Сартаванне бялкоў у сакраторным шляху мае важнае значэнне для падтрымання компартменталізацыі і гамеастазу клетак. Акрамя сартавання, апасродкаванага абалонкай, роля ліпідаў у сартаванні кінезінаў у працэсе сакраторнага транспарту з'яўляецца даўнім фундаментальным пытаннем, на якое пакуль няма адказу. Тут мы праводзім 3D-сінхронную шматколерную візуалізацыю ў рэжыме рэальнага часу з высокім разрозненнем, каб даказаць in vivo, што нядаўна сінтэзаваныя гліказілфасфатыдыліназітол-імабілізаваныя бялкі з вельмі доўгімі цэраміднымі ліпіднымі фрагментамі кластарызуюцца і класіфікуюцца ў спецыялізаваныя сайты выхаду эндаплазматычнай сеткі, якія адрозніваюцца ад тых, што выкарыстоўваюцца трансмембраннымі бялкамі. Акрамя таго, мы паказваем, што даўжыня ланцуга цэраміду ў мембране эндаплазматычнага рэтыкулума мае вырашальнае значэнне для гэтай селектыўнасці сартавання. Наша даследаванне дае першыя прамыя доказы in vivo для класіфікацыі бялковых грузаў на аснове даўжыні ліпіднага ланцуга ў селектыўныя сайты экспарту ў сакраторным шляху.
У эўкарыятычных клетках бялкі, сінтэзаваныя ў эндаплазматычным рэтыкулуме (ЭР), затым сартуюцца падчас транспарту праз сакрэторны шлях для дастаўкі ў адпаведныя клеткі (1). Акрамя сартавання, апасродкаванага абалонкай, доўгі час меркавалася, што некаторыя ліпіды таксама могуць служыць селектыўнымі кропкамі выхаду, кластарызуючы іх у спецыфічныя мембранныя дамены, якія адказваюць за пэўныя бялкі (2-5). Аднак да гэтага часу не хапае прамых доказаў in vivo, якія б пацвярджалі гэты магчымы механізм, заснаваны на ліпідах. Каб вырашыць гэтую асноўную праблему, мы вывучылі на дрожджах, як гліказілфасфатыдыліназітолавыя (GPI) замацаваныя бялкі (GPI-AP) дыферэнцыяльна экспартуюцца з ЭР. GPI-AP - гэта разнавіднасць ліпідна-звязаных паверхневых бялкоў клетак (6, 7). GPI-AP - гэта сакрэтаваны бялок, прымацаваны да вонкавых лісткоў плазматычнай мембраны праз глікаліпідны фрагмент (GPI-якар). Яны прымаюць GPI-якар як кансерватыўныя посттрансляцыйныя мадыфікацыі ў прасвеце ЭР (8). Пасля прымацавання GPI-AP праходзіць праз апарат Гольджы (5, 9) з ЭР да плазматычнай мембраны. Прысутнасць GPI-якарных злучэнняў прыводзіць да таго, што GPI-AP транспартуецца асобна ад трансмембранных сакрэтаваных бялкоў (у тым ліку іншых бялкоў плазматычнай мембраны) па сакрэторным шляху (5, 9, 10). У клетках дрожджаў GPI-AP аддзяляюцца ад іншых сакрэтаваных бялкоў у эндаплазматычным рэтыкулуме, а затым пакуюцца ў унікальныя везікулы, абгорнутыя комплексам бялкоў абалонкі II (COPII) (6, 7). Дэтэрмінанты гэтага працэсу класіфікацыі ў працэсе экспарту ЭР незразумелыя, але мяркуецца, што гэты механізм можа патрабаваць ліпідаў, асабліва структурная перабудова ліпіднай часткі GPI-якарнага злучэння (5, 8). У дрожджах перабудова ліпідаў GPI пачынаецца адразу пасля прымацавання GPI, і ў многіх выпадках гэта прыводзіць да звязвання цэраміду з 26-вугляроднай доўгаланцуговай насычанай тоўстай кіслатой (C26:0) (11, 12). C26 цэрамід з'яўляецца асноўным цэрамідам, які выпрацоўваецца клеткамі дрожджаў да гэтага часу. Ён сінтэзуецца ў ЭР, і большая яго частка экспартуецца ў апарат Гольджы праз везікулы COPII (13). Экспарт GPI-AP з ЭР патрабуе пастаяннага сінтэзу цэраміду (14, 15), і, у сваю чаргу, пераўтварэнне цэраміду ў іназітолфасфат-цэрамід (IPC) у апараце Гольджы залежыць ад сінтэзу GPI-якара (16). Біяфізічныя даследаванні са штучнымі мембранамі паказалі, што вельмі доўгія ацыльныя ланцугі цэрамідаў могуць аб'ядноўвацца, утвараючы ўпарадкаваныя дамены з унікальнымі фізічнымі ўласцівасцямі (17, 18). Гэтыя дадзеныя прыводзяць да гіпотэзы, што C26-цэрамід і GPI-AP з C26-цэрамідам выкарыстоўваюць свае фізічныя ўласцівасці для аб'яднання ў ўпарадкаваныя вобласці або вобласці ў адносна бязладным ліпідным асяроддзі мембраны ЭР. Яно ў асноўным складаецца з кароткіх і ненасычаных гліцэраліпідаў (C16:1 і C18:1) (19, 20). Гэтыя вобласці будуць выбарачна сканцэнтраваны на пэўных месцах выхаду з ЭР (ERES), дзе церамід і GPI-AP на аснове цераміду могуць сумесна транспартавацца ў апарат Гольджы ў адным і тым жа спецыяльным везікуле COPII (5).
У гэтым даследаванні мы непасрэдна пратэставалі гэты механізм, заснаваны на ліпідах, выкарыстоўваючы канфакальную мікраскапію візуалізацыі ў рэжыме рэальнага часу з высокім разрозненнем (SCLIM), якая з'яўляецца перадавой тэхнікай мікраскапіі, якая дазваляе адначасова назіраць флуарэсцэнтна мечаныя бялкі. Трохкаляровыя і трохмерныя (3D) выявы маюць надзвычай высокую разрозненне і хуткасць у жывых клетках (21, 22).
