Дзякуй за наведванне сайта nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць апошнюю версію браўзера (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Акрамя таго, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, гэты сайт не будзе ўтрымліваць стылі або JavaScript.
Серавадарод (H2S) аказвае мноства фізіялагічных і паталагічных эфектаў на арганізм чалавека. Гідрасульфід натрыю (NaHS) шырока выкарыстоўваецца ў якасці фармакалагічнага інструмента для ацэнкі ўздзеяння H2S у біялагічных эксперыментах. Нягледзячы на ​​тое, што страта H2S з раствораў NaHS займае ўсяго некалькі хвілін, растворы NaHS выкарыстоўваліся ў якасці донарных злучэнняў для H2S у пітной вадзе ў некаторых даследаваннях на жывёлах. У гэтым даследаванні вывучалася, ці можа пітная вада з канцэнтрацыяй NaHS 30 мкМ, прыгатаваная ў бутэльках для пацукоў/мышэй, заставацца стабільнай на працягу прынамсі 12-24 гадзін, як прапанавалі некаторыя аўтары. Прыгатуйце раствор NaHS (30 мкМ) у пітной вадзе і неадкладна разліце яго ў бутэлькі для вады для пацукоў/мышэй. Узоры збіралі з кончыка і ўнутранай часткі бутэлькі для вады праз 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 і 24 гадзіны для вымярэння ўтрымання сульфіду метадам метиленового сіняга. Акрамя таго, самцам і самак пацукоў на працягу двух тыдняў уводзілі NaHS (30 мкМ), а канцэнтрацыю сульфіду ў сыроватцы крыві вымяралі праз дзень на працягу першага тыдня і ў канцы другога тыдня. Раствор NaHS ва ўзоры, атрыманым з кончыка бутэлькі з вадой, быў нестабільным; ён знізіўся на 72% і 75% праз 12 і 24 гадзіны адпаведна. У ўзорах, атрыманых з унутранай часткі бутэлек з вадой, зніжэнне NaHS не было значным на працягу 2 гадзін; аднак яно знізілася на 47% і 72% праз 12 і 24 гадзіны адпаведна. Ін'екцыя NaHS не паўплывала на ўзровень сульфіду ў сыроватцы крыві самцоў і самак пацукоў. У заключэнне, растворы NaHS, прыгатаваныя з пітной вады, не павінны выкарыстоўвацца для здачы H2S, паколькі раствор нестабільны. Гэты шлях увядзення прывядзе да таго, што жывёлы будуць падвяргацца нерэгулярнаму і меншаму, чым чакалася, уздзеянню колькасцяў NaHS.
Серавадарод (H2S) выкарыстоўваецца ў якасці таксіну з 1700 года; аднак яго магчымая роля як эндагеннай біясігнальнай малекулы была апісана Абэ і Кімурай у 1996 годзе. За апошнія тры дзесяцігоддзі былі высветлены шматлікія функцыі H2S у розных сістэмах чалавека, што прывяло да разумення таго, што малекулы-донары H2S могуць мець клінічнае прымяненне ў лячэнні або кантролі некаторых захворванняў; гл. нядаўні агляд у Чырына і інш.
Гідрасульфід натрыю (NaHS) шырока выкарыстоўваецца ў якасці фармакалагічнага інструмента для ацэнкі эфектаў H2S у многіх даследаваннях на клеткавых культурах і жывёлах5,6,7,8. Аднак NaHS не з'яўляецца ідэальным донарам H2S, паколькі ён хутка пераўтвараецца ў H2S/HS- у растворы, лёгка забруджваецца полісульфідамі, лёгка акісляецца і выпараецца4,9. У многіх біялагічных эксперыментах NaHS раствараецца ў вадзе, што прыводзіць да пасіўнага выпарання і страты H2S10,11,12, спантаннага акіслення H2S11,12,13 і фоталізу14. Сульфід у зыходным растворы вельмі хутка губляецца з-за выпарання H2S11. У адкрытым кантэйнеры перыяд паўраспаду (t1/2) H2S складае каля 5 хвілін, а яго канцэнтрацыя памяншаецца прыкладна на 13% у хвіліну10. Нягледзячы на ​​тое, што страта серавадароду з раствораў NaHS займае ўсяго некалькі хвілін, у некаторых даследаваннях на жывёлах растворы NaHS выкарыстоўваліся ў якасці крыніцы серавадароду ў пітной вадзе на працягу 1–21 тыдня, замяняючы раствор, які змяшчае NaHS, кожныя 12–24 гадзіны.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Такая практыка не адпавядае прынцыпам навуковых даследаванняў, паколькі дазоўкі лекаў павінны грунтавацца на іх ужыванні ў іншых відаў, асабліва ў людзей.27
Даклінічныя даследаванні ў біямедыцыне накіраваны на паляпшэнне якасці догляду за пацыентамі або вынікаў лячэння. Аднак вынікі большасці даследаванняў на жывёлах пакуль не былі перанесены на людзей28,29,30. Адной з прычын гэтай няўдачы ў трансляцыі з'яўляецца адсутнасць увагі да метадалагічнай якасці даследаванняў на жывёлах30. Такім чынам, мэтай гэтага даследавання было высветліць, ці могуць 30 мкМ растворы NaHS, прыгатаваныя ў бутэльках для вады для пацукоў/мышэй, заставацца стабільнымі ў пітной вадзе на працягу 12-24 гадзін, як сцвярджаецца або прапануецца ў некаторых даследаваннях.
