага асяроддзя. У прыватнасці, магчымасці гэтага метаду заключаюцца ў яго здольнасці параўноўваць заканамернасці ўнутры і паміж відамі раслін, каб вывучыць, як траваедныя жывёлы эвалюцыянавалі ад розных відаў да міжвідавых макраэвалюцыйных заканамернасцей на розных узроўнях эвалюцыі. Метабалізм.
Аналіз галоўных кампанент (АПК) пераўтварае шматмерны набор дадзеных у прастору памяншэння памернасці, каб можна было растлумачыць асноўную тэндэнцыю дадзеных, таму ён звычайна выкарыстоўваецца ў якасці даследчых метадаў для аналізу набору дадзеных, такіх як дэканвалюцыйны метабалом. Аднак памяншэнне памернасці прывядзе да страты часткі інфармацыйнага зместу ў наборы дадзеных, і АПК не можа даць колькасную інфармацыю аб характарыстыках, якія асабліва важныя для экалагічнай тэорыі, такіх як: як траваедныя пераканфігуруюць разнастайнасць у спецыялізаваных галінах (напрыклад, багацце, распаўсюджванне) і колькасць метабалітаў? Якія метабаліты з'яўляюцца прадказальнікамі індукаванага стану дадзенай траваеднай жывёлы? З пункту гледжання спецыфічнасці, разнастайнасці і індуцыбельнасці, інфармацыйны змест профілю метабалітаў, спецыфічных для лісця, раскладаецца, і выяўляецца, што ўжыванне ў ежу траваедных жывёл можа актываваць спецыфічны метабалізм. Нечакана мы заўважылі, што, як апісана ў рэалізаваных індыкатарах тэорыі інфармацыі, атрыманая метабалічная сітуацыя мае вялікае перакрыццё пасля нападаў дзвюх траваедных (начнога генераліста Sl) і эксперта Solanaceae Ms. Нягледзячы на ​​тое, што іх харчовыя паводзіны і канцэнтрацыя істотна адрозніваюцца. Ініцыятар кан'югату тоўстых кіслот і амінакіслот (FAC) у OS (31). Выкарыстоўваючы OS траваедных для лячэння стандартызаваных колючых ран, мадэляванае лячэнне траваедных таксама паказала падобную тэндэнцыю. Гэтая стандартызаваная працэдура мадэлявання рэакцыі раслін на напады траваедных ліквідуе змешвальныя фактары, выкліканыя зменамі ў харчовых паводзінах траваедных, якія прыводзяць да рознай ступені пашкоджання ў розны час (34). FAC, які, як вядома, з'яўляецца асноўнай прычынай OSM, зніжае рэакцыі JAS і іншых раслінных гармонаў у OSS1, у той час як OSS1 зніжае іх у сотні разоў (31). Аднак OSS1 выклікаў падобны ўзровень назапашвання JA ў параўнанні з OSM. Раней было паказана, што рэакцыя JA ў аслабленых Nepenthes вельмі адчувальная да OSM, дзе FAC можа падтрымліваць сваю актыўнасць нават у развядзенні 1:1000 вадой (44). Такім чынам, у параўнанні з OSM, хоць FAC у OSS1 вельмі нізкі, яго дастаткова, каб выклікаць дастатковую ўспышку JA. Папярэднія даследаванні паказалі, што порін-падобныя бялкі (45) і алігацукрыды (46) могуць выкарыстоўвацца ў якасці малекулярных падказак для запуску ахоўных рэакцый раслін у OSS1. Аднак да гэтага часу незразумела, ці адказваюць гэтыя элісітары ў OSS1 за назапашванне JA, якое назіраецца ў бягучым даследаванні.
