Раней мы паведамлялі, што ўзровень у сыроватцы крыві метабаліту трыптафану, які атрымліваецца з кішачніка, індол-3-прапіёнавай кіслаты (IPA), ніжэйшы ў пацыентаў з фіброзам печані. У гэтым даследаванні мы даследавалі транскрыптом і ДНК-метылом у печані з атлусценнем у сувязі з узроўнем IPA ў сыроватцы крыві, а таксама ролю IPA ў індукцыі фенатыпічнай інактывацыі зорчатых клетак печані (HSCs) in vitro.
У даследаванне былі ўключаны 116 пацыентаў з атлусценнем без цукровага дыябету 2 тыпу (ЦД2) (узрост 46,8 ± 9,3 гадоў; ІМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м²), якія перанеслі барыятычную аперацыю ў Цэнтры барыятычнай хірургіі Куопіа (KOBS). Узровень IPA ў крыві вымяраўся з дапамогай вадкаснай храматаграфіі-мас-спектрометрыі (LC-MS), аналіз транскрыптомаў печані праводзіўся шляхам секвенавання агульнай РНК, а аналіз метылявання ДНК праводзіўся з выкарыстаннем Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Для эксперыментаў in vitro выкарыстоўваліся зорчатыя клеткі печані чалавека (LX-2).
Узровень IPA ў сыроватцы крыві карэляваў з экспрэсіяй генаў, якія ўдзельнічаюць у апаптотычных, мітафагічных і даўгавечных шляхах у печані. Ген серын/трэанін кіназы 1 (AKT1) быў найбольш распаўсюджаным і дамінантным генам, які ўзаемадзейнічаў у профілях транскрыптаў печані і метылявання ДНК. Апрацоўка IPA выклікала апаптоз, зніжэнне мітахондрыяльнага дыхання і змяненне марфалогіі клетак і дынамікі мітахондрыял шляхам мадуляцыі экспрэсіі генаў, вядомых рэгуляваннем фіброзу, апаптозу і выжывальнасці клетак LX-2.
Узятыя разам, гэтыя дадзеныя пацвярджаюць, што IPA мае патэнцыйныя тэрапеўтычныя эфекты і можа выклікаць апоптоз і зрушыць фенатып ГСК у неактыўны стан, тым самым пашыраючы магчымасць інгібіравання фіброзу печані, перашкаджаючы актывацыі ГСК і метабалізму мітахондрыял.
Распаўсюджанасць атлусцення і метабалічнага сіндрому асацыюецца з ростам выпадкаў метабалічна звязанай тлушчавай хваробы печані (MASLD); гэта захворванне дзівіць ад 25% да 30% насельніцтва ў цэлым [1]. Асноўным наступствам этыялогіі MASLD з'яўляецца фіброз печані, дынамічны працэс, які характарызуецца пастаянным назапашваннем фіброзна-пазалаціннага матрыкса (ECM) [2]. Асноўнымі клеткамі, якія ўдзельнічаюць у фіброзе печані, з'яўляюцца зорчатыя клеткі печані (HSCs), якія праяўляюць чатыры вядомыя фенатыпы: спакойныя, актываваныя, інактываваныя і старэючыя [3, 4]. HSCs могуць актывавацца і трансдыферэнцыявацца з спакойнай формы ў праліфератыўныя клеткі, падобныя на фібрабласты, з высокімі энергетычнымі патрэбамі, з падвышанай экспрэсіяй α-гладкомышачнага актыну (α-SMA) і калагена I тыпу (Col-I) [5, 6]. Падчас рэверсіі фіброзу печані актываваныя HSCs ліквідуюцца шляхам апоптозу або інактывацыі. Гэтыя працэсы ўключаюць паніжэнне рэгуляцыі фібрагенных генаў і мадуляцыю генаў, якія спрыяюць выжыванню (такіх як сігнальныя шляхі NF-κB і PI3K/Akt) [7, 8], а таксама змены ў дынаміцы і функцыі мітахондрый [9].
Было выяўлена зніжэнне ўзроўню ў сыроватцы крыві метабаліту трыптафану індол-3-прапіёнавай кіслаты (IPA), які выпрацоўваецца ў кішачніку, пры метабалічных захворваннях чалавека, у тым ліку пры MASLD [10–13]. IPA асацыюецца з ужываннем харчовых валокнаў, вядомы сваім антыаксідантным і супрацьзапаленчым дзеяннем і аслабляе фенатып неалкагольнага стэатагепатыту (НАСГ), выкліканага дыетай, in vivo і in vitro [11–14]. Некаторыя доказы паступаюць з нашага папярэдняга даследавання, якое паказала, што ўзровень IPA ў сыроватцы крыві быў ніжэйшы ў пацыентаў з фіброзам печані, чым у пацыентаў з атлусценнем без фіброзу печані ў даследаванні барыятычнай хірургіі ў Куопіа (KOBS). Акрамя таго, мы паказалі, што лячэнне IPA можа знізіць экспрэсію генаў, якія з'яўляюцца класічнымі маркерамі клетачнай адгезіі, міграцыі клетак і актывацыі гематапаэтычных ствалавых клетак у мадэлі зорчатых клетак печані чалавека (LX-2) і з'яўляецца патэнцыйным гепатахоўным метабалітам [15]. Аднак застаецца незразумелым, як IPA выклікае рэгрэсію фіброзу печані, актывуючы апоптоз HSC і мітахондрыяльную біяэнергетыку.
Тут мы паказваем, што сыроватачны IPA асацыюецца з экспрэсіяй генаў, узбагачаных шляхамі апоптозу, мітафагіі і даўгалецця, у печані асоб з атлусценнем, але без дыябету 2 тыпу (KOBS). Акрамя таго, мы выявілі, што IPA можа выклікаць клірэнс і дэградацыю актываваных гематапаэтычных ствалавых клетак (HSCs) праз шлях інактывацыі. Гэтыя вынікі раскрываюць новую ролю IPA, што робіць яго патэнцыйнай тэрапеўтычнай мішэнню для садзейнічання рэгрэсіі фіброзу печані.
Папярэдняе даследаванне ў кагорце KOBS паказала, што ў пацыентаў з фіброзам печані ўзровень IPA ў крыві быў ніжэйшы ў параўнанні з пацыентамі без фіброзу печані [15]. Каб выключыць патэнцыйны ўплыў дыябету 2 тыпу, які можа паўплываць на вынікі даследавання, мы адабралі 116 пацыентаў з атлусценнем без дыябету 2 тыпу (сярэдні ўзрост ± стандартнае адхіленне: 46,8 ± 9,3 года; ІМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (табліца 1) з бягучага даследавання KOBS у якасці даследчай папуляцыі [16]. Усе ўдзельнікі далі пісьмовую інфармаваную згоду, і пратакол даследавання быў зацверджаны Этычным камітэтам акруговай бальніцы Паўночнага Сава ў адпаведнасці з Хельсінкскай дэкларацыяй (54/2005, 104/2008 і 27/2010).