Усе эксперыменты ў гэтым даследаванні былі праведзены ў адпаведнасці з апублікаванымі ў Іране рэкамендацыямі па доглядзе і выкарыстанні лабараторных жывёл31. Усе эксперыментальныя справаздачы ў гэтым даследаванні таксама адпавядалі рэкамендацыям ARRIVE32. Камітэт па этыцы Інстытута эндакрынных навук Медыцынскага ўніверсітэта імя Шахіда Бехешці ўхваліў усе эксперыментальныя працэдуры ў гэтым даследаванні.
Дыгідрат ацэтату цынку (CAS: 5970-45-6) і бязводны хларыд жалеза (CAS: 7705-08-0) былі набыты ў Biochem, Chemopahrama (Косн-сюр-Луар, Францыя). Гідрасульфід натрыю гідрат (CAS: 207683-19-0) і N,N-дыметыл-п-фенілендыямін (DMPD) (CAS: 535-47-0) былі набыты ў Sigma-Aldrich (Сэнт-Луіс, штат Місуры, ЗША). Ізафлуран быў набыты ў Piramal (Бэтлеем, штат Пенсільванія, ЗША). Саляная кіслата (HCl) была набыта ў Merck (Дармштадт, Германія).
Прыгатуйце раствор NaHS (30 мкМ) у пітной вадзе і адразу ж наліце ​​яго ў бутэлькі з вадой для пацукоў/мышэй. Гэтая канцэнтрацыя была выбрана на аснове шматлікіх публікацый, дзе NaHS выкарыстоўваўся ў якасці крыніцы H2S; гл. раздзел «Абмеркаванне». NaHS — гэта гідратаваная малекула, якая можа ўтрымліваць розную колькасць гідратнай вады (г.зн. NaHS•xH2O); паводле звестак вытворцы, працэнт NaHS, які выкарыстоўваўся ў нашым даследаванні, склаў 70,7% (г.зн. NaHS•1,3 H2O), і мы ўлічылі гэта значэнне ў нашых разліках, дзе выкарыстоўвалі малекулярную масу 56,06 г/моль, якая з'яўляецца малекулярнай масай бязводнага NaHS. Гідратацыйная вада (таксама званая крышталізацыйнай вадой) — гэта малекулы вады, якія складаюць крышталічную структуру33. Гідраты маюць розныя фізічныя і тэрмадынамічныя ўласцівасці ў параўнанні з ангідратамі34.
Перад даданнем NaHS у пітную ваду вымерайце pH і тэмпературу растваральніка. Неадкладна пераліце ​​раствор NaHS у бутэльку з вадой для пацукоў/мышэй у клетцы жывёл. Узоры збіралі з кончыка і знутры бутэлькі праз 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 і 24 гадзіны для вымярэння ўтрымання сульфідаў. Вымярэнні сульфідаў праводзіліся адразу пасля кожнага адбору проб. Мы атрымлівалі ўзоры з кончыка прабіркі, таму што некаторыя даследаванні паказалі, што малы памер пор вадзяной прабіркі можа мінімізаваць выпарэнне H2S15,19. Гэтая праблема, відаць, датычыцца і раствора ў бутэльцы. Аднак гэта не тычылася раствора ў горлышку бутэлькі, які меў больш высокую хуткасць выпарэння і аўтаакісляўся; на самой справе, жывёлы спачатку пілі гэтую ваду.
У даследаванні выкарыстоўваліся самцы і самкі пацукоў Вістар. Пацукоў утрымлівалі ў поліпрапіленавых клетках (2–3 пацукі ў клетцы) у стандартных умовах (тэмпература 21–26 °C, вільготнасць 32–40%) з 12 гадзінамі святла (з 7 раніцы да 7 вечара) і 12 гадзінамі цемры (з 19 вечара да 7 раніцы). Пацукі мелі свабодны доступ да вадаправоднай вады і атрымлівалі стандартны корм (Khorak Dam Pars Company, Тэгеран, Іран). Пацукі Вістар, якія былі падабраныя па ўзросце (6 месяцаў), самкі (n = 10, маса цела: 190–230 г) і самцы (n = 10, маса цела: 320–370 г) былі выпадковым чынам падзелены на кантрольную групу і групу, якая атрымлівала NaHS (30 мкМ) (n = 5 у групе). Для вызначэння памеру выбаркі мы выкарыстоўвалі падыход KISS (Keep It Simple, Stupid), які спалучае папярэдні вопыт і аналіз магутнасці35. Спачатку мы правялі пілотнае даследаванне на 3 пацуках і вызначылі сярэдні ўзровень агульнага сульфіду ў сыроватцы крыві і стандартнае адхіленне (8,1 ± 0,81 мкМ). Затым, улічваючы магутнасць 80% і прымаючы двухбаковы ўзровень значнасці 5%, мы вызначылі папярэдні памер выбаркі (n = 5 на аснове папярэдняй літаратуры), які адпавядаў стандартызаванаму памеру эфекту 2,02 з загадзя вызначаным значэннем, прапанаваным Фесцінгам для разліку памеру выбаркі эксперыментальных жывёл35. Пасля памнажэння гэтага значэння на стандартнае адхіленне (2,02 × 0,81) прагназаваны памер выяўляемага эфекту (1,6 мкМ) склаў 20%, што з'яўляецца прымальным. Гэта азначае, што n = 5/група дастаткова для выяўлення 20% сярэдняга змянення паміж групамі. Пацукі былі выпадковым чынам падзелены на кантрольную групу і групу, якая атрымлівала NaSH, з выкарыстаннем выпадковай функцыі праграмнага забеспячэння Excel36 (Дадатковы малюнак 1). Асляпленне праводзілася на ўзроўні вынікаў, і даследчыкі, якія выконвалі біяхімічныя вымярэнні, не ведалі аб размеркаванні па групах.