Спачатку мы ўжылі тэхналогію SCLIM, каб далей вызначыць, як нармальны GPI-AP з кераміднай групай C26 быў аддзелены ад трансмембранных сакрэтаваных бялкоў пасля выхаду з ЭР у S. cerevisiae. Каб праверыць класіфікацыю ЭР, мы выкарысталі генетычную сістэму, якая можа непасрэдна візуалізаваць нядаўна сінтэзаваны груз, які трапляе ў ERES in vivo (7, 23). У якасці грузу мы выбралі GPI-AP Gas1 на аснове кераміду C26, пазначаны зялёным флуарэсцэнтным бялком (GFP), і трансмембранны сакрэтаваны бялок Mid2, пазначаны блізкім інфрачырвоным флуарэсцэнтным бялком (iRFP), абодва з якіх накіраваны на плазматычную мембрану (24–26). У тэмпературна-адчувальным мутанце sec31-1 гэтыя два грузы экспрэсуюцца пад уздзеяннем галактоза-індуцыруемага прамотара і канстытутыўнага маркера ERES. Пры экстрэмальнай тэмпературы (37°C), паколькі мутацыя sec31-1 уплывае на функцыю кампанента абалонкі COPII Sec31, які інгібіруе прарастанне COPII і экспарт ЭР, нядаўна сінтэзаваны груз назапашваецца ў ЭР (23). Пасля астуджэння да нізкай тэмпературы (24°C) мутантныя клеткі sec31-1 аднавіліся з сакраторнай зоны, і назапашаны новы сінтэтычны груз пачаў экспартавацца з ЭР. Візуалізацыя CLIM паказала, што большая частка нядаўна сінтэзаваных Gas1-GFP і Mid2-iRFP усё яшчэ назапашвалася ў ЭР мутантных клетак sec31-1 пасля інкубацыі пры 37°C, а затым вызвалялася пры 24°C на працягу 5 хвілін (Малюнак 1). Паколькі Mid2-iRFP размеркаваны па ўсёй мембране ЭР, а Gas1-GFP канцэнтраваны і сабраны ў перарывістай вобласці мембраны ЭР, іх размеркаванне зусім іншае (Малюнак 1, A-C і фільм S1). Акрамя таго, як паказана на Малюнку 1D, кластар Gas1-GFP не мае Mid2-iRFP. Гэтыя вынікі паказваюць, што GPI-AP і трансмембранныя бялкі былі падзелены на розныя вобласці мембраны ЭР на ранняй стадыі. Кластар Gas1-GFP знаходзіцца побач са спецыфічным ERES, пазначаным бялком абалонкі mCherry COPII Sec13 (Малюнак 1, E і F, і відэа S1) (23).
Клеткі sec31-1 экспрэсуюць галактоза-індукаваныя сакрэты, доўгі ацыльны ланцуг (C26) керамід GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, зялёны) і трансмембранны бялок Mid2-iRFP (TMP, сіні), і гэта канструктыўнае ERES-маркіраванне Sec13-mCherry (ERES, пурпурны) інкубавалі пры тэмпературы 37°C на працягу 30 хвілін, перанеслі ў тэмпературу 24°C і праз 5 хвілін візуалізавалі з дапамогай SCLIM. (А-С) паказваюць рэпрэзентатыўны аб'яднаны або адзінкавы 2D-выяву плоскасці (А), 2D-праекцыйную выяву 10 z-зрэзаў (B) або 3D-выяву паўсферы клеткі грузу і маркераў ERES (C). Маштабная лінейка 1 мкм (А і B). Адзінка маштабавання — 0,551 мкм (C). Gas1-GFP быў выяўлены ў асобных абласцях або кластарах ER, у той час як Mid2-iRFP быў выяўлены і размеркаваны па ўсёй мембране ER (C). (D) Графік паказвае адносную інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі Gas1-GFP і Mid2-iRFP у кластары Gas1-GFP уздоўж лініі белай стрэлкі (злева). AU — адвольная адзінка. (E і F) прадстаўляюць трохмерны малюнак, які спалучае тавар і пазнаку ERES. Кластары Gas1-GFP былі выяўлены паблізу канкрэтнага ERES. Адзінка маштабу — 0,551 мкм. (F) Белая суцэльная стрэлка пазначае кластар Gas1-GFP, звязаны з ERES. Сярэдняя і правая панэлі паказваюць аб'яднаны павялічаны трохмерны малюнак і павернуты выгляд выбранага кластара Gas1-GFP.
Цесная прасторавая сувязь паміж кластарам Gas1-GFP і спецыфічным ERES паказвае, што Gas1-GFP можа ўваходзіць у селектыўны ERES, што адрозніваецца ад селектыўнасці, якую выкарыстоўвае Mid2-iRFP для выхаду з ER. Каб вырашыць гэтую магчымасць, мы колькасна вызначылі суадносіны ERES толькі для аднаго або двух тавараў (малюнак 2, ад A да C). Мы выявілі, што большасць ERES (70%) утрымліваюць толькі адзін тып грузу. Ніжні малюнак на малюнку 2C паказвае два тыповыя прыклады ERES толькі з Gas1-GFP (малюнак 1) або толькі з Mid2-iRFP (малюнак 2). Наадварот, прыблізна 20% ERES утрымліваюць два грузы, якія перакрываюцца ў адной і той жа вобласці. Было выяўлена, што некаторыя ERES (10%) утрымліваюць два тыпы грузу, але яны былі ізаляваны ў відавочна розных абласцях. Такім чынам, гэты статыстычны аналіз паказвае, што пасля экспарту ER, GPI-AP Gas1-GFP і трансмембранны груз Mid2-iRFP падзяляюцца на розныя ERES (малюнак 2D). Гэтая эфектыўнасць сартавання вельмі адпавядае папярэдняму біяхімічнаму аналізу (6) і марфалагічнаму вызначэнню (7). Мы таксама можам назіраць за паводзінамі грузу, які знаходзіцца ў карантыне і трапляе ў ERES (малюнак 2E і фільм S2). На малюнку 2E паказана, што толькі невялікая частка Gas1-GFP (панэль 3) або Mid2-iRFP (панэль 4) трапляе ў ERES з аднаго боку і знаходзіцца ў асобнай вобласці. На панэлі 5 малюнка 2E паказана, што Gas1-GFP і Mid2-iRFP часам знаходзяцца ў адным і тым жа ERES, але яны трапляюць з розных бакоў і сканцэнтраваны ў асобных абласцях, якія могуць прадстаўляць розныя везікулы COPII. Мы таксама пацвердзілі, што назіранае падзел і класіфікацыя GPI-AP Gas1 на аснове цераміду C26 як селектыўнага ERES з'яўляецца спецыфічным, паколькі іншы груз трансмембраннай сакрэцыі, бялок плазматычнай мембраны Axl2 (27), пазначаны GFP, дэманструе падобную паводзіны да Mid2-iRFP. (малюнак S1 і фільм S3). Новасінтэзаваны Axl2-GFP распаўсюджваецца праз мембрану ER, як Mid2-iRFP (малюнак S1, A і B), і сумесна лакалізуецца з Mid2-iRFP у большасці ERES (малюнак S1, B-D). На панэлях 1 і 2 малюнка 1. S1C паказаны два тыповыя прыклады ERES, дзе два трансмембранныя грузы перакрываюцца. У гэтых выпадках абодва тавары трапляюць у ERES разам (малюнак S1E, панэль 3 і фільм S3).