Нягледзячы на ​​тое, што існуе няшмат даследаванняў, якія апісваюць розныя метабалічныя адбіткі, выкліканыя прымяненнем розных траваедных або экзагенных JA або SA (саліцылавай кіслаты) (47), ніхто не парушаў спецыфічнае для віду траваедных парушэнне ў сетцы раслін і яго ўплыў на спецыфічную асабістую інфармацыю. Агульны ўплыў метабалізму сістэматычна вывучаецца. Гэты аналіз дадаткова пацвердзіў, што сувязь унутранай гарманальнай сеткі з іншымі расліннымі гармонамі, акрамя JA, фарміруе спецыфічнасць метабалічнай рэарганізацыі, выкліканай траваеднымі. У прыватнасці, мы выявілі, што ET, выкліканы OSM, быў значна большым, чым выкліканы OSS1. Гэты рэжым адпавядае большаму ўтрыманню FAC у OSM, што з'яўляецца неабходнай і дастатковай умовай для запуску выбуху ET (48). У кантэксце ўзаемадзеяння паміж раслінамі і траваеднымі жывёламі сігнальная функцыя ET на дынаміку метабалітаў, спецыфічных для раслін, усё яшчэ спарадычная і накіравана толькі на адну групу злучэнняў. Акрамя таго, у большасці даследаванняў выкарыстоўвалася экзагеннае прымяненне ET або яго папярэднікаў або розных інгібітараў для вывучэння рэгуляцыі ET, сярод якіх гэтыя экзагенныя хімічныя прымяненні будуць выклікаць шмат неспецыфічных пабочных эфектаў. Наколькі нам вядома, гэта даследаванне ўяўляе сабой першае маштабнае сістэматычнае вывучэнне ролі ЭТ у яго выкарыстанні для атрымання і ўспрымання пашкоджаных трансгенных раслін з мэтай каардынацыі дынамікі метабалома раслін. Спецыфічная для траваедных індукцыя ЭТ можа ў канчатковым выніку мадуляваць рэакцыю метабалома. Найбольш значнай з'яўляецца трансгенная маніпуляцыя генамі біясінтэзу (ACO) і ўспрымання (ETR1) ЭТ, якая выявіла спецыфічнае для траваедных назапашванне de novo феналамідаў. Раней было паказана, што ЭТ можа тонка рэгуляваць індукаванае JA назапашванне нікаціну шляхам рэгулявання путрэсцын-N-метылтрансферазы (49). Аднак з механічнага пункту гледжання незразумела, як ЭТ тонка рэгулюе індукцыю фенаміду. Акрамя функцыі сігнальнай трансдукцыі ЭТ, метабалічны паток таксама можа быць накіраваны на S-адэназіл-1-метыянін для рэгулявання інвеставання ў поліамінафеноламіды. S-адэназіл-1-метыянін з'яўляецца ЭТ і распаўсюджаным прамежкавым прадуктам шляху біясінтэзу поліамінаў. Механізм, з дапамогай якога сігнал ЭТ рэгулюе ўзровень феналаміду, патрабуе далейшага вывучэння.
Доўгі час з-за вялікай колькасці спецыяльных метабалітаў невядомай структуры пільная ўвага да канкрэтных метабалічных катэгорый не дазваляла строга ацаніць часавыя змены метабалічнай разнастайнасці пасля біялагічных узаемадзеянняў. У цяперашні час, зыходзячы з аналізу тэорыі інфармацыі, асноўным вынікам атрымання спектру MS/MS на аснове непрадузятых метабалітаў з'яўляецца тое, што траваедныя жывёлы, якія ядуць траваедных або імітуюць іх, працягваюць зніжаць агульную метабалічную разнастайнасць метабалома лісця, павялічваючы пры гэтым ступень яго спецыялізацыі. Гэта часовае павелічэнне спецыфічнасці метабалома, выкліканае траваеднымі жывёламі, звязана з сінергічным павелічэннем спецыфічнасці транскрыптома. Асаблівасцю, якая найбольш спрыяе гэтай большай спецыялізацыі метабалома (якая мае больш высокае значэнне Si), з'яўляецца спецыяльны метабаліт з раней ахарактарызаванай траваеднай функцыяй. Гэтая мадэль адпавядае прадказанню тэорыі OD, але прадказанне МТ, звязанае з выпадковасцю перапраграмавання метабалома, не з'яўляецца паслядоўным. Аднак гэтыя дадзеныя таксама адпавядаюць прадказанню змешанай мадэлі (лепшая МТ; малюнак 1B), таму што іншыя неахарактарызаваныя метабаліты з невядомымі ахоўнымі функцыямі ўсё яшчэ могуць прытрымлівацца выпадковага размеркавання Si.
Варта адзначыць, што ў гэтым даследаванні дадаткова выяўлена заканамернасць, якая заключаецца ў тым, што ад узроўню мікраэвалюцыі (адна расліна і папуляцыя тытуню) да большага эвалюцыйнага маштабу (блізкароднасныя віды тытуню) розныя ўзроўні эвалюцыйнай арганізацыі знаходзяцца ў «найлепшай абароне». Існуюць значныя адрозненні ў здольнасцях траваедных жывёл. Мур і інш. (20) і Кеслер і Кальске (1) незалежна адзін ад аднаго прапанавалі пераўтварыць тры функцыянальныя ўзроўні біяразнастайнасці, першапачаткова вылучаныя Уітакерам (50), у канстытутыўныя і індукаваныя часавыя змены хімічнай разнастайнасці; ні гэтыя аўтары не падсумавалі працэдуры збору дадзеных метабалома ў вялікіх маштабах таксама не акрэсліваюць, як разлічыць метабалічную разнастайнасць з гэтых дадзеных. У гэтым даследаванні нязначныя карэкціроўкі функцыянальнай класіфікацыі Уітакера будуць разглядаць α-метабалічную разнастайнасць як разнастайнасць спектраў MS/MS у дадзенай расліне, а β-метабалічную разнастайнасць як базавы ўнутрывідавы метабалізм групы папуляцый, а γ-метабалічная разнастайнасць будзе пашырэннем аналізу падобных відаў.