Узоры біяпсіі печані былі атрыманы падчас барыятычнай хірургіі і гісталагічна ацэнены вопытнымі паталагаанатамамі ў адпаведнасці з раней апісанымі крытэрыямі [17, 18]. Крытэрыі ацэнкі падсумаваны ў Дадатковай табліцы S1 і былі апісаны раней [19].
Узоры сыроваткі крыві нашча былі прааналізаваны з дапамогай немэтавага вадкаснага храматаграфавання-мас-спектрометрыі (LC-MS) для метабаломнага аналізу (n = 116). Узоры былі прааналізаваны з выкарыстаннем сістэмы UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Карлсруэ, Германія), як апісана раней19. Ідэнтыфікацыя ізапрапілавага спірту (IPA) была заснавана на часе ўтрымання і параўнанні спектру MS/MS з чыстымі стандартамі. Інтэнсіўнасць сігналу IPA (плошча піка) улічвалася ва ўсіх далейшых аналізах [20].
Секвенаванне РНК печані было праведзена з выкарыстаннем Illumina HiSeq 2500, а дадзеныя былі папярэдне апрацаваны, як апісана раней [19, 21, 22]. Мы правялі мэтанакіраваны дыферэнцыяльны аналіз экспрэсіі транскрыптаў, якія ўплываюць на мітахондрыяльную функцыю/біягенез, выкарыстоўваючы 1957 генаў, адабраных з базы дадзеных MitoMiner 4.0 [23]. Аналіз метылявання ДНК печані быў праведзены з выкарыстаннем Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан-Дыега, Каліфорнія, ЗША) з выкарыстаннем той жа методыкі, што апісана раней [24, 25].
Зорчатыя клеткі печані чалавека (LX-2) былі ласкава прадастаўлены прафесарам Стэфана Рамэа і культываваліся і падтрымліваліся ў асяроддзі DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Для выбару рабочай дозы IPA клеткі LX-2 апрацоўвалі рознымі канцэнтрацыямі IPA (10 мкМ, 100 мкМ і 1 мМ; Sigma, 220027) у асяроддзі DMEM/F12 на працягу 24 гадзін. Акрамя таго, каб даследаваць здольнасць IPA інактываваць HSCs, клеткі LX-2 сумесна апрацоўвалі 5 нг/мл TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) і 1 мМ IPA ў бессыроваткавым асяроддзі на працягу 24 гадзін. Для адпаведных кантрольных узораў з напаўняльнікам для апрацоўкі TGF-β1 выкарыстоўвалі 4 нМ HCl, які змяшчае 0,1% BSA, і 0,05% DMSO для апрацоўкі IPA, і абодва выкарыстоўвалі разам для камбінаванай апрацоўкі.
Апоптоз ацэньвалі з выкарыстаннем набору FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit з 7-AAD (Biolegend, Сан-Дыега, Каліфорнія, ЗША, кат. № 640922) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Карацей кажучы, LX-2 (1 × 105 клетак/лунка) культывавалі на працягу ночы ў 12-лункавых пласцінах, а затым апрацоўвалі некалькімі дозамі IPA або IPA і TGF-β1. На наступны дзень плаваючыя і прымацаваныя клеткі збіралі, трыпсінізавалі, прамывалі PBS, рэсуспендавалі ў буферы для звязвання Анексіну V і інкубавалі з FITC-Annexin V і 7-AAD на працягу 15 хвілін.
Мітахондрыі ў жывых клетках афарбоўвалі на акісляльную актыўнасць з выкарыстаннем Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Каліфорнія). Для аналізу MTR клеткі LX-2 інкубавалі пры аднолькавай шчыльнасці з IPA і TGF-β1. Праз 24 гадзіны жывыя клеткі трыпсінізавалі, прамывалі PBS, а затым інкубавалі са 100 мкМ MTR у бессыроватачным асяроддзі пры тэмпературы 37 °C на працягу 20 хвілін, як апісана раней [26]. Для аналізу марфалогіі жывых клетак памер клетак і цытаплазматычная складанасць аналізавалі з выкарыстаннем параметраў прамога рассейвання (FSC) і бакавога рассейвання (SSC) адпаведна.
Усе дадзеныя (30 000 падзей) былі атрыманы з дапамогай NovoCyte Quanteon (Agilent) і прааналізаваны з дапамогай праграмнага забеспячэння NovoExpress® 1.4.1 або FlowJo V.10.
Хуткасць спажывання кіслароду (OCR) і хуткасць пазаклеткавай падкіслення (ECAR) вымяраліся ў рэжыме рэальнага часу з дапамогай аналізатара патоку пазаклеткавай клеткі Seahorse (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія), абсталяванага прыборам Seahorse XF Cell Mito Stress, у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Карацей кажучы, 2 × 10⁴ клетак LX-2/лунка былі высеяны на пласціны для культуравання клетак XF96. Пасля начной інкубацыі клеткі апрацоўвалі ізапрапанолам (IPA) і TGF-β1 (дадатковыя метады 1). Аналіз дадзеных праводзіўся з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння Seahorse XF Wave, якое ўключае генератар справаздач аб фенатыпе клетачнай энергіі Seahorse XF. Зыходзячы з гэтага, быў разлічаны індэкс біяэнергетычнага здароўя (BHI) [27].
Агульная РНК была транскрыбавана ў кДНК. Канкрэтныя метады гл. у спасылцы [15]. Узроўні мРНК кіслотнага бялку P0 рыбасом 60S чалавека (RPLP0) і цыклафіліну A1 (PPIA) выкарыстоўваліся ў якасці канстытутыўнага кантролю генаў. Выкарыстоўвалася сістэма PCR у рэжыме рэальнага часу QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Ландсмеер, Нідэрланды) з наборам TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) або наборам Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), а адносная кратнасць экспрэсіі генаў разлічвалася з выкарыстаннем параўнальных параметраў цыклавання значэнняў Ct (ΔΔCt) і метаду ∆∆Ct. Падрабязная інфармацыя аб праймерах прыведзена ў дадатковых табліцах S2 і S3.
Ядзерная ДНК (нкДНК) і мітахандрыяльная ДНК (мтДНК) былі выдзелены з выкарыстаннем набору DNeasy blood and tissue kit (Qiagen), як апісана раней [28]. Адносная колькасць мтДНК была разлічана шляхам разліку суадносін кожнага мэтавага рэгіёна мтДНК да сярэдняга геаметрычнага значэння трох рэгіёнаў ядзернай ДНК (мтДНК/нкДНК), як падрабязна апісана ў Дадатковых метадах 2. Падрабязная інфармацыя аб праймерах для мтДНК і нкДНК прыведзена ў Дадатковай табліцы S4.