Клеткі sec31-1, якія экспрэсуюць галактозна-індуцыбельныя сакрэты, Gas1-GFP (GPI-AP, зялёны) і Mid2-iRFP (TMP, сіні), а таксама канстытутыўнае ERES-маркіраванне Sec13-mCherry (ERES, пурпурны), змяшчалі пры тэмпературы 37°C. Пасля 30-хвіліннай інкубацыі пры тэмпературы 24°C пераносілі да 24°C для вызвалення блока сакрэту і праз 20 хвілін фатаграфавалі з дапамогай SCLIM. (Ад А да В) Тыповыя 2D-праекцыйныя выявы (А; маштабная паласа, 1 мкм) або 3D-выявы паўсфер клетак (B і C; адзінка маштабу, 0,456 мкм) грузу і 10 z-зрэзаў, пазначаных ERES. Ніжняя панэль у (B) і панэль у (C) адлюстроўваюць апрацаваныя выявы для адлюстравання толькі тавараў, прысутных у ERES (пурпурны) [Gas1-GFP (шэры) і Mid2-iRFP (светла-сіні)]. (C) Адкрытая стрэлка: ERES нясе толькі адзін кавалак грузу (ад 1 да 4). Шэрая стрэлка: ERES змяшчае асобны груз (5). Белая суцэльная стрэлка: ERES змяшчае сумесны груз. Ніжэй: Выбраны адзінкавы ERES змяшчае толькі Gas1-GFP (1) або Mid2-iRFP (2). Маштабная лінейка, 100 нм. (D) Колькасная ацэнка мікрафатаграфіі, апісанай у (C). Сярэдні працэнт ERES, які змяшчае толькі адзін груз (Gas1-GFP або Mid2-iRFP), асобны груз і груз, які перакрываецца. У трох незалежных эксперыментах n=432 у 54 ячэйках. Палоска памылак = SD. Двухбаковы няпарны t-крытэрый. *** P = 0,0002. (E) Трохмерная выява выбранага ERES грузу, які знаходзіцца на каранціне, пазначанага (C). Gas1-GFP (зялёны) (3) або Mid2-iRFP (сіні) (4) уваходзіць у ERES (пурпурны) з аднаго боку і абмежаваны невялікай зонай у межах ERES. Часам абодва тыпы грузу ўваходзяць у адзін і той жа ERES (5) з аднаго боку і абмежаваныя ізаляванай зонай у межах ERES. Маштабная лінейка, 100 нм.
Далей мы праверылі гіпотэзу аб тым, што доўгі ацыльны цэрамід (C26), які прысутнічае ў мембране ЭР, прыводзіць да спецыфічнай кластэрызацыі і сартавання Gas1 у селектыўныя ERES. Для гэтага мы выкарысталі мадыфікаваны штам дрожджаў GhLag1, у якім дзве эндагенныя цэрамідсінтазы Lag1 і Lac1 былі заменены на GhLag1 (гомолаг Lag1 бавоўны), што прывяло да атрымання штама дрожджаў з цэрамідам клеткавай мембраны, карацейшым за дзікі тып (Малюнак 3А) (28). Аналіз мас-спектрометрыі (МС) паказаў, што ў штамах дзікага тыпу 95% агульнага цэраміду - гэта вельмі доўгі (C26) цэрамід, у той час як у GhLag1 85% цэраміду вельмі доўгі (C18 і C16) , і толькі 2% цэраміду - гэта вельмі доўгі (C26) цэрамід. Нягледзячы на ​​тое, што да гэтага часу асноўнымі керамідамі, выяўленымі ў мембране GhLag1, з'яўляюцца кераміды C18 і C16, аналіз MS таксама пацвердзіў, што GPI-якар Gas1-GFP, экспрэсаваны ў штаме GhLag1, змяшчае керамід C26, які параўнальны з ліпідамі дзікага тыпу. Якасць аднолькавая (мал. 3A) (26). Такім чынам, гэта азначае, што фермент Cwh43, які рэмадэлюе керамід, мае высокую селектыўнасць да кераміду C26, як паказана на малюнку 26, ён пераважна ўключае GPI-якар з невялікай колькасці кераміду C26 у штаме GhLag1. S2 (29). Тым не менш, клеткавая мембрана GhLag1 у асноўным змяшчае толькі керамід C18-C16, у той час як Gas1-GFP усё яшчэ змяшчае керамід C26. Гэты факт робіць гэты штам ідэальным інструментам для канкрэтнага вырашэння праблемы даўжыні ацыльнага ланцуга мембраннага кераміду ў ЭР. Гіпатэтычная роля класа і сартавання. Затым мы спачатку вывучылі здольнасць C26 Gas1-GFP назапашвацца ў кластарах у GhLag1 з тэмпературна-адчувальным мутантным алелем sec31-1 з дапамогай звычайнай флуарэсцэнтнай мікраскапіі, дзе ў цэрамідзе мембраны ЭР існуе толькі доўгі (C18-C16) ланцуг (мал. 3). Мы назіралі, што ў sec31-1 большая частка Gas1-GFP была сканцэнтравана ў кластарах, у той час як Gas1-GFP у sec31-1 GhLag1 з доўгай (C18-C16) цэраміднай мембранай ЭР у асноўным не быў кластарызаваны і размеркаваны па ўсёй мембране ЭР. Калі быць дакладным, паколькі кластарызацыя на аснове цэраміду C26 цесна звязана са спецыфічным ERES (малюнак 1), мы далей даследавалі, ці можа гэты працэс таксама ўключаць функцыю механізму экспартнага бялку ЭР. GPI-AP выкарыстоўвае спецыяльную сістэму COPII для экспарту ЭР, якая актыўна рэгулюецца структурнай перабудовай гліканавай часткі GPI-якара Ted1 (30, 31). Рэкамбінантны GPI-глікан затым распазнаецца трансмембранным комплексам карго-рэцэптара p24, які, у сваю чаргу, селектыўна рэкрутуе Lst1, які з'яўляецца спецыфічнай ізаформай асноўнай карго-звязальнай субадзінкі COPII Sec24, утвараючы багаты на GPI-AP COPII. Неабходныя везікулы (31-33). Такім чынам, мы сканструявалі двайны мутант, які спалучае дэлецыю гэтых адзінкавых бялкоў (кампанент комплексу p24 Emp24, фермент Ted1, які рэмадэлюе GPI-глікан, і спецыфічную субадзінку COPII Lst1) з мутантным штамам sec31-1, і вывучылі іх. Ці магчыма ўтварэнне Gas1-кластарнага GFP (Малюнак 3). Мы назіралі, што ў sec31-1emp24Δ і sec31-1ted1Δ Gas1-GFP у асноўным некластараваны і размеркаваны па ўсёй мембране ER, як гэта назіралася раней у sec31-1 GhLag1, у той час як у sec31-1lst1Δ Gas1-GFP падобны на sec31-1. Гэтыя вынікі паказваюць, што акрамя прысутнасці кераміду C26 у мембране ЭР, кластарызацыя Gas1-GFP таксама павінна звязвацца з комплексам p24 і не патрабуе спецыфічнага рэкрутавання Lst1. Затым мы даследавалі магчымасць таго, што даўжыня ланцуга кераміду ў мембране ЭР можа рэгуляваць звязванне Gas1-GFP з p24. Аднак мы выявілі, што прысутнасць кераміду C18-C16 у мембране не ўплывае на GPI-гліканы, рэканструяваныя комплексам p24 (малюнкі S3 і S4, A і B), або на звязванне з GPI-AP і здольнасць экспартаваць GPI-AP. Рэкрутаваць падтып COPII Lst1 (малюнак S4C). Такім чынам, кластарызацыя, залежная ад кераміду C26, не патрабуе ўзаемадзеяння бялкоў з рознымі механізмамі экспарту бялкоў ЭР, але падтрымлівае альтэрнатыўны механізм сартавання, які залежыць ад даўжыні ліпідаў. Затым мы прааналізавалі, ці важная даўжыня ацыльнага ланцуга кераміду ў мембране ЭР для эфектыўнай класіфікацыі Gas1-GFP як селектыўнага ERES. Паколькі Gas1 у штаме GhLag1 з кароткаланцуговым керамідам пакідае ЭР і трапляе ў плазматычную мембрану (малюнак S5), мы лічым, што калі сартаванне абумоўлена даўжынёй ацыльнага ланцуга кераміду, Gas1 у штаме GhLag1 можа быць перанакіраваны і скрыжаваны. ERES-тавары з той жа мембранай.