Сігнал JA мае важнае значэнне для шырокага спектру метабалічных рэакцый траваедных. Аднак адсутнічае строгае колькаснае тэставанне ўкладу ўнутрывідавай рэгуляцыі біясінтэзу JA ў разнастайнасць метабалома, і ці з'яўляецца сігнал JA агульным месцам для метабалічнай дыверсіфікацыі, выкліканай стрэсам, на больш высокім макраэвалюцыйным маштабе, пакуль невядома. Мы назіралі, што траваедная прырода траваедных Nepenthes выклікае спецыялізацыю метабалома, і варыяцыі спецыялізацыі метабалома ўнутры папуляцыі відаў Nicotiana і сярод блізкароднасных відаў Nicotiana сістэматычна станоўча карэлююць з сігналізацыяй JA. Акрамя таго, калі сігнал JA парушаны, метабалічная спецыфічнасць, выкліканая адным генатыпам траваеднай жывёлы, будзе адменена (Малюнак 3, C і E). Паколькі змены метабалічнага спектру натуральна аслабленых папуляцый Nepenthes у асноўным колькасныя, змены ў метабалічнай β-разнастайнасці і спецыфічнасці ў гэтым аналізе могуць быць у значнай ступені выкліканы моцным узбуджэннем багатых на метабаліты катэгорый злучэнняў. Гэтыя класы злучэнняў дамінуюць у частцы профілю метабалома і прыводзяць да станоўчай карэляцыі з сігналамі JA.
Паколькі біяхімічныя механізмы блізкароднасных відаў тытуню вельмі адрозніваюцца, метабаліты ідэнтыфікуюцца спецыяльна ў якасным аспекце, таму ён больш аналітычны. Апрацоўка атрыманага метабалічнага профілю з дапамогай тэорыі інфармацыі паказвае, што індукцыя траваедных пагаршае кампраміс паміж метабалічнай гама-разнастайнасцю і спецыялізацыяй. Сігнал JA гуляе цэнтральную ролю ў гэтым кампрамісе. Павелічэнне спецыялізацыі метабалома адпавядае асноўнаму прагнозу аптычнай шчыльнасці (OD) і станоўча карэлюе з сігналам JA, у той час як сігнал JA адмоўна карэлюе з метабалічнай гама-разнастайнасцю. Гэтыя мадэлі паказваюць, што здольнасць OD раслін у асноўным вызначаецца пластычнасцю JA, як у мікраэвалюцыйным, так і ў больш шырокім эвалюцыйным маштабе. Эксперыменты па прымяненні экзагенных JA, якія абыходзяць дэфекты біясінтэзу JA, дадаткова паказваюць, што блізкароднасныя віды тытуню можна адрозніць ад сігнальна-рэагуючых і сігнальна-нерэагуючых відаў, гэтак жа, як іх спосаб JA і пластычнасць метабалома, індукаваная траваеднымі. Віды, якія не рэагуюць на сігнал, не могуць рэагаваць з-за сваёй няздольнасці выпрацоўваць эндагенны JA і таму падпарадкоўваюцца фізіялагічным абмежаванням. Гэта можа быць выклікана мутацыямі ў некаторых ключавых генах сігнальнага шляху JA (AOS і JAR4 у N. crescens). Гэты вынік падкрэслівае, што гэтыя міжвідавыя макраэвалюцыйныя заканамернасці могуць быць у асноўным абумоўлены зменамі ва ўнутраным успрыманні і рэакцыі гармонаў.