Жывыя клеткі афарбоўвалі з дапамогай Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Каліфорнія) для візуалізацыі міжклеткавых і ўнутрыклеткавых мітахандрыяльных сетак. Клеткі LX-2 (1 × 10⁴ клетак/лунка) культывавалі на шкляных слайдах у адпаведных шкляных культуральных пласцінах (Ibidi GmbH, Марцінсрыд, Германія). Праз 24 гадзіны жывыя клеткі LX-2 інкубавалі са 100 мкМ MTR на працягу 20 хвілін пры тэмпературы 37 °C, а ядры клетак афарбоўвалі з дапамогай DAPI (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich), як апісана раней [29]. Мітахандрыяльныя сеткі візуалізавалі з дапамогай інвертаванага мікраскопа Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Ена, Германія), абсталяванага канфакальным модулем Zeiss LSM 800, пры тэмпературы 37 °C ва ўвільготненай атмасферы з 5% CO₂ з выкарыстаннем аб'ектыва 63×NA 1.3. Мы атрымалі дзесяць малюнкаў серыі Z для кожнага тыпу ўзору. Кожная Z-серыя змяшчае 30 зрэзаў, кожны з якіх мае таўшчыню 9,86 мкм. Для кожнага ўзору выявы дзесяці розных палёў зроку былі атрыманы з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Ена, Германія), а аналіз марфалогіі мітахондрыял быў праведзены з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння ImageJ (v1.54d) [30, 31] у адпаведнасці з параметрамі, падрабязна апісанымі ў дадатковых метадах 3.
Клеткі фіксавалі 2% глутаральдэгідам у 0,1 М фасфатным буферы, затым фіксавалі 1% растворам чатырохаксіду осмія (Sigma Aldrich, Місуры, ЗША), паступова абязводжвалі ацэтонам (Merck, Дармштадт, Германія) і, нарэшце, залівалі ў эпаксідную смалу. Ультратонкія зрэзы рыхтавалі і афарбоўвалі 1% уранілацэтатам (Merck, Дармштадт, Германія) і 1% цытратам свінцу (Merck, Дармштадт, Германія). Ультраструктурныя выявы атрымлівалі з дапамогай прасвечвальнага электроннага мікраскопа JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Токіо, Японія) пры паскаральным напружанні 80 кВ.
Марфалогія клетак LX-2, апрацаваных IPA на працягу 24 гадзін, была прааналізавана з дапамогай фазава-кантрастнай мікраскапіі пры 50-кратным павелічэнні з выкарыстаннем інвертаванага светлавога мікраскопа Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 і AxioCam MRm, Ена, Германія).
Клінічныя дадзеныя былі выражаны ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне або медыяны (міжквартыльны дыяпазон: IQR). Для параўнання адрозненняў паміж трыма групамі даследавання выкарыстоўваўся аднафактарны дысперсійны аналіз (бесперапынныя зменныя) або χ²-тэст (катэгарыяльныя зменныя). Для карэкцыі множнага тэставання выкарыстоўваўся паказчык ілжыва станоўчых вынікаў (FDR), а гены з FDR < 0,05 лічыліся статыстычна значнымі. Для карэляцыі метылявання ДНК CpG з інтэнсіўнасцю сігналу IPA выкарыстоўваўся карэляцыйны аналіз Спірмена, прычым паведамляліся намінальныя значэнні p (p < 0,05).
Аналіз шляхоў быў праведзены з выкарыстаннем вэб-інструмента аналізу набораў генаў (WebGestalt) для 268 транскрыптаў (намінальнае p < 0,01), 119 транскрыптаў, звязаных з мітахондрыямі (намінальнае p < 0,05) і 4350 CpG з 3093 транскрыптаў печані, якія былі звязаны з узроўнямі IPA ў сыроватцы крыві. Для пошуку перакрываючыхся генаў выкарыстоўваўся свабодна даступны інструмент Venny DB (версія 2.1.0), а для візуалізацыі бялковыя ўзаемадзеянні — StringDB (версія 11.5).
Для эксперыменту LX-2 узоры былі правераны на нармальнасць з выкарыстаннем тэсту Д'Агасціна-Пірсана. Дадзеныя былі атрыманы як мінімум з трох біялагічных паўтораў і падвергнуты аднафактарнаму дысперсійнаму аналізу з дапамогай тэсту Банфероні post hoc. Значэнне p менш за 0,05 лічылася статыстычна значным. Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне, а колькасць эксперыментаў пазначана на кожным малюнку. Усе аналізы і графікі былі выкананы з выкарыстаннем статыстычнага праграмнага забеспячэння GraphPad Prism 8 для Windows (GraphPad Software Inc., версія 8.4.3, Сан-Дыега, ЗША).
Спачатку мы даследавалі сувязь узроўняў IPA ў сыроватцы крыві з транскрыптамі печані, усяго цела і мітахондрыяльных транскрыптаў. У агульным профілі транскрыптаў найбольш моцным генам, звязаным з узроўнямі IPA ў сыроватцы крыві, быў MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; мітоген-актываваная пратэінкіназа-актываваная пратэінкіназа 3); у профілі транскрыптаў, звязаных з мітахондрыямі, найбольш моцным асацыяваным генам быў AKT1 (FDR = 0,7621; AKT серын/трэанін кіназа 1) (Дадатковы файл 1 і Дадатковы файл 2).
Затым мы прааналізавалі глабальныя транскрыпты (n = 268; p < 0,01) і транскрыпты, звязаныя з мітахондрыямі (n = 119; p < 0,05), і ў канчатковым выніку вызначылі апоптоз як найбольш значны кананічны шлях (p = 0,0089). Што тычыцца мітахандрыяльных транскрыптаў, звязаных з узроўнем IPA ў сыроватцы крыві, мы засяродзіліся на апаптозе (FDR = 0,00001), мітафагіі (FDR = 0,00029) і сігнальных шляхах TNF (FDR = 0,000006) (Малюнак 1A, Табліца 2 і Дадатковыя малюнкі 1A-B).
Аналіз перакрыцця глабальных транскрыптаў, звязаных з мітахондрыямі, і метылявання ДНК у печані чалавека ў сувязі з узроўнем IPA ў сыроватцы крыві. А прадстаўляе 268 глабальных транскрыптаў, 119 транскрыптаў, звязаных з мітахондрыямі, і метыляваных ДНК-транскрыптаў, якія супастаўлены з 3092 CpG-сайтамі, звязанымі з узроўнем IPA ў сыроватцы крыві (значэнні p < 0,01 для глабальных транскрыптаў і метыляванай ДНК, а значэнні p < 0,05 для мітахондрычных транскрыптаў). Асноўныя перакрываючыяся транскрыпты паказаны пасярэдзіне (AKT1 і YKT6). B Карта ўзаемадзеяння 13 генаў з найвышэйшым балам узаемадзеяння (0,900) з іншымі генамі была пабудавана з 56 перакрываючыхся генаў (вобласць чорнай лініі), якія былі значна звязаны з узроўнем IPA ў сыроватцы крыві з выкарыстаннем анлайн-інструмента StringDB. Зялёны: Гены, супастаўленыя з клеткавым кампанентам Gene Ontology (GO): мітахондрыі (GO:0005739). AKT1 — гэта бялок з найвышэйшым балам (0,900) па ўзаемадзеянні з іншымі бялкамі, зыходзячы з дадзеных (на аснове тэкставага аналізу, эксперыментаў, баз дадзеных і сумеснай экспрэсіі). Вузлы сеткі прадстаўляюць бялкі, а рэбры — сувязі паміж бялкамі.