(A) Клетачная мембрана GhLag1 у асноўным змяшчае карацейшыя кераміды C18-C16, у той час як GPI-якар Gas1-GFP усё яшчэ мае той жа C26 IPC, што і клеткі дзікага тыпу. Вышэй: аналіз даўжыні ацыльнага ланцуга кераміду ў клеткавай мембране штамаў дзікага тыпу (Wt) і GhLag1p з дапамогай мас-спектрометрыі (MS). Дадзеныя прадстаўляюць працэнт ад агульнага кераміду. Сярэдняе значэнне трох незалежных эксперыментаў. Палоска памылкі = SD. Двухбаковы няпарны t-крытэрый. **** P <0,0001. Ніжняя панэль: MS-аналіз даўжыні ацыльнага ланцуга IPC, прысутнага ў GPI-якары Gas1-GFP (GPI-IPC), экспрэсаваным у штамах дзікага тыпу і GhLag1p. Дадзеныя прадстаўляюць працэнт ад агульнага сігналу IPC. Сярэдняе значэнне пяці незалежных эксперыментаў. Палоска памылкі = SD. Двухбаковы няпарны t-крытэрый. ns, не важна. P = 0,9134. (B) Флуарэсцэнтныя мікрафатаграфіі клетак sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ і sec31-1lst1Δ, якія экспрэсуюць індукаваны галактозай Gas1-GFP, інкубавалі пры тэмпературы 37°C на працягу 30 хвілін і перадавалі на руцінную флуарэсцэнтную мікраскапію пасля 24°C. Белая стрэлка: кластар Gas1-GFP ЭР. Пустая стрэлка: некластарны Gas1-GFP размеркаваны па ўсёй мембране ЭР, паказваючы характэрнае для ЭР афарбоўванне ядзернага кольца. Маштабная лінейка, 5 мкм. (C) Колькасная ацэнка фотамікрафатаграфіі, апісанай у (B). Сярэдні працэнт клетак з кропкавай структурай Gas1-GFP. У трох незалежных эксперыментах n ≥ 300 клетак. Палоска памылкі = SD. Двухбаковы няпарны t-крытэрый. **** P < 0,0001.
Каб непасрэдна вырашыць гэтую праблему, мы правялі SCLIM-візуалізацыю Gas1-GFP і Mid2-iRFP у GhLag1 з тэмпературна-адчувальным мутантным алелем sec31-1 (малюнак 4 і фільм S4). Пасля таго, як ER быў захаваны пры тэмпературы 37°C і пасля гэтага вызвалены пры 24°C, большая частка нядаўна сінтэзаванага Gas1-GFP не была кластарызавана і размеркавана па ўсёй мембране ER, як назіралася з дапамогай звычайных мікраскопаў (малюнак 4, A і B). Акрамя таго, вялікі працэнт ERES (67%) уключае два тыпы грузаў, размешчаных разам у ім (малюнак 4D). Панэлі 1 і 2 малюнка 4C паказваюць два тыповыя прыклады ERES з перакрываючыміся Gas1-GFP і Mid2-GFP. Акрамя таго, абодва тавары былі рэкрутаваны ў адзін і той жа ERES (малюнак 4E, панэль 3 і фільм S4). Такім чынам, нашы вынікі паказваюць, што даўжыня кераміднага ацыльнага ланцуга ў мембране ER з'яўляецца важным фактарам, які вызначае агрэгацыю і класіфікацыю бялкоў ER.
Клеткі Sec31-1 GhLag1, якія экспрэсуюць галактоза-індукаваныя сакрэты, Gas1-GFP (GPI-AP, зялёны) і Mid2-iRFP (TMP, сіні) і канстытутыўны ERES-мечаны Sec13-mCherry (ERES, пурпурны). Інкубуйце пры тэмпературы 37°C. Працягвайце на працягу 30 хвілін, панізьце тэмпературу да 24°C для вызвалення сакрэтаў і праз 20 хвілін візуалізуйце з дапамогай SCLIM. (А-С) Тыповыя 2D-праекцыйныя выявы (А; маштабная паласа, 1 мкм) або 3D-выявы паўсфер клетак (B і C; адзінка маштабу, 0,45 мкм) 10 z-зрэзаў, пазначаных грузам і ERES. Ніжняя панэль у (B) і панэль у (C) адлюстроўваюць апрацаваныя выявы для адлюстравання толькі тавараў, прысутных у ERES (пурпурны) [Gas1-GFP (шэры) і Mid2-iRFP (светла-блакітны)]. (C) Белая стрэлка: ERES, тавары перакрываюцца. Адкрытая стрэлка: ERES змяшчае толькі адзін элемент. Ніжняя панэль: Выбраны ERES мае перакрываючыяся тавары (1 і 2), пазначаныя ў (C). Маштабная лінейка, 100 нм. (D) Колькасная ацэнка мікрафатаграфіі, апісанай у (C). У адзінках sec31-1 і sec31-1 GhLag1 уключаны толькі адзін груз (Gas1-GFP або Mid2-iRFP), а таксама сярэдні працэнт ERES для ізаляванага грузу і грузу, які перакрываецца. У трох незалежных эксперыментах n = 432 у 54 клетках (sec31-1) і n = 430 у 47 клетках (sec31-1 GhLag1). Палоска памылкі = SD. Двухбаковы няпарны t-крытэрый. *** P = 0,0002 (sec31-1) і ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Трохмерная выява выбранага ERES з перакрываючымся грузам (3), пазначаным у (C). Gas1-GFP (зялёны) і Mid2-iRFP (сіні) набліжаюцца да ERES (пурпурны) з аднаго боку і застаюцца ў адной і той жа абмежаванай ERES зоне. Маштабная лінейка, 100 нм.