Групы пацукоў абодвух полаў, якія атрымлівалі NaHS, атрымлівалі 30 мкМ раствор NaHS, прыгатаваны ў пітной вадзе, на працягу 2 тыдняў; свежы раствор падавалі кожныя 24 гадзіны, на працягу якіх вымяралі масу цела. Узоры крыві збіралі з кончыкаў хвастоў усіх пацукоў пад ізафлуранавай анестэзіяй праз дзень у канцы першага і другога тыдняў. Узоры крыві цэнтрыфугавалі пры 3000 g на працягу 10 хвілін, сыроватку аддзялялі і захоўвалі пры тэмпературы -80°C для наступнага вымярэння мачавіны, крэатыніну (Cr) і агульнага сульфіду ў сыроватцы. Мачавіну сыроваткі вызначалі ферментатыўным урэазным метадам, а крэатынін сыроваткі — фотаметрычным метадам Яффе з выкарыстаннем камерцыйна даступных набораў (Man Company, Тэгеран, Іран) і аўтаматычнага аналізатара (Selectra E, серыйны нумар 0-2124, Нідэрланды). Унутры- і міжлабараторныя каэфіцыенты варыяцыі для мачавіны і Cr былі меншымі за 2,5%.
Метад метыленавага сіняга (MB) выкарыстоўваецца для вымярэння агульнага ўтрымання сульфіду ў пітной вадзе і сыроватцы крыві, якая змяшчае NaHS; MB з'яўляецца найбольш распаўсюджаным метадам для вымярэння сульфіду ў аб'ёмных растворах і біялагічных узорах11,37. Метад MB можа быць выкарыстаны для ацэнкі агульнага пула сульфідаў38 і вымярэння неарганічных сульфідаў у выглядзе H2S, HS- і S2 у воднай фазе39. У гэтым метадзе сера асядае ў выглядзе сульфіду цынку (ZnS) у прысутнасці ацэтату цынку11,38. Асаджэнне ацэтатам цынку з'яўляецца найбольш шырока выкарыстоўваным метадам аддзялення сульфідаў ад іншых храмафораў11. ZnS быў паўторна раствараны з выкарыстаннем HCl11 у моцна кіслых умовах. Сульфід рэагуе з DMPD у стехіаметрычным суадносінах 1:2 у рэакцыі, каталізаванай хларыдам жалеза (Fe3+ дзейнічае як акісляльнік), з утварэннем фарбавальніка MB, які выяўляецца спектрафатаметрычна пры 670 нм40,41. Мяжа выяўлення метаду MB складае прыблізна 1 мкМ11.
У гэтым даследаванні ў прабірку дадавалі 100 мкл кожнага ўзору (раствору або сыроваткі); затым дадавалі 200 мкл ацэтату цынку (1% w/v у дыстыляванай вадзе), 100 мкл DMPD (20 мМ у 7,2 М HCl) і 133 мкл FeCl3 (30 мМ у 1,2 М HCl). Сумесь інкубавалі пры тэмпературы 37°C у цемры на працягу 30 хвілін. Раствор цэнтрыфугавалі пры 10 000 g на працягу 10 хвілін, і паглынанне супернатанту счытвалі пры 670 нм з дапамогай мікрапланшэтнага рыдэра (BioTek, MQX2000R2, Вінускі, штат Вермонт, ЗША). Канцэнтрацыі сульфідаў вызначалі з дапамогай калібравальнай крывой NaHS (0–100 мкМ) у ddH2O (Дадатковы мал. 2). Усе растворы, якія выкарыстоўваліся для вымярэнняў, былі свежапрыгатаванымі. Унутры- і міжлабараторныя каэфіцыенты варыяцыі для вымярэнняў сульфіду склалі 2,8% і 3,4% адпаведна. Мы таксама вызначылі агульную колькасць сульфіду, вынятага з пітной вады і сыроваткі, якія змяшчаюць тыясульфат натрыю, з выкарыстаннем метаду ўзбагачаных узораў42. Выняцце для пітной вады і сыроваткі, якія змяшчаюць тыясульфат натрыю, склала 91 ± 1,1% (n = 6) і 93 ± 2,4% (n = 6) адпаведна.