Паколькі метабаліты мікрабіёты кішачніка могуць рэгуляваць эпігенетычны склад праз метыляванне ДНК [32], мы даследавалі, ці звязаны ўзровень IPA ў сыроватцы крыві з метыляваннем ДНК печані. Мы выявілі, што два асноўныя сайты метылявання, звязаныя з узроўнем IPA ў сыроватцы крыві, знаходзіліся паблізу багатага на пралін-серын рэгіёна 3 (C19orf55) і малога члена сямейства цеплавога шоку B (HSPB6) (дадатковы файл 3). Метыляванне ДНК 4350 CpG (p < 0,01) карэлявала з узроўнем IPA ў сыроватцы крыві і была ўзбагачана рэгуляторнымі шляхамі даўгалецця (p = 0,006) (малюнак 1A, табліца 2 і дадатковы малюнак 1C).
Каб зразумець біялагічныя механізмы, якія ляжаць у аснове сувязі паміж узроўнямі IPA ў сыроватцы крыві, глабальнымі транскрыптамі, транскрыптамі, звязанымі з мітахондрыямі, і метыляваннем ДНК у печані чалавека, мы правялі аналіз перакрыцця генаў, ідэнтыфікаваных у папярэднім аналізе шляхоў (малюнак 1А). Вынікі аналізу ўзбагачэння шляхоў 56 перакрываючыхся генаў (унутры чорнай лініі на малюнку 1А) паказалі, што шлях апоптозу (p = 0,00029) вылучыў два гены, агульныя для трох аналізаў: AKT1 і YKT6 (гомолаг YKT6 v-SNARE), як паказана на дыяграме Вена (дадатковы малюнак 2 і малюнак 1А). Цікава, што мы выявілі, што AKT1 (cg19831386) і YKT6 (cg24161647) станоўча карэлявалі з узроўнямі IPA ў сыроватцы крыві (дадатковы файл 3). Каб вызначыць патэнцыйныя ўзаемадзеянні бялкоў паміж прадуктамі генаў, мы адабралі 13 генаў з найвышэйшым балам агульнай вобласці (0,900) сярод 56 перакрываючыхся генаў у якасці ўваходных дадзеных і пабудавалі карту ўзаемадзеяння. Згодна з узроўнем даверу (гранічнай даверу), ген AKT1 з найвышэйшым балам (0,900) апынуўся на вяршыні (малюнак 1B).
На падставе аналізу шляхоў мы выявілі, што апоптоз з'яўляецца асноўным шляхам, таму мы даследавалі, ці паўплывае апрацоўка IPA на апоптоз ГСК in vitro. Раней мы паказалі, што розныя дозы IPA (10 мкМ, 100 мкМ і 1 мМ) не таксічныя для клетак LX-2 [15]. Гэта даследаванне паказала, што апрацоўка IPA ў канцэнтрацыях 10 мкМ і 100 мкМ павялічвае колькасць жыццяздольных і некратычных клетак. Аднак, у параўнанні з кантрольнай групай, жыццяздольнасць клетак зніжалася пры канцэнтрацыі IPA 1 мМ, у той час як хуткасць некрозу клетак заставалася нязменнай (малюнак 2A, B). Далей, каб знайсці аптымальную канцэнтрацыю для індукцыі апоптозу ў клетках LX-2, мы пратэставалі IPA 10 мкМ, 100 мкМ і 1 мМ на працягу 24 гадзін (малюнак 2A-E і дадатковы малюнак 3A-B). Цікава, што IPA ў канцэнтрацыі 10 мкМ і 100 мкМ зніжалі частату апоптозу (%), аднак IPA ў канцэнтрацыі 1 мМ павялічваў позні апоптоз і частату апоптозу (%) у параўнанні з кантролем, і таму быў абраны для далейшых эксперыментаў (малюнкі 2A–D).
IPA індукуе апоптоз клетак LX-2. Для колькаснай ацэнкі хуткасці апоптозу і марфалогіі клетак з дапамогай праточнай цытаметрыі выкарыстоўваўся метад падвойнага афарбоўвання анекінам V і 7-AAD. Клеткі BA інкубавалі з 10 мкМ, 100 мкМ і 1 мМ IPA на працягу 24 гадзін або з F–H TGF-β1 (5 нг/мл) і 1 мМ IPA ў бессыроватачным асяроддзі на працягу 24 гадзін. A: жывыя клеткі (Анэксін V -/ 7AAD-); B: некратычныя клеткі (Анэксін V -/ 7AAD+); C, F: раннія (Анэксін V +/ 7AAD-); D, G: познія (Анэксін V+/7AAD.+); E, H: працэнт ад агульнай колькасці ранніх і позніх апоптотычных клетак у хуткасці апоптозу (%). Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± SD, n = 3 незалежныя эксперыменты. Статыстычныя параўнанні праводзіліся з выкарыстаннем аднабаковага ANOVA з тэстам Банфероні post hoc. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Як мы паказалі раней, 5 нг/мл TGF-β1 можа выклікаць актывацыю HSC, павялічваючы экспрэсію класічных маркерных генаў [15]. Клеткі LX-2 апрацоўвалі камбінацыяй 5 нг/мл TGF-β1 і 1 мМ IPA (мал. 2E–H). Апрацоўка TGF-β1 не змяніла частату апоптозу, аднак сумеснае лячэнне IPA павялічыла позні апоптоз і частату апоптозу (%) у параўнанні з апрацоўкай TGF-β1 (мал. 2E–H). Гэтыя вынікі паказваюць, што 1 мМ IPA можа спрыяць апоптозу ў клетках LX-2 незалежна ад індукцыі TGF-β1.
Мы далей даследавалі ўплыў IPA на мітахандрыяльнае дыханне ў клетках LX-2. Вынікі паказалі, што 1 мМ IPA зніжае параметры хуткасці спажывання кіслароду (OCR): немітахандрыяльнае дыханне, базальнае і максімальнае дыханне, уцечку пратонаў і выпрацоўку АТФ у параўнанні з кантрольнай групай (Малюнак 3A, B), у той час як індэкс біяэнергетычнага здароўя (BHI) не змяніўся.
IPA зніжае мітахондрыяльнае дыханне ў клетках LX-2. Крывая мітахондрыяльнага дыхання (OCR) прадстаўлена ў выглядзе параметраў мітахондрыяльнага дыхання (немітахандрыяльнае дыханне, базальнае дыханне, максімальнае дыханне, уцечка пратонаў, генерацыя АТФ, SRC і BHI). Клеткі A і B інкубавалі з 10 мкМ, 100 мкМ і 1 мМ IPA на працягу 24 гадзін адпаведна. Клеткі C і D інкубавалі з TGF-β1 (5 нг/мл) і 1 мМ IPA ў бессыроваткавым асяроддзі на працягу 24 гадзін адпаведна. Усе вымярэнні былі нармалізаваны па ўтрыманні ДНК з выкарыстаннем набору CyQuant. BHI: біяэнергетычны індэкс здароўя; SRC: рэзервовая ёмістасць дыхання; OCR: хуткасць спажывання кіслароду. Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне (SD), n = 5 незалежных эксперыментаў. Статыстычныя параўнанні праводзіліся з выкарыстаннем аднафактарнага ANOVA і post hoc тэсту Банфероні. *p < 0,05; **p < 0,01; і ***p < 0,001
Каб атрымаць больш поўнае разуменне ўплыву IPA на біяэнергетычны профіль клетак LX-2, актываваных TGF-β1, мы прааналізавалі мітахандрыяльнае акісляльнае фасфараляванне з дапамогай OCR (мал. 3C,D). Вынікі паказалі, што лячэнне TGF-β1 можа знізіць максімальнае дыханне, рэзервовую ёмістасць дыхання (SRC) і BHI у параўнанні з кантрольнай групай (мал. 3C,D). Акрамя таго, камбінаванае лячэнне знізіла базальнае дыханне, уцечку пратонаў і выпрацоўку АТФ, але SRC і BHI былі значна вышэйшымі, чым у тых, хто атрымліваў TGF-β1 (мал. 3C,D).