Акрамя ўзаемадзеяння паміж раслінамі і траваеднымі жывёламі, даследаванне метабалічнай разнастайнасці звязана з усімі важнымі тэарэтычнымі дасягненнямі ў даследаванні біялагічнай адаптацыі да навакольнага асяроддзя і эвалюцыі складаных фенатыпічных прыкмет. З павелічэннем аб'ёму дадзеных, атрыманых з дапамогай сучасных прыбораў мас-спектрометрыі (MS), праверка гіпотэз аб метабалічнай разнастайнасці цяпер можа выходзіць за рамкі індывідуальных/катэгорыйных адрозненняў у метабалітах і праводзіць глабальны аналіз, каб выявіць нечаканыя заканамернасці. У працэсе маштабнага аналізу важнай метафарай з'яўляецца ідэя стварэння значных карт, якія можна выкарыстоўваць для даследавання дадзеных. Такім чынам, важным вынікам цяперашняга спалучэння непрадузятай метабаломікі MS/MS і тэорыі інфармацыі з'яўляецца тое, што яна забяспечвае простую метрыку, якую можна выкарыстоўваць для пабудовы карт для прагляду метабалічнай разнастайнасці ў розных таксанамічных маштабах. Гэта асноўнае патрабаванне гэтага метаду. Вывучэнне мікра/макра эвалюцыі і экалогіі супольнасцей.
На макраэвалюцыйным узроўні аснова тэорыі сумеснай эвалюцыі раслін і насякомых Эрліха і Равена (51) заключаецца ў прадказанні, што варыятыўнасць міжвідавай метабалічнай разнастайнасці з'яўляецца прычынай дыверсіфікацыі раслінных ліній. Аднак за пяцьдзесят гадоў, якія прайшлі з моманту публікацыі гэтай фундаментальнай працы, гэтая гіпотэза рэдка правяралася (52). Гэта ў значнай ступені звязана з філагенетычнымі характарыстыкамі параўнальных метабалічных характарыстык у розных раслінных лініях на вялікія адлегласці. Гэтая рэдкасць можа быць выкарыстана для замацавання метадаў аналізу мэт. Сучасны працоўны працэс MS/MS, апрацаваны тэорыяй інфармацыі, колькасна вызначае структурнае падабенства MS/MS невядомых метабалітаў (без папярэдняга адбору метабалітаў) і пераўтварае гэтыя MS/MS у набор MS/MS, такім чынам, у прафесійным метабалізме. Гэтыя макраэвалюцыйныя мадэлі параўноўваюцца ў шкале класіфікацыі. Простыя статыстычныя паказчыкі. Працэс падобны да філагенетычнага аналізу, які можа выкарыстоўваць выраўноўванне паслядоўнасцей для колькаснай ацэнкі хуткасці дыверсіфікацыі або эвалюцыі характару без папярэдняга прагназавання.
На біяхімічным узроўні гіпотэза скрынінгу Фірна і Джонса (53) паказвае, што метабалічная разнастайнасць падтрымліваецца на розных узроўнях, каб забяспечыць сыравіну для ажыццяўлення біялагічнай актыўнасці раней не звязаных або замешчаных метабалітаў. Метады тэорыі інфармацыі забяспечваюць аснову, у якой гэтыя спецыфічныя для метабалітаў эвалюцыйныя пераходы, якія адбываюцца падчас спецыялізацыі метабалітаў, можна колькасна ацаніць як частку прапанаванага працэсу эвалюцыйнага скрынінгу: біялагічна актыўная адаптацыя ад нізкай спецыфічнасці да высокай спецыфічнасці. Інгібіраваныя метабаліты дадзенага асяроддзя.
Увогуле, на ранніх этапах развіцця малекулярнай біялогіі былі распрацаваны важныя тэорыі абароны раслін, і дэдуктыўныя метады, заснаваныя на гіпотэзах, шырока лічацца адзіным сродкам навуковага прагрэсу. Гэта ў значнай ступені звязана з тэхнічнымі абмежаваннямі вымярэння ўсяго метабалома. Нягледзячы на ​​тое, што метады, заснаваныя на гіпотэзах, асабліва карысныя пры выбары іншых прычынных механізмаў, іх здольнасць пашырыць наша разуменне біяхімічных сетак больш абмежаваная, чым вылічальныя метады, даступныя ў сучаснай навуцы, якая працуе з вялікімі аб'ёмамі дадзеных. Такім чынам, тэорыі, якія немагчыма прадказаць, далёка выходзяць за рамкі даступных дадзеных, таму гіпатэтычны цыкл формул/тэстаў прагрэсу ў галіне даследаванняў нельга адмяніць (4). Мы прадбачым, што вылічальны працоўны працэс метабаломікі, прадстаўлены тут, можа аднавіць цікавасць да нядаўніх (як) і канчатковых (чаму) пытанняў метабалічнай разнастайнасці і ўнесці свой уклад у новую эру тэарэтычна арыентаванай навукі аб дадзеных. Гэтая эпоха перагледзела важныя тэорыі, якія натхнялі папярэднія пакаленні.