Статыстычны аналіз праводзілі з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння GraphPad Prism версіі 8.0.2 для Windows (GraphPad Software, Сан-Дыега, Каліфорнія, ЗША, www.graphpad.com). Для параўнання тэмпературы і pH пітной вады да і пасля дадання NaHS выкарыстоўвалі парны t-крытэрый. Страта H2S у растворы, які змяшчае NaHS, разлічвалася як працэнтнае зніжэнне ад базавага ўзроўню паглынання, і каб ацаніць статыстычную значнасць страты, мы правялі аднафактарны паўторны дысперсійны аналіз з наступным тэстам множнага параўнання Данэта. Маса цела, мачавіна ў сыроватцы крыві, крэатынін у сыроватцы крыві і агульны сульфід у сыроватцы крыві з цягам часу параўноўвалі паміж кантрольнымі пацукамі і пацукамі рознага полу, якія атрымлівалі NaHS, з выкарыстаннем двухфактарнага змешанага (паміж-унутры) дысперсійнага аналізу з наступным post hoc тэстам Банфероні. Двухбаковыя значэнні P < 0,05 лічыліся статыстычна значнымі.
Паказчык pH пітной вады да дадання NaHS складаў 7,60 ± 0,01, а пасля дадання NaHS — 7,71 ± 0,03 (n = 13, p = 0,0029). Тэмпература пітной вады складала 26,5 ± 0,2 і знізілася да 26,2 ± 0,2 пасля дадання NaHS (n = 13, p = 0,0128). Прыгатуйце раствор NaHS канцэнтрацыяй 30 мкМ у пітной вадзе і захоўвайце яго ў бутэльцы для вады. Раствор NaHS нестабільны, і яго канцэнтрацыя з часам памяншаецца. Пры адборы пробы з гарлавіны бутэлькі для вады назіралася значнае зніжэнне (68,0%) на працягу першай гадзіны, а ўтрыманне NaHS у растворы зменшылася на 72% і 75% праз 12 і 24 гадзіны адпаведна. У пробах, атрыманых з бутэлек для вады, зніжэнне NaHS не было значным да 2 гадзін, але праз 12 і 24 гадзіны яно зменшылася на 47% і 72% адпаведна. Гэтыя дадзеныя паказваюць, што працэнт NaHS у растворы 30 мкМ, прыгатаваным у пітной вадзе, знізіўся прыблізна да адной чвэрці ад пачатковага значэння праз 24 гадзіны, незалежна ад месца адбору проб (Малюнак 1).
Стабільнасць раствора NaHS (30 мкМ) у пітной вадзе ў бутэльках для пацукоў/мышэй. Пасля падрыхтоўкі раствора ўзоры былі ўзяты з наканечніка і ўнутранай часткі бутэлькі для вады. Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне (n = 6/група). * і #, P < 0,05 у параўнанні з часам 0. На фатаграфіі бутэлькі для вады паказаны наканечнік (з адтулінай) і корпус бутэлькі. Аб'ём наканечніка складае прыблізна 740 мкл.
Канцэнтрацыя NaHS у свежапрыгатаваным растворы 30 мкМ складала 30,3 ± 0,4 мкМ (дыяпазон: 28,7–31,9 мкМ, n = 12). Аднак праз 24 гадзіны канцэнтрацыя NaHS знізілася да ніжэйшага значэння (сярэдняе значэнне: 3,0 ± 0,6 мкМ). Як паказана на малюнку 2, канцэнтрацыі NaHS, якім падвяргаліся пацукі, не былі пастаяннымі на працягу перыяду даследавання.
Маса цела самак пацукоў з цягам часу значна павялічылася (з 205,2 ± 5,2 г да 213,8 ​​± 7,0 г у кантрольнай групе і з 204,0 ± 8,6 г да 211,8 ± 7,5 г у групе, якая атрымлівала NaHS); аднак апрацоўка NaHS не паўплывала на масу цела (мал. 3). Маса цела самцоў пацукоў з цягам часу значна павялічылася (з 338,6 ± 8,3 г да 352,4 ± 6,0 г у кантрольнай групе і з 352,4 ± 5,9 г да 363,2 ± 4,3 г у групе, якая атрымлівала NaHS); аднак апрацоўка NaHS не паўплывала на масу цела (мал. 3).
Змены масы цела ў самак і самцоў пацукоў пасля ўвядзення NaHS (30 мкМ). Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± SEM і параўноўваліся з выкарыстаннем двухфактарнага змешанага (паміж імі) дысперсійнага аналізу з дапамогай post hoc тэсту Банфероні. n = 5 кожнага полу ў кожнай групе.
Канцэнтрацыі мачавіны і креатинфасфату ў сыроватцы крыві былі параўнальныя ў кантрольнай групы і групы пацукоў, якія атрымлівалі NaSH, на працягу ўсяго даследавання. Акрамя таго, лячэнне NaSH не паўплывала на канцэнтрацыі мачавіны і креатинхрому ў сыроватцы крыві (табліца 1).
Зыходныя канцэнтрацыі агульнага сульфіду ў сыроватцы крыві былі параўнальныя ў кантрольнай групы і групы пацукоў, якія атрымлівалі NaHS, у самцоў (8,1 ± 0,5 мкМ супраць 9,3 ± 0,2 мкМ) і самак (9,1 ± 1,0 мкМ супраць 6,1 ± 1,1 мкМ). Увядзенне NaHS на працягу 14 дзён не паўплывала на ўзровень агульнага сульфіду ў сыроватцы крыві ні ў самцоў, ні ў самак пацукоў (мал. 4).