Гэта даследаванне дае прамыя доказы in vivo таго, што бялковыя грузы на аснове ліпідаў класіфікуюцца па селектыўных сайтах экспарту ў сакрэторным шляху, і раскрывае важнасць даўжыні ацыльнага ланцуга для селектыўнасці класіфікацыі. Выкарыстоўваючы магутную і перадавую тэхніку мікраскапіі пад назвай SCLIM, мы прадэманстравалі нядаўна сінтэзаваны Gas1-GFP (асноўны GPI-AP плазматычнай мембраны з вельмі доўгай ацыльнай ланцугом (C26) кераміднай ліпіднай часткай) у дрожджах. Вобласці, кластарныя ў дыскрэтных ER, звязаны са спецыфічнымі ERES, у той час як трансмембранныя сакрэтуемыя бялкі размеркаваны па ўсёй мембране ER (Малюнак 1). Акрамя таго, гэтыя два тыпы тавараў селектыўна трапляюць у розныя ERES (Малюнак 2). Даўжыня ацыльнага ланцуга клеткавага кераміду ў мембране скарачаецца з C26 да C18-C16, кластар Gas1-GFP парушаецца ў дыскрэтную вобласць ER, і Gas1-GFP перанакіроўваецца, каб пакінуць ER з трансмембранным бялком праз той жа ERES (Малюнак 3 і Малюнак 3). 4).
Нягледзячы на ​​тое, што GPI-AP выкарыстоўвае спецыялізаваны бялковы механізм для выхаду з ERES, мы выявілі, што залежнае ад цэраміду падзел C26 не абапіраецца на дыферэнцыяльныя бялковыя ўзаемадзеянні, якія могуць прывесці да спецыялізацыі ERES (малюнкі S4 і S5). Замест гэтага, нашы высновы пацвярджаюць альтэрнатыўны механізм класіфікацыі, які абумоўлены кластарызацыяй бялкоў на аснове ліпідаў і наступным выключэннем іншых грузаў. Нашы назіранні паказваюць, што ў вобласці або кластары Gas1-GFP, звязаным са спецыфічным ERES, адсутнічае трансмембранны сакрэтуемы бялок Mid2-iRFP, што сведчыць аб тым, што залежны ад цэраміду кластар GPI-AP C26 будзе спрыяць іх уваходу ў адпаведны ERES і адначасова выключаць трансмембранныя сакрэты. Сакрэты трапляюць у гэты канкрэтны ERES (малюнкі 1 і 2). Наадварот, прысутнасць цэрамідаў C18-C16 у мембране ER не прыводзіць да ўтварэння абласцей або кластараў GPI-AP, таму яны не выключаюць і не замяняюць трансмембранныя сакрэтуемыя бялкі ў тым жа ERES (малюнкі 3 і 4). Такім чынам, мы мяркуем, што керамід C26 стымулюе падзел і класіфікацыю, спрыяючы кластэрызацыі бялкоў, звязаных са спецыфічнымі ERES.
Як дасягнуць гэтай кластэрызацыі, залежнай ад кераміду C26, у пэўнай вобласці ЭР? Тэндэнцыя мембраннага кераміду да латэральнага падзелу можа прывесці да таго, што GPI-AP і керамід C26 утвараюць невялікія і імгненна ўпарадкаваныя ліпіды ў больш нерэгулярным ліпідным асяроддзі мембраны ЭР, якія змяшчаюць больш кароткія і ненасычаныя гліцэрыналіпіды. Якасныя кластары (17, 18). Гэтыя невялікія часовыя кластары могуць быць далей аб'яднаны ў больш буйныя, больш стабільныя кластары пасля звязвання з комплексам p24 (34). У адпаведнасці з гэтым мы паказалі, што C26 Gas1-GFP павінен узаемадзейнічаць з комплексам p24 для ўтварэння больш буйных бачных кластараў (Малюнак 3). Комплекс p24 - гэта гетэразіготны алігамер, які складаецца з чатырох розных трансмембранных бялкоў p24 у дрожджах (35), які забяспечвае шматвалентнае звязванне, што можа прывесці да зшывання невялікіх кластараў GPI-AP, тым самым ствараючы большы стабільны кластар (34). Узаемадзеянне паміж бялковымі эктадаменамі GPI-AP таксама можа спрыяць іх агрэгацыі, як паказана падчас іх транспарту ў апарате Гольджы ў палярызаваных эпітэліяльных клетках млекакормячых (36). Аднак, калі ў мембране ЭР прысутнічае керамід C18-C16, і комплекс p24 звязваецца з Gas1-GFP, вялікія асобныя кластары не ўтвараюцца. Асноўны механізм можа залежаць ад канкрэтных фізічных і хімічных уласцівасцей кераміду з доўгім ацыльным ланцугом. Біяфізічныя даследаванні штучных мембран паказваюць, што, хоць як доўгія (C24), так і кароткія (C18-C16) кераміды з ацыльным ланцугом могуць выклікаць фазавае падзеленне, толькі доўгія ацыльныя кераміды (C24) могуць спрыяць высокай крывізне і выгібу плёнкі для змены яе формы. Дзякуючы ўзаемнай спасылцы (17, 37, 38). Было паказана, што трансмембранная спіраль TMED2, чалавечага гомолага Emp24, селектыўна ўзаемадзейнічае са сфінгаміэлінам на аснове кераміду C18 у цытаплазматычных дзельках (39). Выкарыстоўваючы малекулярна-дынамічнае (МД) мадэляванне, мы выявілі, што як цэраміды C18, так і C26 назапашваюцца вакол цытаплазматычных долек трансмембраннай спіралі Emp24, і яны маюць падобныя перавагі (малюнак S6). Варта адзначыць, што гэта сведчыць аб тым, што трансмембранная спіраль Emp24 можа прыводзіць да асіметрычнага размеркавання ліпідаў у мембране. Гэта нядаўні вынік, заснаваны на клетках млекакормячых. Падобныя МД-мадэляванні таксама паказваюць наяўнасць эфірных ліпідаў (40). Такім чынам, мы мяркуем, што цэрамід C26 у дзвюх долях ER26 лакальна ўзбагачаны. Калі GPI-AP у прасветных долях непасрэдна звязваецца з шматвалентным p24 і назапашваннем цэраміду C26 вакол p24 у цытаплазматычных долях, гэта можа спрыяць суправаджальнай агрэгацыі бялкоў і крывізне мембраны, якія ўзнікаюць праз пальцы (41), што прыводзіць да падзелу GPI-AP на асобныя вобласці, прылеглыя да ERES, што таксама спрыяе моцна выгнутым абласцям мембраны ER (42). Папярэднія паведамленні пацвярджалі прапанаваны механізм (43, 44). Шматвалентнае звязванне алігалектынаў, патагенаў або антыцелаў з глікасфінгаліпідамі на аснове цэраміду (GSL) на плазматычнай мембране выклікае значную агрэгацыю GSL, паляпшае фазавае падзеленне і выклікае дэфармацыю і інтэрналізацыю мембраны (44). Івабучы і г.д. (43) Было выяўлена, што ў прысутнасці доўгіх (C24), але не кароткіх (C16) ацыльных ланцугоў, шматвалентны ліганд, звязаны з лактазілцэрамідам GSL, выклікаў утварэнне вялікіх кластараў і інвагінацыю мембраны, а цытаплазма Lyn-апасродкаваная сігнальная трансдукцыя на створках пераплятаецца ацыльнымі ланцугамі ў спалучаных нейтрофілах.