Мы таксама правялі «Тэст фенатыпу клетачнай энергіі», прадстаўлены праграмным забеспячэннем Seahorse (Дадатковы малюнак 4A–D). Як паказана на Дадатковым малюнку 3B, метабалічныя патэнцыялы OCR і ECAR знізіліся пасля лячэння TGF-β1, аднак ніякай розніцы ў групах камбінаванага лячэння і лячэння IPA ў параўнанні з кантрольнай групай не назіралася. Акрамя таго, як базальны, так і стрэсавы ўзроўні OCR знізіліся пасля камбінаванага лячэння і лячэння IPA ў параўнанні з кантрольнай групай (Дадатковы малюнак 4C). Цікава, што падобная карціна назіралася пры камбінаванай тэрапіі, дзе не назіралася змяненняў базальнага і стрэсавага ўзроўняў ECAR у параўнанні з лячэннем TGF-β1 (Дадатковы малюнак 4C). У HSC зніжэнне мітахандрыяльнага акісляльнага фасфаралявання і здольнасць камбінаванага лячэння аднаўляць SCR і BHI пасля ўздзеяння TGF-β1 не змянілі метабалічны патэнцыял (OCR і ECAR). У сукупнасці гэтыя вынікі паказваюць, што IPA можа зніжаць біяэнергетыку ў HSC, што сведчыць аб тым, што IPA можа выклікаць больш нізкі энергетычны профіль, які зрушвае фенатып HSC у бок інактывацыі (Дадатковы малюнак 4D).
Уплыў IPA на дынаміку мітахондрый быў даследаваны з выкарыстаннем трохмернай колькаснай ацэнкі марфалогіі мітахондрый і сеткавых сувязей, а таксама афарбоўвання MTR (малюнак 4 і дадатковы малюнак 5). На малюнку 4 паказана, што ў параўнанні з кантрольнай групай, апрацоўка TGF-β1 знізіла сярэднюю плошчу паверхні, колькасць галін, агульную даўжыню галін і колькасць злучэнняў галін (малюнак 4A і B) і змяніла долю мітахондрый са сферычнай да прамежкавай марфалогіі (малюнак 4C). Толькі апрацоўка IPA знізіла сярэдні аб'ём мітахондрый і змяніла долю мітахондрый са сферычнай да прамежкавай марфалогіі ў параўнанні з кантрольнай групай (малюнак 4A). Наадварот, сферычнасць, сярэдняя даўжыня галін і актыўнасць мітахондрый, ацэненыя з дапамогай MTR, залежнага ад патэнцыялу мітахондрый мембраны (малюнак 4A і E), засталіся нязменнымі, і гэтыя параметры не адрозніваліся паміж групамі. У сукупнасці гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што апрацоўка TGF-β1 і IPA, відаць, мадулюе форму і памер мітахондрый, а таксама складанасць сеткі ў жывых клетках LX-2.
IPA змяняе дынаміку мітахондрый і колькасць мітахондрыйнай ДНК у клетках LX-2. A. Тыповыя канфакальныя выявы жывых клетак LX-2, інкубаваных з TGF-β1 (5 нг/мл) і 1 мМ IPA на працягу 24 гадзін у бессыроватачным асяроддзі, якія паказваюць мітахондрыйныя сеткі, афарбаваныя Mitotracker™ Red CMXRos, і ядры, афарбаваныя ў сіні колер з дапамогай DAPI. Усе дадзеныя ўтрымлівалі не менш за 15 выяваў на групу. Мы атрымалі 10 выяваў Z-стэка для кожнага тыпу ўзору. Кожная паслядоўнасць па восі Z утрымлівала 30 зрэзаў, кожны таўшчынёй 9,86 мкм. Маштабная лінейка: 10 мкм. B. Тыповыя аб'екты (толькі мітахондрыі), ідэнтыфікаваныя шляхам прымянення адаптыўнага парогавага ўстанаўлення да выявы. Колькасны аналіз і параўнанне злучэнняў марфалагічных сетак мітахондрый былі праведзены для ўсіх клетак у кожнай групе. C. Частата суадносін формаў мітахондрый. Значэнні, блізкія да 0, паказваюць сферычныя формы, а значэнні, блізкія да 1, паказваюць ніткападобныя формы. D Змест мітахандрыяльнай ДНК (мтДНК) быў вызначаны, як апісана ў раздзеле "Матэрыялы і метады". Аналіз E Mitotracker™ Red CMXRos быў праведзены метадам праточнай цытаметрыі (30 000 падзей), як апісана ў раздзеле "Матэрыялы і метады". Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне, n = 3 незалежныя эксперыменты. Статыстычныя параўнанні былі праведзены з выкарыстаннем аднафактарнага ANOVA і тэсту Банфероні post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Затым мы прааналізавалі ўтрыманне мтДНК у клетках LX-2 як паказчык колькасці мітахондрыял. У параўнанні з кантрольнай групай, утрыманне мтДНК было павялічана ў групе, якая атрымлівала TGF-β1 (малюнак 4D). У параўнанні з групай, якая атрымлівала TGF-β1, утрыманне мтДНК было зніжана ў групе камбінаванага лячэння (малюнак 4D), што сведчыць аб тым, што IPA можа зніжаць утрыманне мтДНК і, магчыма, колькасць мітахондрыял, а таксама мітахондрыяльнае дыханне (малюнак 3C). Больш за тое, IPA, здавалася, зніжаў утрыманне мтДНК пры камбінаваным лячэнні, але не ўплываў на мітахондрыяльную актыўнасць, апасродкаваную MTR (малюнкі 4A–C).