Змены канцэнтрацыі агульнага сульфіду ў сыроватцы крыві самцоў і самак пацукоў пасля ўвядзення NaHS (30 мкМ). Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± SEM і параўноўваліся з дапамогай двухбаковага змешанага (унутры-унутры) дысперсійнага аналізу з post hoc крытэрыем Банфероні. Кожны пол, n = 5/група.
Галоўная выснова гэтага даследавання заключаецца ў тым, што пітная вада, якая змяшчае NaHS, нестабільная: толькі каля чвэрці пачатковага агульнага ўтрымання сульфіду можна выявіць праз 24 гадзіны пасля ўзяцця пробы з кончыка і ўнутры бутэлек для вады пацукоў/мышэй. Акрамя таго, пацукі падвяргаліся ўздзеянню нестабільных канцэнтрацый NaHS з-за страты H2S у растворы NaHS, і даданне NaHS у пітную ваду не паўплывала на масу цела, узровень мачавіны і креацін-хрому ў сыроватцы крыві, а таксама на агульны ўзровень сульфіду ў сыроватцы крыві.
У гэтым даследаванні хуткасць страты H2S з раствораў NaHS з канцэнтрацыяй 30 мкМ, прыгатаваных у пітной вадзе, складала прыблізна 3% у гадзіну. У буферным растворы (100 мкМ сульфіду натрыю ў 10 мМ PBS, pH 7,4) паведамлялася, што канцэнтрацыя сульфіду зніжалася на 7% з цягам часу на працягу 8 гадзін11. Раней мы абаранялі ўнутрыбрушыннае ўвядзенне NaHS, паведамляючы, што хуткасць страты сульфіду з раствора NaHS з канцэнтрацыяй 54 мкМ у пітной вадзе складала прыблізна 2,3% у гадзіну (4%/гадзіну ў першыя 12 гадзін і 1,4%/гадзіну ў апошнія 12 гадзін пасля падрыхтоўкі)8. У папярэдніх даследаваннях43 была выяўлена пастаянная страта H2S з раствораў NaHS, у першую чаргу з-за выпарэння і акіслення. Нават без дадання бурбалак сульфід у асноўным растворы хутка губляецца з-за выпарэння H2S11. Даследаванні паказалі, што падчас працэсу развядзення, які займае каля 30-60 секунд, каля 5-10% H2S губляецца з-за выпарэння6. Каб прадухіліць выпарэнне H2S з раствора, даследчыкі прынялі шэраг мер, у тым ліку акуратнае памешванне раствора12, пакрыццё асноўнага раствора поліэтыленавай плёнкай6 і мінімізацыю ўздзеяння паветра на раствор, паколькі хуткасць выпарэння H2S залежыць ад мяжы паміж паветрам і вадкасцю.13 Спантаннае акісленне H2S адбываецца ў асноўным з-за іёнаў пераходных металаў, асабліва трохвалентнага жалеза, якія з'яўляюцца прымешкамі ў вадзе.13 Акісленне H2S прыводзіць да ўтварэння полісульфідаў (атамаў серы, звязаных кавалентнымі сувязямі)11. Каб пазбегнуць яго акіслення, растворы, якія змяшчаюць H2S, рыхтуюць у дэаксігенаваных растваральніках44,45, а затым прадзімаюць аргонам або азотам на працягу 20-30 хвілін для забеспячэння дэаксігенацыі.11,12,37,44,45,46 Дыэтылентрыамінпентавоцатная кіслата (DTPA) - гэта хелатар металаў (10-4 М), які прадухіляе аўтаакісленне HS- у аэробных растворах. У адсутнасць DTPA хуткасць аўтаакіслення HS- складае прыблізна 50% на працягу прыблізна 3 гадзін пры тэмпературы 25°C37,47. Акрамя таго, паколькі акісленне 1e-сульфіду каталізуецца ультрафіялетавым святлом, раствор варта захоўваць на лёдзе і абараняць ад святла11.
Як паказана на малюнку 5, NaHS дысацыюе на Na+ і HS-6 пры растварэнні ў вадзе; гэтая дысацыяцыя вызначаецца pK1 рэакцыі, якая залежыць ад тэмпературы: pK1 = 3,122 + 1132/T, дзе T вагаецца ад 5 да 30°C і вымяраецца ў градусах Кельвіна (K), K = °C + 273,1548. HS- мае высокі pK2 (pK2 = 19), таму пры pH < 96,49 S2- не ўтвараецца або ўтвараецца ў вельмі малых колькасцях. Наадварот, HS- дзейнічае як аснова і прымае H+ ад малекулы H2O, а H2O дзейнічае як кіслата і пераўтвараецца ў H2S і OH-.
Утварэнне растворанага газа H2S у растворы NaHS (30 мкМ). aq – водны раствор; g – газ; l – вадкасць. Усе разлікі мяркуюць, што pH вады = 7,0, а тэмпература вады – 20 °C. Створана з дапамогай BioRender.com.