Непасрэднае кармленне траваеднымі ажыццяўляецца шляхам вырошчвання лічынкі другой стадыі або лічынкі Sl на адным бледнаафарбаваным лісці расліны-кучыка адной квітучай ружы, па 10 раслінных паўтораў на расліну. Лічынкі насякомых заціскалі заціскамі, а астатнюю тканіну ліста збіралі праз 24 і 72 гадзіны пасля заражэння і хутка замарожвалі, а метабаліты здабывалі.
Імітаваць апрацоўку траваедных раслін вельмі сінхранізаваным чынам. Метад заключаецца ў тым, каб з дапамогай колаў з тканінным узорам прабіць тры рады калючак з кожнага боку сярэдняй жылкі трох цалкам развітых лісця расліны падчас стадыі росту тканіннай гірлянды і неадкладна нанесці разведзены 1:5 раствор Ms. Або ўвесці S1 OS у рану ад праколу пальцамі ў пальчатках. Зняць і апрацаваць ліст, як апісана вышэй. Выкарыстоўваць апісаны раней метад для экстракцыі першасных метабалітаў і раслінных гармонаў (54).
Для экзагеннага прымянення JA тры хвосцікі лісця кожнай з шасці кветкавых раслін руж кожнага віду апрацоўваюць 20 мкл ланалінавай пасты, якая змяшчае 150 мкг MeJA (Lan + MeJA), і 20 мкл ланаліну з апрацоўкай ран (Lan + W), або выкарыстоўваюць 20 мкл чыстага ланаліну ў якасці кантролю. Лісце збіраюць праз 72 гадзіны пасля апрацоўкі, замарожваюць у вадкім азоце і захоўваюць пры тэмпературы -80°C да выкарыстання.
У нашай даследчай групе былі выяўлены чатыры трансгенныя лініі JA і ET, а менавіта irAOC (36), irCOI1 (55), irACO і sETR1 (48). irAOC прадэманстравала значнае зніжэнне ўзроўню JA і JA-Ile, у той час як irCOI1 не была адчувальная да JA. У параўнанні з EV, назапашванне JA-Ile павялічылася. Аналагічна, irACO зніжае выпрацоўку ET, а ў параўнанні з EV, sETR1, які неадчувальны да ET, павялічвае выпрацоўку ET.
Для неінвазіўнага вымярэння ET выкарыстоўваецца фотаакустычны лазерны спектрометр (датчык ET рэальнага часу Sensor Sense ETD-300). Адразу пасля апрацоўкі палову лісця зразалі і пераносілі ў герметычны шкляны флакон аб'ёмам 4 мл, а прастору над вадкасцю пакідалі назапашвацца на працягу 5 гадзін. Падчас вымярэння кожны флакон прамывалі струменем чыстага паветра з хуткасцю 2 літры/гадзіну на працягу 8 хвілін, якое папярэдне прайшло праз каталізатар, прадастаўлены Sensor Sense, для выдалення CO2 і вады.
Дадзеныя мікрачыпаў былі першапачаткова апублікаваныя ў (35) і захаваны ў комплекснай базе дадзеных па экспрэсіі генаў Нацыянальнага цэнтра біятэхналагічнай інфармацыі (NCBI) (нумар доступу GSE30287). Для гэтага даследавання былі вынятыя дадзеныя, якія адпавядаюць лісцю, выкліканаму апрацоўкай W + OSM, і непашкоджаным кантролі. Неапрацаваная інтэнсіўнасць складае log2. Перад статыстычным аналізам базавая лінія была пераўтворана і нармалізавана да 75-га перцэнтыля з выкарыстаннем праграмнага пакета R.
Арыгінальныя дадзеныя секвенавання РНК (RNA-seq) відаў Nicotiana былі атрыманы з архіваў кароткіх чытанняў NCBI (SRA), нумар праекта PRJNA301787, пра якія паведамлялі Чжоу і інш. (39), і працягваліся, як апісана ў (56). Неапрацаваныя дадзеныя, апрацаваныя W + W, W + OSM і W + OSS1, якія адпавядаюць відам Nicotiana, былі адабраны для аналізу ў гэтым даследаванні і апрацаваны наступным чынам: спачатку неапрацаваныя паказанні RNA-seq былі пераўтвораны ў фармат FASTQ. HISAT2 пераўтварае FASTQ у SAM, а SAMtools пераўтварае файлы SAM у адсартаваныя файлы BAM. Для разліку экспрэсіі генаў выкарыстоўваецца StringTie, і яго метад экспрэсіі заключаецца ў тым, што ёсць фрагменты на тысячу асноў фрагментаў на мільён секвенаваных транскрыпцыйных фрагментаў.