Мы даследавалі сувязь IPA з узроўнямі мРНК генаў, звязаных з фіброзам, апоптозам, выжывальнасцю і дынамікай мітахондрый у клетках LX-2 (малюнак 5A–D). У параўнанні з кантрольнай групай, у групе, якая атрымлівала TGF-β1, назіралася павышаная экспрэсія такіх генаў, як ланцуг калагена тыпу I α2 (COL1A2), α-гладкомышачны актын (αSMA), матрыксная металапратэіназа 2 (MMP2), тканевы інгібітар металапратэіназы 1 (TIMP1) і ген, падобны да дынаміну 1 (DRP1), што сведчыць аб павелічэнні фіброзу і актывацыі. Акрамя таго, у параўнанні з кантрольнай групай, лячэнне TGF-β1 знізіла ўзровень мРНК ядзернага рэцэптара прэгнану X (PXR), каспазы 8 (CASP8), MAPKAPK3, інгібітара B-клетачнай α, энхансера лёгкага пептыду гена ядзернага фактара κ (NFκB1A) і інгібітара субадзінкі кіназы ядзернага фактара κB β (IKBKB) (малюнак 5A–D). У параўнанні з лячэннем TGF-β1, камбінаванае лячэнне TGF-β1 і IPA знізіла экспрэсію COL1A2 і MMP2, але павялічыла ўзровень мРНК PXR, TIMP1, В-клетачнай лімфомы-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β і IKBKB. Лячэнне IPA значна знізіла экспрэсію MMP2, бялку X, асацыяванага з Bcl-2 (BAX), AKT1, бялку аптычнай атрафіі 1 (OPA1) і мітахондрыяльнага зліцця 2 (MFN2), у той час як экспрэсія CASP8, NFκB1A, NFκB1B і IKBKB павялічылася ў параўнанні з кантрольнай групай. Аднак не было выяўлена ніякай розніцы ў экспрэсіі каспазы-3 (CASP3), фактару актывацыі апаптатычнай пептыдазы 1 (APAF1), мітахондрыяльнага зліцця 1 (MFN1) і бялку дзялення 1 (FIS1). У сукупнасці гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што лячэнне IPA мадулюе экспрэсію генаў, звязаных з фіброзам, апоптозам, выжывальнасцю і дынамікай мітахондрый. Нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што лячэнне IPA зніжае фіброз у клетках LX-2; у той жа час яно стымулюе выжывальнасць, зрушваючы фенатып у бок інактывацыі.
IPA мадулюе экспрэсію фібрабластаў, апаптозу, жыццяздольнасці і мітахондрыяльнай дынамікі генаў у клетках LX-2. Гістаграмы паказваюць экспрэсію мРНК адносна эндагеннага кантролю (RPLP0 або PPIA) пасля індукцыі клетак LX-2 з дапамогай TGF-β1 і IPA ў бессыроватачным асяроддзі на працягу 24 гадзін. A азначае фібрабласты, B азначае апаптотычныя клеткі, C азначае клеткі, якія выжылі, а D азначае экспрэсію генаў мітахондрыяльнай дынамікі. Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне (SD), n = 3 незалежныя эксперыменты. Статыстычныя параўнанні праводзіліся з выкарыстаннем аднафактарнага ANOVA і тэсту Банфероні post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Затым змены памеру клетак (FSC-H) і цытаплазматычнай складанасці (SSC-H) ацэньваліся з дапамогай праточнай цытаметрыі (малюнак 6A,B), а змены марфалогіі клетак пасля апрацоўкі IPA ацэньваліся з дапамогай прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (TEM) і фазава-кантрастнай мікраскапіі (дадатковы малюнак 6A-B). Як і чакалася, клеткі ў групе, якая атрымлівала TGF-β1, павялічыліся ў памеры ў параўнанні з кантрольнай групай (малюнак 6A,B), дэманструючы класічнае пашырэнне шурпатага эндаплазматычнага рэтыкулума (ER*) і фагалізасом (P), што сведчыць аб актывацыі гематапаэтычных ствалавых клетак (HSC) (дадатковы малюнак 6A). Аднак, у параўнанні з групай, якая атрымлівала TGF-β1, памер клетак, цытаплазматычная складанасць (мал. 6A,B) і ўтрыманне ER* знізіліся ў групе камбінаванага лячэння TGF-β1 і IPA (дадатковы малюнак 6A). Акрамя таго, апрацоўка IPA знізіла памер клетак, цытаплазматычную складанасць (мал. 6A,B), утрыманне P і ER* (дадатковы малюнак 6A) у параўнанні з кантрольнай групай. Акрамя таго, колькасць апаптотычных клетак павялічылася праз 24 гадзіны апрацоўкі IPA ў параўнанні з кантрольнай групай (белыя стрэлкі, дадатковы мал. 6B). У цэлым, гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што 1 мМ IPA можа стымуляваць апаптоз ГСК і звярнуць назад змены марфалагічных параметраў клетак, выкліканыя TGF-β1, тым самым рэгулюючы памер і складанасць клетак, што можа быць звязана з інактывацыяй ГСК.
IPA змяняе памер клетак і цытаплазматычную складанасць у клетках LX-2. Тыповыя выявы аналізу праточнай цытаметрыі. У аналізе выкарыстоўвалася стратэгія гейтынгу, спецыфічная для клетак LX-2: SSC-A/FSC-A для вызначэння папуляцыі клетак, FSC-H/FSC-A для ідэнтыфікацыі дублетаў і SSC-H/FSC-H для аналізу памеру і складанасці клетак. Клеткі інкубавалі з TGF-β1 (5 нг/мл) і 1 мМ IPA ў бессыроваткавым асяроддзі на працягу 24 гадзін. Клеткі LX-2 размеркавалі ў ніжні левы квадрант (SSC-H-/FSC-H-), верхні левы квадрант (SSC-H+/FSC-H-), ніжні правы квадрант (SSC-H-/FSC-H+) і верхні правы квадрант (SSC-H+/FSC-H+) для аналізу памеру клетак і цытаплазматычнай складанасці. B. Марфалогія клетак аналізавалася метадам праточнай цытаметрыі з выкарыстаннем FSC-H (прамое рассейванне, памер клетак) і SSC-H (бакавае рассейванне, цытаплазматычная складанасць) (30 000 падзей). Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± SD, n = 3 незалежныя эксперыменты. Статыстычныя параўнанні праводзіліся з выкарыстаннем аднафактарнага ANOVA і post hoc тэсту Банфероні. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 і ****p < 0,0001
Метабаліты кішачніка, такія як IPA, сталі актуальнай тэмай даследаванняў, што сведчыць аб магчымасці выяўлення новых мішэняў у мікрабіёце кішачніка. Таму цікава, што IPA, метабаліт, які мы звязалі з фіброзам печані ў людзей [15], быў паказаны як патэнцыйны антыфіброзны прэпарат у жывёльных мадэлях [13, 14]. Тут мы ўпершыню дэманструем сувязь паміж сыроватачным IPA і глабальнай транскрыптамікай печані і метыляваннем ДНК у людзей з атлусценнем без дыябету 2 тыпу (ЦД2), падкрэсліваючы апоптоз, мітафагію і працягласць жыцця, а таксама магчымы ген-кандыдат AKT1, які рэгулюе гамеастаз печані. Яшчэ адной навізной нашага даследавання з'яўляецца тое, што мы прадэманстравалі ўзаемадзеянне лячэння IPA з апоптозам, марфалогіяй клетак, мітахондрыяльнай біяэнергетыкай і дынамікай у клетках LX-2, што сведчыць аб больш нізкім энергетычным спектры, які зрушвае фенатып HSC у бок інактывацыі, што робіць IPA патэнцыйным кандыдатам для паляпшэння фіброзу печані.