Нягледзячы на ​​доказы таго, што растворы NaHS нестабільныя, у некалькіх даследаваннях на жывёлах растворы NaHS выкарыстоўваліся ў пітной вадзе ў якасці донара H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 з працягласцю ўмяшання ад 1 да 21 тыдня (табліца 2). Падчас гэтых даследаванняў раствор NaHS абнаўляўся кожныя 12 гадзін, 15, 17, 18, 24, 25 гадзін або 24 гадзіны, 19, 20, 21, 22, 23 гадзіны. Нашы вынікі паказалі, што пацукі падвяргаліся ўздзеянню нестабільных канцэнтрацый прэпарата з-за страты H2S з раствора NaHS, і ўтрыманне NaHS у пітной вадзе пацукоў значна вагалася на працягу 12 або 24 гадзін (гл. малюнак 2). У двух з гэтых даследаванняў паведамлялася, што ўзровень H2S у вадзе заставаўся стабільным на працягу 24 гадзін22 або што назіраліся толькі 2–3% страт H2S на працягу 12 гадзін15, але яны не прадставілі пацвярджальных дадзеных або дэталяў вымярэнняў. Два даследаванні паказалі, што малы дыяметр бутэлек з вадой можа мінімізаваць выпарэнне H2S15,19. Аднак нашы вынікі паказалі, што гэта можа затрымаць страту H2S з бутэлькі з вадой толькі на 2 гадзіны, а не на 12–24 гадзіны. У абодвух даследаваннях адзначаецца, што мы мяркуем, што ўзровень NaHS у пітной вадзе не змяніўся, бо мы не назіралі змены колеру вады; такім чынам, акісленне H2S паветрам было нязначным19,20. Дзіўна, але гэты суб'ектыўны метад ацэньвае стабільнасць NaHS у вадзе, а не вымярае змяненне яго канцэнтрацыі з цягам часу.
Страта H2S у растворы NaHS звязана з pH і тэмпературай. Як адзначалася ў нашым даследаванні, растварэнне NaHS у вадзе прыводзіць да ўтварэння шчолачнага раствора50. Пры растварэнні NaHS у вадзе ўтварэнне растворанага газа H2S залежыць ад значэння pH6. Чым ніжэй pH раствора, тым большая доля NaHS прысутнічае ў выглядзе малекул газа H2S і тым больш сульфіду губляецца з воднага раствора11. Ні ў адным з гэтых даследаванняў не паведамлялася пра pH пітной вады, якая выкарыстоўваецца ў якасці растваральніка для NaHS. Згодна з рэкамендацыямі СААЗ, якія прыняты большасцю краін, pH пітной вады павінен быць у дыяпазоне 6,5–8,551. У гэтым дыяпазоне pH хуткасць самаадвольнага акіслення H2S павялічваецца прыкладна ў дзесяць разоў13. Растварэнне NaHS у вадзе ў гэтым дыяпазоне pH прывядзе да канцэнтрацыі растворанага газа H2S ад 1 да 22,5 мкМ, што падкрэслівае важнасць кантролю pH вады перад растварэннем NaHS. Акрамя таго, дыяпазон тэмператур, пазначаны ў вышэйзгаданым даследаванні (18–26 °C), прывядзе да змены канцэнтрацыі растворанага газа H2S у растворы прыкладна на 10%, паколькі змены тэмпературы змяняюць pK1, а невялікія змены pK1 могуць аказаць значны ўплыў на канцэнтрацыю растворанага газа H2S48. Акрамя таго, працягласць некаторых даследаванняў (5 месяцаў)22, падчас якіх чакаецца вялікая зменлівасць тэмпературы, таксама пагаршае гэтую праблему.
Ва ўсіх даследаваннях, акрамя аднаго21, выкарыстоўваўся раствор NaHS канцэнтрацыяй 30 мкМ у пітной вадзе. Каб растлумачыць выкарыстаную дозу (г.зн. 30 мкМ), некаторыя аўтары адзначылі, што NaHS у воднай фазе стварае дакладна такую ​​ж канцэнтрацыю газападобнага H2S, і што фізіялагічны дыяпазон H2S складае ад 10 да 100 мкМ, таму гэтая доза знаходзіцца ў межах фізіялагічнага дыяпазону15,16. Іншыя тлумачылі, што 30 мкМ NaHS можа падтрымліваць узровень H2S у плазме ў межах фізіялагічнага дыяпазону, г.зн. 5–300 мкМ19,20. Мы разглядаем канцэнтрацыю NaHS у вадзе 30 мкМ (pH = 7,0, T = 20 °C), якая выкарыстоўвалася ў некаторых даследаваннях для вывучэння ўздзеяння H2S. Мы можам падлічыць, што канцэнтрацыя растворанага газападобнага H2S складае 14,7 мкМ, што складае каля 50% ад пачатковай канцэнтрацыі NaHS. Гэта значэнне падобнае да значэння, разлічанага іншымі аўтарамі пры тых жа ўмовах13,48.
У нашым даследаванні ўвядзенне NaHS не змяніла масу цела; гэты вынік адпавядае вынікам іншых даследаванняў на самцах мышэй22,23 і самцах пацукоў18; Аднак, у двух даследаваннях паведамлялася, што NaSH аднавіў зніжаную масу цела ў пацукоў пасля нефрэктаміі24,26, у той час як у іншых даследаваннях не паведамлялася пра ўплыў увядзення NaSH на масу цела15,16,17,19,20,21,25. Акрамя таго, у нашым даследаванні ўвядзенне NaSH не паўплывала на ўзровень мачавіны і креацін-хрому ў сыроватцы крыві, што адпавядае вынікам іншай справаздачы25.