Храматаграфічная калона Acclaim (150 мм x 2,1 мм; памер часціц 2,2 мкм), якая выкарыстоўвалася ў аналізе, і ахоўная калона 4 мм x 4 мм выраблены з аднаго і таго ж матэрыялу. У сістэме звышвысокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 выкарыстоўваецца наступны бінарны градыент: ад 0 да 0,5 хвілін, ізакратычная 90% А [дэіянізаваная вада, 0,1% (аб./аб.) ацэтанітрылу і 0,05% мурашынай кіслаты], 10% В (ацэтанітрыл і 0,05% мурашынай кіслаты); ад 0,5 да 23,5 хвілін, градыентная фаза складае 10% А і 90% В адпаведна; ад 23,5 да 25 хвілін, ізакратычная 10% А і 90% В. Хуткасць патоку складае 400 мкл/мін. Для ўсіх аналізаў MS уводзьце элюент калонкі ў квадрупольны і часапалётны (qTOF) аналізатар, абсталяваны крыніцай электрараспылення, якая працуе ў рэжыме станоўчай іанізацыі (напружанне капіляра 4500 В; выхад капіляра 130 В; тэмпература сушкі 200°C; паток паветра падчас сушкі 10 літраў/мін).
Выканайце аналіз фрагментаў MS/MS (далей — MS/MS), якія не маюць дачынення або не адрозніваюцца ад дадзеных, каб атрымаць структурную інфармацыю аб агульным выяўляемым метабалічным профілі. Канцэпцыя недыскрымінацыйнага метаду MS/MS заснавана на тым факце, што квадруполь мае вельмі вялікае акно ізаляцыі масы [таму ўсе сігналы суадносін масы да зарада (m/z) разглядайце як фрагменты]. Па гэтай прычыне, паколькі прыбор Impact II не змог стварыць нахіл CE, было праведзена некалькі незалежных аналізаў з выкарыстаннем павышаных значэнняў энергіі дысацыяцыі сутыкненняў (CE), выкліканай сутыкненнямі. Карацей кажучы, спачатку прааналізуйце ўзор з дапамогай UHPLC-электрараспыляльнай іанізацыі/qTOF-MS з выкарыстаннем рэжыму адзіночнай мас-спектрометрыі (умовы нізкай фрагментацыі, створаныя фрагментацыяй у крыніцы), скануючы ад m/z 50 да 1500 з частатой паўтарэння 5 Гц. Выкарыстоўвайце азот у якасці газу сутыкненняў для аналізу MS/MS і выканайце незалежныя вымярэнні пры наступных чатырох розных напружаннях дысацыяцыі, выкліканых сутыкненнямі: 20, 30, 40 і 50 эВ. На працягу ўсяго працэсу вымярэння квадруполь мае найбольшае акно ізаляцыі масы — ад m/z 50 да 1500. Калі эксперымент з m/z пярэдняга цела і шырынёй ізаляцыі ўсталяваны на 200, дыяпазон мас аўтаматычна актывуецца праграмным забеспячэннем прыбора і роўным 0 Да. Сканіруйце на наяўнасць фрагментаў масы, як у рэжыме адной масы. Для каліброўкі масы выкарыстоўвайце фарыят натрыю (50 мл ізапрапанолу, 200 мкл мурашынай кіслаты і 1 мл 1M воднага раствора NaOH). Выкарыстоўваючы высокадакладны алгарытм каліброўкі Bruker, файл дадзеных калібруецца пасля выканання сярэдняга спектру за зададзены перыяд часу. Выкарыстоўвайце функцыю экспарту праграмнага забеспячэння Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Брэмен, Германія), каб пераўтварыць неапрацаваныя файлы дадзеных у фармат NetCDF. Набор дадзеных MS/MS быў захаваны ў адкрытай метабаломнай базе дадзеных MetaboLights (www.ebi.ac.uk) з рэгістрацыйным нумарам MTBLS1471.
Зборку MS/MS можна рэалізаваць з дапамогай карэляцыйнага аналізу паміж сігналамі якасці MS1 і MS/MS для нізкай і высокай энергіі сутыкнення і новых правілаў. Для рэалізацыі карэляцыйнага аналізу размеркавання папярэдніка прадукту выкарыстоўваецца скрыпт на R, а для рэалізацыі правілаў — скрыпт на C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline).