Мы выявілі, што апоптоз, мітафагія і даўгалецце былі найважнейшымі кананічнымі шляхамі, узбагачанымі генамі печані, звязанымі з цыркулюючым сыроватачным IPA. Парушэнне сістэмы кантролю якасці мітахондрыялаў (MQC) можа прывесці да мітахондрыяльнай дысфункцыі, мітафагіі і апоптозу, тым самым спрыяючы ўзнікненню MASLD [33, 34]. Такім чынам, мы можам выказаць здагадку, што IPA можа быць уцягнуты ў падтрыманне дынамікі клетак і цэласнасці мітахондрыялаў праз апоптоз, мітафагію і даўгалецце ў печані. Нашы дадзеныя паказалі, што два гены былі агульнымі ва ўсіх трох аналізах: YKT6 і AKT1. Варта адзначыць, што YKT6 - гэта бялок SNARE, які ўдзельнічае ў працэсе зліцця клеткавых мембран. Ён гуляе ролю ў аўтафагіі і мітафагіі, утвараючы ініцыяцыйны комплекс з STX17 і SNAP29 на аўтафагасоме, тым самым спрыяючы зліццю аўтафагасом і лізасом [35]. Акрамя таго, страта функцыі YKT6 прыводзіць да парушэння мітафагіі [36], у той час як павышэнне рэгуляцыі YKT6 звязана з прагрэсаваннем гепатацэлюлярнай карцыномы (HCC), што паказвае павышаную выжывальнасць клетак [37]. З іншага боку, AKT1 з'яўляецца найважнейшым узаемадзейным генам і адыгрывае важную ролю ў захворваннях печані, у тым ліку ў сігнальным шляху PI3K/AKT, клеткавым цыкле, міграцыі клетак, праліферацыі, факальнай адгезіі, мітахондрыяльнай функцыі і сакрэцыі калагена [38–40]. Актываваны сігнальны шлях PI3K/AKT можа актываваць гематапаэтычныя ствалавыя клеткі (HSCs), якія з'яўляюцца клеткамі, адказнымі за выпрацоўку пазаклеткавага матрыкса (ECM), і яго парушэнне рэгуляцыі можа спрыяць узнікненню і прагрэсаванню фіброзу печані [40]. Акрамя таго, AKT з'яўляецца адным з ключавых фактараў выжывання клетак, які інгібіруе p53-залежны апоптоз клетак, і актывацыя AKT можа быць звязана з інгібіраваннем апоптозу клетак печані [41, 42]. Атрыманыя вынікі сведчаць аб тым, што IPA можа быць уцягнуты ў апоптоз, звязаны з мітахондрыямі печані, уплываючы на ​​рашэнне гепатацытаў паміж уваходам у апоптоз або выжываннем. Гэтыя эфекты могуць рэгулявацца генамі-кандыдатамі AKT і/або YKT6, якія маюць вырашальнае значэнне для гамеастазу печані.
Нашы вынікі паказалі, што 1 мМ IPA выклікаў апоптоз і зніжэнне мітахондрыяльнага дыхання ў клетках LX-2 незалежна ад лячэння TGF-β1. Варта адзначыць, што апоптоз з'яўляецца асноўным шляхам для вырашэння фіброзу і актывацыі гематапаэтычных ствалавых клетак (HSC), а таксама з'яўляецца ключавой падзеяй у зварачальнай фізіялагічнай рэакцыі на фіброз печані [4, 43]. Больш за тое, аднаўленне BHI ў клетках LX-2 пасля камбінаванага лячэння дало новае разуменне патэнцыйнай ролі IPA ў рэгуляцыі мітахондрыяльнай біяэнергетыкі. У стане спакою і неактыўнасці гематапаэтычныя клеткі звычайна выкарыстоўваюць мітахондрыяльнае акісляльнае фасфараляванне для выпрацоўкі АТФ і маюць нізкую метабалічную актыўнасць. З іншага боку, актывацыя HSC ўзмацняе мітахондрыяльнае дыханне і біясінтэз, каб кампенсаваць энергетычныя патрэбы ўваходу ў глікалітычны стан [44]. Той факт, што IPA не паўплываў на метабалічны патэнцыял і ECAR, сведчыць аб тым, што глікалітычны шлях мае меншы прыярытэт. Падобным чынам, іншае даследаванне паказала, што 1 мМ IPA здольны мадуляваць актыўнасць мітахондрыяльнага дыхальнага ланцуга ў кардыяміяцытах, клетачнай лініі гепатацытаў чалавека (Huh7) і эндатэліяльных клетках пупавіннай вены чалавека (HUVEC); Аднак уплыў IPA на гліколіз у кардыяміяцытах не выяўлены, што сведчыць аб тым, што IPA можа ўплываць на біяэнергетыку іншых тыпаў клетак [45]. Такім чынам, мы мяркуем, што 1 мМ IPA можа дзейнічаць як мяккі хімічны раз'яднальнік, паколькі ён можа значна знізіць экспрэсію генаў фібрагенезу, марфалогію клетак і мітахондрыяльную біяэнергетыку без змены колькасці мтДНК [46]. Мітахондрыяльныя раз'яднальнікі могуць інгібіраваць індукаваны культурай фіброз і актывацыю ГСК [47], а таксама зніжаць выпрацоўку мітахондрыяльнага АТФ, рэгуляваную або індукаваную пэўнымі бялкамі, такімі як раз'яднальныя бялкі (UCP) або адэнін-нуклеатыдная транслаказа (ANT). У залежнасці ад тыпу клетак гэтая з'ява можа абараняць клеткі ад апоптозу і/або спрыяць апоптозу [46]. Аднак неабходныя далейшыя даследаванні, каб высветліць ролю IPA як мітахондрыяльнага раз'яднальніка ў інактывацыі гематапаэтычных ствалавых клетак.
Затым мы даследавалі, ці адлюстроўваюцца змены ў мітахондрыяльным дыханні на марфалогіі мітахондрыял у жывых клетках LX-2. Цікава, што лячэнне TGF-β1 змяняе прапорцыю мітахондрыял са сферычнай на прамежкавую, са зніжэннем галінавання мітахондрыял і павелічэннем экспрэсіі DRP1, ключавога фактару ў мітахондрыяльным дзяленні [48]. Акрамя таго, фрагментацыя мітахондрыял звязана з агульнай складанасцю сеткі, і пераход ад зліцця да дзялення мае вырашальнае значэнне для актывацыі гематапаэтычных ствалавых клетак (ГСК), тады як інгібіраванне мітахондрыяльнага дзялення прыводзіць да апоптозу ГСК [49]. Такім чынам, нашы вынікі паказваюць, што лячэнне TGF-β1 можа выклікаць зніжэнне складанасці мітахондрыяльнай сеткі са зніжэннем галінавання, што часцей сустракаецца пры мітахондрыяльным дзяленні, звязаным з актываванымі гематапаэтычнымі ствалавымі клеткамі (ГСК). Акрамя таго, нашы дадзеныя паказалі, што IPA можа змяніць прапорцыю мітахондрыял са сферычнай на прамежкавую форму, тым самым зніжаючы экспрэсію OPA1 і MFN2. Даследаванні паказалі, што паніжэнне рэгуляцыі OPA1 можа выклікаць зніжэнне патэнцыялу мітахондрыяльнай мембраны і справакаваць апоптоз клетак [50]. Вядома, што MFN2 апасродкуе зліццё мітахондрыял і апоптоз [51]. Атрыманыя вынікі сведчаць аб тым, што індукцыя клетак LX-2 з дапамогай TGF-β1 і/або IPA, відаць, мадулюе форму і памер мітахондрый, а таксама стан актывацыі і складанасць сеткі.