У палярызаваных эпітэліяльных клетках млекакормячых канцэнтрацыя анты-Гольджы сеткі (TGN) да ўзроўню апікальнай плазматычнай мембраны кантралюе падзел і сартаванне GPI-AP (10, 45). Гэтая агрэгацыя абумоўлена алігамерызацыяй GPI-AP (36), але яна таксама можа залежаць ад даўжыні цэраміднага ланцуга, які мы знаходзім у дрожджах. Нягледзячы на ​​тое, што GPI-AP млекакормячых мае якар на аснове эфірнага ліпіда, і яго хімічная структура вельмі адрозніваецца ад вельмі доўгага ацыльнага ланцуга цэраміду, нядаўняе даследаванне паказала, што абодва ліпіды маюць эвалюцыйна падобныя фізічныя і хімічныя ўласцівасці і функцыі (40). Такім чынам, частка эфірнага ліпіда ў клетках млекакормячых можа быць падобная да C26 цэраміду ў дрожджах, і яго роля заключаецца ў асацыяцыі з доўгаланцуговым цэрамідам у мембране для садзейнічання агрэгацыі і сартаванню GPI-AP. Хоць гэтая магчымасць яшчэ патрабуе непасрэднага тэставання, папярэднія вынікі пацвярджаюць, што транспарт доўгага ацыльнага ланцуга цэраміду да цела Гольджы не ажыццяўляецца цытаплазматычнымі транспартнымі бялкамі, а залежыць ад сінтэзу GPI-якарных элементаў, як у дрожджаў. Такім чынам, эвалюцыйна кансерватыўны механізм, відаць, здольны селектыўна сумесна транспартаваць керамід з вельмі доўгім ацыльным ланцугом і GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) у адным транспартным везікуле.
У сістэмах палярызаваных эпітэліяльных клетак дрожджаў і млекакормячых агрэгацыя і аддзяленне GPI-AP ад іншых бялкоў плазматычнай мембраны адбываюцца да дасягнення паверхні клеткі. Паладына і інш. (48) выявілі, што на TGN палярызаваных эпітэліяльных клетак млекакормячых кластарызацыя GPI-AP неабходная не толькі для селектыўнай класіфікацыі GPI-AP на апікальнай плазматычнай мембране, але і рэгулюе арганізацыю кластараў GPI-AP і іх біялагічную актыўнасць. Паверхня клеткі. У дрожджаў гэта даследаванне паказала, што залежны ад кераміду C26 кластар GPI-AP на ER можа рэгуляваць арганізацыю кластараў і функцыянальную актыўнасць GPI-AP на плазматычнай мембране (24, 49). У адпаведнасці з гэтай мадэллю, клеткі GhLag1 маюць алергію на інгібітары GPI або прэпараты, якія ўплываюць на цэласнасць клеткавай сценкі (28), і неабходнасць функцыянальных кластараў Gas1-GFP (49) кончыкавага кераміду, які праецыруецца пры спарванні дрожджавых клетак, паказвае на G​​​ Магчымыя фізіялагічныя наступствы клетак hLag1. Памылка GPI-AP. Аднак далейшае даследаванне таго, ці была функцыянальная арганізацыя паверхні клеткі запраграмавана з ЭР метадам сартавання на аснове даўжыні ліпідаў, стане прадметам нашых будучых даследаванняў.
Штамы Saccharomyces cerevisiae, выкарыстаныя ў гэтай працы, пералічаны ў табліцы S1. Штамы MMY1583 і MMY1635 штама SCLIM для візуалізацыі жывых клетак былі сканструяваны на фоне W303. Гэтыя штамы, якія экспрэсуюць Sec13-mCherry з флуарэсцэнтнай бялковай меткай, былі сканструяваны з выкарыстаннем метаду на аснове палімеразнай ланцуговай рэакцыі (ПЛР) з плазмідай pFA6a ў якасці матрыцы (23). Штам, які экспрэсуе Mid2-iRFP, пазначаны флуарэсцэнтным бялком пад кантролем прамотара GAL1, быў сканструяваны наступным чынам. ПЦР-ампліфікацыя паслядоўнасці iRFP-KanMx з вектара pKTiRFP-KAN (падарунак Э. О'Шы, плазміда Addgene нумар 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ідэнтыфікатар даследчага рэсурсу (RRID): Addgene_64687) і ўстаўлена ў С-канец эндагеннага Mid2. Пасля таго, як паслядоўнасць геному Mid2-iRFP была ампліфікавана і кланавана ў прамотар GAL1, яна была інтэгравана ў сайт Not I-Sac I інтэграцыйнай плазміды pRS306. Атрыманая плазміда pRGS7 была лінеарызавана з дапамогай Pst I для інтэграцыі ў локус URA3.
Ген зліцця Gas1-GFP экспрэсуецца пад кантролем прамотара GAL1 у плазмідзе цэнтрамеры (CEN), якая сканструявана наступным чынам. Паслядоўнасць Gas1-GFP была ампліфікавана з дапамогай ПЛР з плазміды pRS416-GAS1-GFP (24) (падарунак ад L. Popolo) і кланавана ў сайт Xma I–Xho I плазміды CEN pBEVY-GL LEU2 (падарунак ад C). Miller; нумар плазміды Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Атрыманая плазміда была названа pRGS6. Ген зліцця Axl2-GFP таксама экспрэсуецца пад кантролем прамотара GAL1 вектара pBEVY-GL LEU2, і яе канструкцыя наступная. Паслядоўнасць Axl2-GFP была ампліфікавана з плазміды pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) з дапамогай ПЛР і кланавана ў сайт Bam HI-Pst I вектара pBEVY-GL LEU2. Атрыманая плазміда была названа pRGS12. Паслядоўнасць алігануклеатыдаў, выкарыстаных у гэтым даследаванні, прыведзена ў табліцы S2.
Штам быў дапоўнены 0,2% адэнінам і 2% глюкозай [YP-дэкстроза (YPD)], 2% рафінозай [YP-рафіноза], багатым на экстракт дрожджаў бялком p (YP) асяроддзем (1% экстракта дрожджаў і 2% бялку ept). (YPR)] або 2% галактозай [YP-галактоза (YPG)] у якасці крыніцы вугляроду, або сінтэтычным мінімальным асяроддзем (0,15% азоцістай асновы дрожджаў і 0,5% сульфату амонію) для дапаўнення адпаведных амінакіслот і асноў, неабходных для харчавання, і які змяшчае 2% глюкозы (сінтэтычнае мінімальнае асяроддзе з глюкозай) або 2% галактозы (сінтэтычнае мінімальнае асяроддзе з галактозай) у якасці крыніцы вугляроду.