Каб паменшыць колькасць ілжыва станоўчых памылак, выкліканых фонавым шумам і ілжывай карэляцыяй, выкліканай выяўленнем пэўных m/z-прыкмет толькі ў некалькіх узорах, мы выкарыстоўваем функцыю «запоўнены пік» пакета R XCMS (для карэкцыі фонавага шуму). Яе варта выкарыстоўваць для замены інтэнсіўнасці «NA» (невыяўлены пік). Пры выкарыстанні функцыі запаўнення піка ў наборы дадзеных усё яшчэ застаецца шмат значэнняў інтэнсіўнасці «0», якія паўплываюць на разлік карэляцыі. Затым мы параўноўваем вынікі апрацоўкі дадзеных, атрыманыя пры выкарыстанні функцыі запаўнення піка і без выкарыстання функцыі запаўнення піка, і разлічваем значэнне фонавага шуму на аснове сярэдняга скарэкціраванага ацэначнага значэння, а затым замяняем гэтыя 0-значныя значэнні інтэнсіўнасці разлічаным значэннем фону. Мы таксама разглядалі толькі тыя прыкметы, інтэнсіўнасць якіх у тры разы перавышала значэнне фону, і лічылі іх «сапраўднымі пікамі». Для разлікаў PCC разглядаюцца толькі m/z-сігналы папярэдніка ўзору (MS1) і фрагмента набораў дадзеных з не менш чым васьмю сапраўднымі пікамі.
Калі інтэнсіўнасць прыкметы якасці папярэдніка ва ўсім узоры значна карэлюе са зніжанай інтэнсіўнасцю той жа прыкметы якасці, якая падвяргаецца нізкай або высокай энергіі сутыкнення, і прыкмета не пазначана CAMERA як ізатопны пік, яе можна далей вызначыць. Затым, шляхам разліку ўсіх магчымых пар папярэднік-прадукт на працягу 3 секунд (арыенціровачнае акно часу ўтрымання піка), праводзіцца карэляцыйны аналіз. Толькі калі значэнне m/z ніжэйшае за значэнне папярэдніка і фрагментацыя MS/MS адбываецца ў тым жа месцы ўзору ў наборы дадзеных, што і папярэднік, з якога ён атрыманы, ён лічыцца фрагментам.
Зыходзячы з гэтых двух простых правілаў, мы выключаем пазначаныя фрагменты са значэннямі m/z, большымі за m/z ідэнтыфікаванага папярэдніка, і на падставе пазіцыі ўзору, дзе з'яўляецца папярэднік, і пазначанага фрагмента. Таксама можна выбраць якасныя характарыстыкі, згенераваныя многімі фрагментамі ў крыніцы, згенераванымі ў рэжыме MS1, у якасці кандыдатаў-папярэднікаў, тым самым ствараючы лішнія злучэнні MS/MS. Каб паменшыць гэтую лішнюю колькасць дадзеных, калі падабенства NDP спектраў перавышае 0,6, і яны належаць да храматаграмы "pcgroup", анатаванай CAMERA, мы аб'яднаем іх. Нарэшце, мы аб'ядноўваем усе чатыры вынікі КЭ, звязаныя з папярэднікам і фрагментамі, у канчатковы дэканвалюваны састаўны спектр, выбіраючы пік найвышэйшай інтэнсіўнасці сярод усіх кандыдатаў-пікаў з аднолькавым значэннем m/z пры розных энергіях сутыкнення. Наступныя этапы апрацоўкі заснаваны на канцэпцыі састаўнога спектру і ўлічваюць розныя ўмовы КЭ, неабходныя для максімізацыі верагоднасці фрагментацыі, паколькі некаторыя фрагменты можна выявіць толькі пры пэўнай энергіі сутыкнення.
Для разліку індуцыбельнасці метабалічнага профілю выкарыстоўваўся RDPI (30). Разнастайнасць метабалічнага спектру (індэкс Hj) вызначаецца з колькасці папярэднікаў MS/MS з выкарыстаннем энтрапіі Шэнана размеркавання частот MS/MS з выкарыстаннем наступнага ўраўнення, апісанага Марцінесам і інш. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), дзе Pij адпавядае адноснай частаце i-й MS/MS у j-й выбарцы (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m)t).