Даследаванне паказала, што даданне NaHS у пітную ваду на працягу 2 тыдняў не паўплывала на агульную канцэнтрацыю сульфіду ў сыроватцы крыві самцоў і самак пацукоў. Гэта адпавядае вынікам Sen et al. (16): 8 тыдняў лячэння 30 мкМ NaHS у пітной вадзе не паўплывалі на ўзровень сульфіду ў плазме крыві ў кантрольных пацукоў; аднак яны паведамілі, што гэта ўмяшанне аднавіла зніжаны ўзровень H2S у плазме мышэй пасля нефрэктаміі. Li et al. (22) таксама паведамілі, што лячэнне 30 мкМ NaHS у пітной вадзе на працягу 5 месяцаў павялічыла ўзровень свабоднага сульфіду ў плазме ў старых мышэй прыкладна на 26%. У іншых даследаваннях не паведамлялася пра змены ў цыркулюючым сульфідзе пасля дадання NaHS у пітную ваду.
У сямі даследаваннях паведамлялася пра выкарыстанне Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, але не было падрабязнай інфармацыі пра гідратную ваду, а ў пяці даследаваннях не згадвалася крыніца NaHS, якая выкарыстоўвалася ў іх метадах атрымання17,18,24,25,26. NaHS — гэта гідратаваная малекула, і ўтрыманне гідратнай вады ў ёй можа змяняцца, што ўплывае на колькасць NaHS, неабходную для падрыхтоўкі раствора зададзенай малярнасці. Напрыклад, утрыманне NaHS у нашым даследаванні складала NaHS•1,3 H2O. Такім чынам, фактычныя канцэнтрацыі NaHS у гэтых даследаваннях могуць быць ніжэйшымі за паведамленыя.
«Як такое кароткачасовае злучэнне можа мець такі працяглы эфект?» — задалі гэтае пытанне Позгай і інш.21, ацэньваючы ўплыў NaHS на каліт у мышэй. Яны спадзяюцца, што будучыя даследаванні змогуць адказаць на гэтае пытанне, і выказваюць здагадку, што растворы NaHS могуць утрымліваць больш стабільныя полісульфіды ў дадатак да H2S і дысульфідаў, якія апасродкуюць эфект NaHS21. Іншая магчымасць заключаецца ў тым, што вельмі нізкія канцэнтрацыі NaHS, якія застаюцца ў растворы, таксама могуць мець карысны эфект. Фактычна, Олсан і інш. прадставілі доказы таго, што мікрамалярныя ўзроўні H2S у крыві не з'яўляюцца фізіялагічнымі і павінны знаходзіцца ў нанамалярным дыяпазоне або адсутнічаць зусім13. H2S можа дзейнічаць праз сульфатацыю бялкоў, зварачальную посттрансляцыйную мадыфікацыю, якая ўплывае на функцыю, стабільнасць і лакалізацыю многіх бялкоў52,53,54. Фактычна, у фізіялагічных умовах прыблізна ад 10% да 25% многіх бялкоў печані сульфілююцца53. У абодвух даследаваннях прызнаецца хуткае разбурэнне NaHS19,23, але нечакана заяўляецца, што «мы кантралявалі канцэнтрацыю NaHS у пітной вадзе, штодня замяняючы яго».23 У адным даследаванні выпадкова было заяўлена, што «NaHS з'яўляецца стандартным донарам H2S і звычайна выкарыстоўваецца ў клінічнай практыцы для замены самога H2S».18
Прыведзеныя вышэй паказваюць, што NaHS губляецца з раствора праз выпарэнне, акісленне і фоталіз, і таму ёсць некаторыя прапановы па змяншэнні страт H2S з раствора. Па-першае, выпарэнне H2S залежыць ад мяжы падзелу газ-вадкасць13 і pH раствора11; таму, каб мінімізаваць страты ад выпарэння, шыйку бутэлькі для вады можна зрабіць як мага меншай, як апісана раней15,19, а pH вады можна адрэгуляваць да прымальнай верхняй мяжы (г.зн. 6,5–8,551), каб мінімізаваць страты ад выпарэння11. Па-другое, спантаннае акісленне H2S адбываецца з-за ўздзеяння кіслароду і прысутнасці іонаў пераходных металаў у пітной вадзе13, таму дэаксігенацыя пітной вады аргонам або азотам44,45 і выкарыстанне хелатараў металаў37,47 могуць паменшыць акісленне сульфідаў. Па-трэцяе, каб прадухіліць фотараскладанне H2S, бутэлькі для вады можна абгарнуць алюмініевай фальгой; гэтая практыка таксама датычыцца святлоадчувальных матэрыялаў, такіх як стрэптазатацын55. Нарэшце, неарганічныя сульфідныя солі (NaHS, Na2S і CaS) можна ўводзіць праз зонд, а не раствараць у пітной вадзе, як паведамлялася раней56,57,58; даследаванні паказалі, што радыеактыўны сульфід натрыю, які ўводзіцца пацукам праз зонд, добра ўсмоктваецца і размяркоўваецца практычна ва ўсіх тканінах59. На сённяшні дзень у большасці даследаванняў неарганічныя сульфідныя солі ўводзіліся ўнутрыбрушынна; аднак гэты шлях рэдка выкарыстоўваецца ў клінічных умовах60. З іншага боку, пероральны шлях з'яўляецца найбольш распаўсюджаным і пераважным шляхам увядзення ў людзей61. Таму мы рэкамендуем ацэньваць эфекты донараў H2S у грызуноў шляхам перорального зонда.