Для візуалізацыі ў рэжыме рэальнага часу тэмпературна-адчувальныя мутантныя клеткі sec31-1, якія экспрэсуюць канструкт пад прамотарам GAL1, вырошчвалі ў асяроддзі YPR пры тэмпературы 24°C на працягу ночы да сярэдзіны лагарыфмічнай фазы. Пасля індукцыі ў YPG пры 24°C на працягу 1 гадзіны клеткі інкубавалі ў SG пры тэмпературы 37°C на працягу 30 хвілін, а затым пераносілі ў тэмпературу 24°C для вызвалення ад сакрэтнага блока. Канаваналін А выкарыстоўвалі для фіксацыі клетак на прадметным шкле і візуалізавалі з дапамогай SCLIM. SCLIM — гэта камбінацыя інвертаванага флуарэсцэнтнага мікраскопа Olympus IX-71 і алейнай лінзы UPlanSApo 100×1.4 з лікавай апертурай (Olympus), высакахуткаснага канфакальнага сканера з круцільным дыскам і высокім суадносінамі сігнал/шум (Yokogawa Electric), спецыяльнага спектрометра і спецыяльнай сістэмы астуджэння. Узмацняльнік выявы сістэмы (Hamamatsu Photonics) можа забяспечыць сістэму павелічальных лінзаў з канчатковым павелічэннем ×266.7 і камеру з зарадавай сувяззю, якая памнажае электроны (Hamamatsu Photonics) (21). Атрыманне выявы выконваецца з дапамогай спецыяльнага праграмнага забеспячэння (Yokogawa Electric). Для трохмерных выяў мы выкарыстоўвалі спецыяльна распрацаваны п'езаэлектрычны прывад для вертыкальнай вібрацыі аб'ектыва і збіралі аптычныя часткі на адлегласці 100 нм адна ад адной у стос. Z-стэкаванае выява пераўтвараецца ў трохмерныя воксельныя дадзеныя, і тэарэтычная функцыя рассейвання кропак, якая выкарыстоўваецца для канфакальнага мікраскопа з круцільным дыскам, выкарыстоўваецца для апрацоўкі дэканвалюцыі з дапамогай праграмнага забеспячэння Volocity (PerkinElmer). З дапамогай праграмнага забеспячэння Volocity для аўтаматычнага вызначэння парога для аналізу сумеснага размяшчэння былі вымераны ERES, уключаючы груз. Аналіз лінейнага сканавання быў выкананы з дапамогай праграмнага забеспячэння MetaMorph (Molecular Devices).
Для вызначэння статыстычнай значнасці выкарыстоўвайце праграмнае забеспячэнне GraphPad Prism. Для двухбаковага t-крытэрыя Стьюдэнта і звычайнага аднафактарнага дысперсійнага аналізу (ANOVA) адрозненні паміж групамі лічацца істотнымі ўплывамі на P <0,05 (*).
Для флуарэсцэнтнай мікраскапіі Gas1-GFP клеткі лагарыфмічнай фазы вырошчвалі на працягу ночы ў YPD і збіралі шляхам цэнтрыфугавання, двойчы прамывалі фасфатна-буферным фізіялагічным растворам і інкубавалі на лёдзе не менш за 15 хвілін, а затым даследавалі пад мікраскопам, як апісана раней (24). Для атрымання дадзеных выкарыстоўваўся мікраскоп Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), абсталяваны аб'ектывам, фільтрам L5 (GFP), камерай Hamamatsu і праграмным забеспячэннем Application Suite X (LAS X).
Узоры дэнатуравалі буферам для SDS-проб пры тэмпературы 65°C на працягу 10 хвілін, а затым падзялілі з дапамогай SDS-поліакрыламіднага гелевага электрафарэзу (PAGE). Для імунаблотынгу на кожную паласу загружалі 10 мкл узору. Першасныя антыцелы: выкарыстоўвалі трусіныя полікланальныя антыцелы супраць Gas1 у развядзенні 1:3000, трусіныя полікланальныя антыцелы супраць Emp24 у развядзенні 1:500 і трусіныя полікланальныя антыцелы супраць GFP (падарунак ад H. Riezman) у развядзенні 1:3000. Мышыныя моноклональные антыцелы супраць Pgk1 выкарыстоўвалі ў развядзенні 1:5000 (падарунак ад J. de la Cruz). Другасныя антыцелы: кан'югаваныя з пераксідазай хрэну (HRP) казіны антыцелы супраць трусінага імунаглабуліну G (IgG) у развядзенні 1:3000 (Pierce). Кан'югаваныя з HRP казіны антыцелы супраць мышыных IgG выкарыстоўвалі ў развядзенні 1:3000 (Pierce). Зона імуннага адказу назіралася метадам хемілюмінесцэнцыі з выкарыстаннем рэагента SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Як апісана ў (31), быў праведзены эксперымент па натуральнай імунапрэцыпітацыі на ўзбагачанай фракцыі ER. Карацей кажучы, клеткі дрожджаў прамылі буферам TNE [50 мМ трыс-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенілметылсульфанілфтарыду і сумессю інгібітараў пратэаз) пры 600 нм (OD600) пры аптычнай шчыльнасці 100 двойчы. Яго разбілі шклянымі шарыкамі, а затым рэшткі клетак і шкляныя шарыкі выдалілі цэнтрыфугаваннем. Затым супернатант цэнтрыфугавалі пры 17 000 g на працягу 15 хвілін пры 4°C. Асадак рэсуспендавалі ў TNE і дадалі дыгіталісавы сапанін да канчатковай канцэнтрацыі 1%. Суспензію інкубавалі на працягу 1 гадзіны пры кручэнні пры 4°C, а затым нерастваральныя кампаненты выдалілі цэнтрыфугаваннем пры 13 000 g пры 4°C на працягу 60 хвілін. Для імунапрэцыпітацыі Gas1-GFP спачатку інкубуйце ўзор з пустымі агарознымі шарыкамі (ChromoTek) пры 4°C на працягу 1 гадзіны, а затым інкубуйце з GFP-Trap_A (ChromoTek) пры 4°C на працягу 3 гадзін. Імунапрэцыпітаваныя шарыкі пяць разоў прамывалі TNE, які змяшчае 0,2% дыгаксігеніну, элюіравалі буферам для ўзораў SDS, аддзялялі на SDS-PAGE і аналізавалі з дапамогай імунаблотынгу.
Як апісана ў (31), вызначэнне зшывання было праведзена на ўзбагачанай фракцыі ЭР. Карацей кажучы, узбагачаная фракцыя ЭР інкубавалася з 0,5 мМ дытыбіс(сукцынімідылпрапіянату) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Рокфард, Ілінойс, ЗША; 20°C, 20 хвілін). Рэакцыю зшывання спынялі даданнем гліцыну (канчатковая канцэнтрацыя 50 мМ, 5 хвілін, 20°C).