Метабалічная спецыфічнасць (індэкс Si) вызначаецца як ідэнтычнасць экспрэсіі дадзенай MS/MS у залежнасці ад частаты паміж разгляданымі ўзорамі. Спецыфічнасць MS/MS разлічваецца як Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Выкарыстайце наступную формулу для вымярэння спецыфічнага для метабалома індэкса δj кожнага j-га ўзору і сярэдняга значэння спецыфічнасці MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Спектры MS/MS выраўноўваюцца парамі, і падабенства разлічваецца на аснове двух балаў. Спачатку, выкарыстоўваючы стандартны метад NDP (таксама вядомы як метад косінуснай карэляцыі), выкарыстоўвайце наступнае ўраўненне для ацэнкі падабенства сегментаў паміж спектрамі NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, дзе S1 і S2 Адпаведна, для спектру 1 і спектру 2, а таксама WS1, i і WS2, i прадстаўляе вагу, заснаваную на інтэнсіўнасці піка, пры якой розніца i-га агульнага піка паміж двума спектрамі меншая за 0,01 Да. Вага разлічваецца наступным чынам: W = [інтэнсіўнасць піка] m [якасць] n, m = 0,5, n = 2, як прапанавана MassBank.
Быў рэалізаваны другі метад ацэнкі, які ўключаў аналіз агульнай лакальнай літары (NL) паміж MS/MS. Для гэтага мы выкарысталі 52 спісы NL, якія часта сустракаюцца падчас працэсу фрагментацыі MS, разам, і больш спецыфічную NL (файл дадзеных S1), якая раней была анатаваная для спектру MS/MS другасных метабалітаў аслабленых відаў Nepenthes (9, 26). Стварыце бінарны вектар 1 і 0 для кожнай MS/MS, які адпавядае бягучай і адсутнай некаторай NL адпаведна. На падставе падабенства еўклідавай адлегласці, бал падабенства NL разлічваецца для кожнай пары бінарных вектараў NL.
Для выканання двайной кластэрызацыі мы выкарысталі пакет R DiffCoEx, які заснаваны на пашырэнні аналізу ўзважанай геннай суэкспрэсіі (WGCNA). Выкарыстоўваючы матрыцы ацэнкі NDP і NL спектраў MS/MS, мы выкарысталі DiffCoEx для разліку параўнальнай карэляцыйнай матрыцы. Бінарная кластэрызацыя выконваецца шляхам усталявання параметра «cutreeDynamic» у method = «hybrid», cutHeight = 0.9999, deepSplit = T і minClusterSize = 10. Зыходны код R DiffCoEx быў спампаваны з дадатковага файла 1 Тэсанам і інш. (57); Неабходны праграмны пакет R WGCNA можна знайсці па спасылцы https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Для правядзення малекулярнага сеткавага аналізу MS/MS мы разлічылі парную спектральную звязнасць на аснове тыпаў падабенства NDP і NL і выкарысталі праграмнае забеспячэнне Cytoscape для візуалізацыі тапалогіі сеткі з выкарыстаннем арганічнай размяшчэння ў дадатку пашырэння алгарытму размяшчэння CyFilescape yFiles.
Для статыстычнага аналізу дадзеных выкарыстоўвайце R версіі 3.0.1. Статыстычная значнасць ацэньвалася з дапамогай двухфактарнага дысперсійнага аналізу (ANOVA), а затым постфактумнага тэсту Цьюкі на значную розніцу (HSD). Для аналізу розніцы паміж групай траваедных і кантролем двухбаковае размеркаванне дзвюх груп узораў з аднолькавай дысперсіяй было прааналізавана з дапамогай t-крытэрыя Сцьюдэнта.
Дадатковыя матэрыялы да гэтага артыкула можна знайсці па спасылцы http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Гэты артыкул знаходзіцца ў адкрытым доступе і распаўсюджваецца ў адпаведнасці з умовамі ліцэнзіі Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, якая дазваляе выкарыстанне, распаўсюджванне і прайграванне на любым носьбіце, калі канчатковае выкарыстанне не мае камерцыйнай выгады, і перадумовай з'яўляецца правільнасць арыгінальнага твора. Спасылка.
Заўвага: Мы просім вас падаць свой адрас электроннай пошты толькі для таго, каб чалавек, якога вы рэкамендуеце для старонкі, ведаў, што вы хочаце, каб ён бачыў ліст, і што гэта не спам. Мы не будзем фіксаваць ніякіх адрасоў электроннай пошты.
Гэтае пытанне выкарыстоўваецца для праверкі таго, ці з'яўляецеся вы наведвальнікам, і для прадухілення аўтаматычнай рассылкі спаму.
Тэорыя інфармацыі забяспечвае ўніверсальную валюту для параўнання спецыяльных метабаломаў і прагназавання тэорый тэставай абароны.
Тэорыя інфармацыі забяспечвае ўніверсальную валюту для параўнання спецыяльных метабаломаў і прагназавання тэорый тэставай абароны.
©2021 Амерыканская асацыяцыя садзейнічання развіццю навукі. усе правы абаронены. AAAS з'яўляецца партнёрам HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.