Абмежаваннем з'яўляецца тое, што мы вымяралі сульфід у водным растворы і сыроватцы з выкарыстаннем метаду MB. Метады вымярэння сульфіду ўключаюць тытраванне ёду, спектрафатаметрыю, электрахімічны метад (патэнцыяметрыя, ампераметрыя, кулонаметрычны метад і ампераметрычны метад) і храматаграфію (газавая храматаграфія і высокаэфектыўная вадкасная храматаграфія), сярод якіх найбольш часта выкарыстоўваецца спектрафатаметрычны метад MB62. Абмежаваннем метаду MB для вымярэння H2S у біялагічных узорах з'яўляецца тое, што ён вымярае ўсе серазмяшчальныя злучэнні, а не свабодны H2S63, паколькі ён праводзіцца ў кіслых умовах, што прыводзіць да экстракцыі серы з біялагічнай крыніцы64. Аднак, паводле Амерыканскай асацыяцыі грамадскага здароўя, MB з'яўляецца стандартным метадам вымярэння сульфіду ў вадзе65. Такім чынам, гэта абмежаванне не ўплывае на нашы асноўныя вынікі па нестабільнасці раствораў, якія змяшчаюць NaHS. Акрамя таго, у нашым даследаванні аднаўленне вымярэнняў сульфіду ў вадзе і сыроватцы, якія змяшчаюць NaHS, склала 91% і 93% адпаведна. Гэтыя значэнні адпавядаюць раней апісаным дыяпазонам (77–92)66, што сведчыць аб прымальнай аналітычнай дакладнасці42. Варта адзначыць, што мы выкарыстоўвалі як самцоў, так і самак пацукоў у адпаведнасці з рэкамендацыямі Нацыянальных інстытутаў здароўя (NIH), каб пазбегнуць празмернай залежнасці ад даследаванняў на жывёлах толькі на самцах у даклінічных даследаваннях67 і ўключаць як самцоў, так і самак пацукоў, калі гэта магчыма68. Гэты момант падкрэслівалі і іншыя69,70,71.
У заключэнне, вынікі гэтага даследавання паказваюць, што растворы NaHS, прыгатаваныя з пітной вады, не могуць быць выкарыстаны для атрымання H2S з-за іх нестабільнасці. Гэты шлях увядзення прывядзе да ўздзеяння на жывёл нестабільных і ніжэйшых за чаканыя ўзроўняў NaHS; таму атрыманыя вынікі могуць быць непрыдатныя для людзей.
Наборы дадзеных, выкарыстаныя і/або прааналізаваныя падчас гэтага даследавання, даступныя ў адпаведнага аўтара па абгрунтаваным запыце.
Сабо, К. Храналогія даследаванняў серавадароду (H2S): ад экалагічнага таксіну да біялагічнага медыятара. Біяхімія і фармакалогія 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Абэ, К. і Кімура, Х. Магчымая роля серавадароду як эндагеннага нейрамадулятара. Часопіс неўралогіі, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Чырына, Г., Сабо, К. і Папапетрапулас, А. Фізіялагічная роля серавадароду ў клетках, тканінах і органах млекакормячых. Агляды ў фізіялогіі і малекулярнай біялогіі 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Дылан, К.М., Карацоне, Р.Дж., Мэтсан, Дж.Б. і Кашфі, К. Перспектывы клетачных сістэм дастаўкі аксіду азоту і серавадароду: новая эра персаналізаванай медыцыны. Біяхімія і фармакалогія 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. і інш. Доўгатэрміновае ўвядзенне донара серавадароду з павольным вызваленнем можа прадухіліць ішэмію/рэперфузійнае пашкоджанне міякарда. Навуковыя справаздачы 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Сітдзікава, Г. Ф., Фукс, Р., Кайнц, У., Вайгер, Т. М. і Герман, А. Фасфараляванне BK-каналаў рэгулюе адчувальнасць да серавадароду (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Сітдзікава, Г. Ф., Вайгер, Т. М. і Герман, А. Серавадарод павялічвае актыўнасць кальцый-актываваных каліевых (BK) каналаў у клетках пухлін гіпофізу пацукоў. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Джэдзі, С. і інш. Серавадарод узмацняе ахоўны эфект нітрытаў супраць ішэмічна-рэперфузійнага пашкоджання міякарда ў пацукоў з дыябетам 2 тыпу. Аксід азоту 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Карвіна, А. і інш. Тэндэнцыі ў хіміі донараў H2S і іх уплыў на сардэчна-сасудзістыя захворванні. Антыаксіданты 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
ДэЛеон, Э.Р., Стой, Г.Ф. і Олсан, К.Р. (2012). Пасіўныя страты серавадароду ў біялагічных эксперыментах. Аналітычная біяхімія 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Надзь, П. і інш. Хімічныя аспекты вымярэнняў серавадароду ў фізіялагічных узорах. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Клайн, доктар права. Спектрафатаметрычнае вызначэнне серавадароду ў прыродных водах. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Олсан, К. Р. (2012). Практычная падрыхтоўка па хіміі і біялогіі серавадароду. «Антыаксіданты». Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).