Нашы вынікі паказваюць, што камбінаванае лячэнне TGFβ-1 і IPA можа знізіць мтДНК і марфалагічныя параметры клетак шляхам рэгулявання экспрэсіі мРНК генаў фіброзу, апоптозу і выжывання ў клетках, якія пазбягаюць апоптозу. Сапраўды, IPA знізіў узровень экспрэсіі мРНК AKT1 і важных генаў фіброзу, такіх як COL1A2 і MMP2, але павялічыў узровень экспрэсіі CASP8, які асацыюецца з апоптозам. Нашы вынікі паказалі, што пасля лячэння IPA экспрэсія BAX знізілася, а экспрэсія мРНК субадзінак сямейства TIMP1, BCL-2 і NF-κB павялічылася, што сведчыць аб тым, што IPA можа стымуляваць сігналы выжывання ў гематапаэтычных ствалавых клетках (HSCs), якія пазбягаюць апоптозу. Гэтыя малекулы могуць выступаць у якасці сігналаў выжывання ў актываваных гематапаэтычных ствалавых клетках, што можа быць звязана з павышанай экспрэсіяй антыапаптатычных бялкоў (такіх як Bcl-2), зніжэннем экспрэсіі праапаптатычнага BAX і складаным узаемадзеяннем паміж TIMP і NF-κB [5, 7]. IPA аказвае свой уплыў праз PXR, і мы выявілі, што камбінаванае лячэнне TGF-β1 і IPA павялічвае ўзровень экспрэсіі мРНК PXR, што сведчыць аб падаўленні актывацыі HSC. Вядома, што актываваная сігналізацыя PXR інгібіруе актывацыю HSC як in vivo, так і in vitro [52, 53]. Нашы вынікі паказваюць, што IPA можа ўдзельнічаць у клірэнсе актываваных HSC, спрыяючы апоптозу, зніжаючы фіброз і метабалізм мітахондрыял, а таксама ўзмацняючы сігналы выжывання, якія з'яўляюцца тыповымі працэсамі, што пераўтвараюць актываваны фенатып HSC у інактываваны. Іншым магчымым тлумачэннем патэнцыйнага механізму і ролі IPA ў апоптозе з'яўляецца тое, што ён ачышчае дысфункцыянальныя мітахондрыі ў асноўным праз мітафагію (унутраны шлях) і знешні сігнальны шлях TNF (табліца 1), які непасрэдна звязаны з сігнальным шляхам выжывання NF-κB (дадатковы малюнак 7). Цікава, што гены, узбагачаныя IPA, здольныя індукаваць праапаптотычныя і правыжывальныя сігналы ў апоптотычным шляху [54], што сведчыць аб тым, што IPA можа індукаваць апоптотычны шлях або выжыванне, узаемадзейнічаючы з гэтымі генамі. Аднак, як IPA індукуе апоптоз або выжыванне падчас актывацыі HSC і яго механістычныя шляхі застаюцца незразумелымі.
IPA — гэта мікробны метабаліт, які ўтвараецца з харчовага трыптафану праз мікрабіёту кішачніка. Даследаванні паказалі, што ён валодае супрацьзапаленчымі, антыаксідантнымі і эпігенетычнымі рэгуляторнымі ўласцівасцямі ў кішачным асяроддзі.[55] Даследаванні паказалі, што IPA можа мадуляваць функцыю кішачнага бар'ера і зніжаць акісляльны стрэс, што можа спрыяць яго лакальным фізіялагічным эфектам.[56] Фактычна, IPA транспартуецца да органаў-мішэняў праз кровазварот, і паколькі IPA мае падобную структуру асноўнага метабаліту з трыптафанам, сератанінам і вытворнымі індолу, IPA аказвае метабалічнае дзеянне, што прыводзіць да канкурэнтнага метабалічнага лёсу.[52] IPA можа канкураваць з метабалітамі, атрыманымі з трыптафану, за месцы звязвання на ферментах або рэцэптарах, патэнцыйна парушаючы нармальныя метабалічныя шляхі. Гэта падкрэслівае неабходнасць далейшых даследаванняў яго фармакокінетыкі і фармакадынамікі, каб лепш зразумець яго тэрапеўтычнае акно.[57] Застаецца высветліць, ці можа гэта таксама адбывацца ў гематапаэтычных ствалавых клетках (ГСК).
Мы прызнаем, што наша даследаванне мае некаторыя абмежаванні. Каб спецыяльна вывучыць асацыяцыі, звязаныя з IPA, мы выключылі пацыентаў з цукровым дыябетам 2 тыпу (ЦД2). Мы прызнаем, што гэта абмяжоўвае шырокую прымянімасць нашых высноў да пацыентаў з цукровым дыябетам 2 тыпу і запушчанымі захворваннямі печані. Нягледзячы на ​​тое, што фізіялагічная канцэнтрацыя IPA ў сыроватцы крыві чалавека складае 1–10 мкМ [11, 20], канцэнтрацыя 1 мМ IPA была выбрана зыходзячы з найвышэйшай нетаксічнай канцэнтрацыі [15] і найвышэйшай хуткасці апоптозу, без розніцы ў працэнтнай долі папуляцыі некратычных клетак. Нягледзячы на ​​тое, што ў гэтым даследаванні выкарыстоўваліся супрафізіялагічныя ўзроўні IPA, у цяперашні час няма адзінага меркавання адносна эфектыўнай дозы IPA [52]. Нягледзячы на ​​тое, што нашы вынікі значныя, больш шырокі метабалічны лёс IPA застаецца актыўнай вобласцю даследаванняў. Больш за тое, нашы высновы аб сувязі паміж узроўнем IPA ў сыроватцы і метыляваннем ДНК транскрыптаў печані былі атрыманы не толькі з гематапаэтычных ствалавых клетак (ГСК), але і з тканін печані. Мы вырашылі выкарыстоўваць чалавечыя клеткі LX-2, грунтуючыся на нашых папярэдніх высновах, атрыманых у выніку аналізу транскрыптомаў, што IPA асацыюецца з актывацыяй гематапаэтычных ствалавых клетак (ГСК) [15], і ГСК з'яўляюцца асноўнымі клеткамі, якія ўдзельнічаюць у прагрэсаванні фіброзу печані. Печань складаецца з некалькіх тыпаў клетак, таму для вывучэння ролі IPA і яго ўзаемадзеяння з іншымі тыпамі клетак печані варта разгледзець іншыя мадэлі клетак, такія як сістэма сумеснага культывавання гепатацытаў-ГСК-імунных клетак у спалучэнні з актывацыяй каспазы і фрагментацыяй ДНК, а таксама механізм дзеяння, уключаючы ўзровень бялку.