Як апісана раней (50), быў праведзены МС-аналіз цэраміду ў штамах дзікага тыпу і GhLag1. Карацей кажучы, клеткі вырошчвалі да экспанентнай фазы (ад 3 да 4 адзінак OD600/мл) у YPD пры 30°C, і збіралі 25×107 клетак. Іх метабалізм спынялі трыхларуксуснай кіслатой. Выкарыстоўвалі экстрактарны растваральнік [этанол, вада, эфір, пірыдын і 4,2 ​​N гідраксід амонію (15:15:5:1:0,018 аб./аб.)] і 1,2 нмоль унутранага стандарту C17 цэраміду (860517, Avanti polar lipid) якасці). Выкарыстоўвалі монаметыламінавы рэагент [метанол, вада, н-бутанол і раствор метыламіну (4:3:1:5 аб./аб.)] для правядзення мяккага шчолачнага гідролізу экстракта, а затым выкарыстоўвалі насычаны вадой н-бутанол для дэсалявання. Нарэшце, экстракт рэсуспендавалі ў станоўчым рэжыме растваральніку [хлараформ/метанол/вада (2:7:1) + 5 мМ ацэтату амонія] і ўвялі ў мас-спектрометр. Для ідэнтыфікацыі і колькаснага вызначэння малекул сфінгаліпідаў быў праведзены маніторынг некалькіх рэакцый (MRM). Троесны квадрупольны мас-спектрометр TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) абсталяваны рабатызаванай крыніцай іонаў нанапатоку Nanomate HD (Advion Biosciences, Ітака, Нью-Ёрк) для аналізу ліпідаў. Энергія сутыкнення аптымізавана для кожнай катэгорыі цэрамідаў. Дадзеныя MS былі атрыманы ў станоўчым рэжыме. Для кожнага біялагічнага паўтарэння ліпідны сігнал з'яўляецца медыянай трох незалежных вымярэнняў.
Як апісана ў (31), клеткі (800×107), якія экспрэсуюць Gas1-GFP, падвяргалі натуральнай імунапрэцыпітацыі. Ачышчаны Gas1-GFP аддзялялі з дапамогай SDS-PAGE і пераносілі на мембрану з полівінілідэнфтарыду (PVDF). Бялок візуалізавалі шляхам афарбоўвання PVDF амідным чорным. Паласа Gas1-GFP была выразана з PVDF і прамыта 5 разоў метанолам і адзін раз вадой класа вадкаснай храматаграфіі-MS (LC-MS). Інкубацыя мембраннай палоскі з 500 мкл 0,3 М NaOAc (pH 4,0), буферам і 500 мкл свежарастворанай 1 М сумесі нітрыту натрыю пры тэмпературы 37°C на працягу 3 гадзін прыводзіць да вызвалення ліпіднай фракцыі з Gas1-GFP і лізіравання кераміду фасфату інозіну паміж глюказамінам і іназітолам (51). Пасля гэтага мембранную палоску чатыры разы прамывалі вадой класа LC-MS, сушылі пры пакаёвай тэмпературы і захоўвалі ў атмасферы азоту пры тэмпературы -80°C да аналізу. У якасці кантролю для кожнага эксперыменту выкарыстоўваўся халасты ўзор мембраны PVDF. Ліпід, экстрагаваны з Gas1-GFP, затым аналізаваўся з дапамогай мас-спектрометрыі (MS), як апісана (50). Карацей кажучы, палоскі PVDF, якія змяшчалі GPI-ліпід, рэсуспендавалі ў 75 мкл адмоўнага растваральніка для цвілі [хлараформ/метанол (1:2) + 5 мМ ацэтату амонія] і прайшлі аналіз сфінгаліпідных відаў з дапамогай электрараспыляльнай іанізацыі (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). У гэтым выпадку дадзеныя MS былі атрыманы ў рэжыме адмоўных іонаў.
Як ужо згадвалася раней, ліпідная частка GPI-якара была аддзелена ад GPI-AP, мечанага [3H]-іназітолам (16). Ліпіды былі аддзелены з дапамогай тонкаслаёвай храматаграфіі з выкарыстаннем сістэмы растваральнікаў (55:45:10 хлараформ-метанол-0,25% KCl) і візуалізаваны з дапамогай FLA-7000 (Fujifilm).
Клеткі, якія экспрэсуюць Gas1-GFP (600×107), двойчы прамывалі буферам TNE і разбівалі шклянымі шарыкамі, а затым цэнтрыфугавалі для выдалення клетачных рэшткаў і шкляных шарыкаў. Затым супернатант цэнтрыфугавалі пры 17 000 g на працягу 1 гадзіны пры 4°C. Асадак прамывалі ў TNE і інкубавалі з 1 адзінкай PI-PLC (Invitrogen) у TNE, які змяшчае 0,2% дыгіталісавага сапаніна, на працягу 1 гадзіны пры 37°C. Пасля апрацоўкі ферментамі мембрану выдалялі цэнтрыфугаваннем пры 17 000 g пры 4°C на працягу 1 гадзіны. Для імунапрэцыпітацыі Gas1-GFP супернатант інкубавалі з GFP-Trap_A (ChromoTek) пры 4°C на працягу ночы. Ачышчаны Gas1-GFP, аддзелены з дапамогай SDS-PAGE, афарбоўвалі бліскучым сінім Кумасі. Паласа афарбоўвання Gas1-GFP была адрэзана ад шэрага колеру вакол акведука, а затым, пасля алкілавання ёдаацетамідам і аднаўлення дытыятрэйтолам, было праведзена гелевае пераварванне трыпсінам. Трыпсінавыя пептыды і пептыды з GPI-гліканамі былі экстрагаваныя і высушаныя. Высушаны пептыд быў раствараны ў 20 мкл вады. Порцыя (8 мкл) уведзена ў вадкі хроматограф. Для падзелу пептыдаў у пэўных градыентных умовах выкарыстоўвалася калона з актадэцылсіланам (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; унутраны дыяметр 150 мм × 1,0 мм; Nomura Chemical, прэфектура Айці, Японія). Рухомай фазай былі растваральнікі А (0,08% мурашынай кіслаты) і В (0,15% мурашынай кіслаты ў 80% ацэтанітрыле). Для элюцыі калонкі растваральнікам А на працягу 55 хвілін пры хуткасці патоку 50 мкл/мін-1 на працягу 5 хвілін выкарыстоўвалі сістэму ВЭЖХ Accela (Thermo Fisher Scientific, Бостан, Масачусэтс), а затым канцэнтрацыю растваральніка B павялічылі да 40%. Элюат бесперапынна ўводзілі ў крыніцу іонаў ESI, і трыптычныя пептыды і пептыды з GPI-гліканамі аналізавалі з дапамогай LTQ Orbitrap XL (гібрыдны мас-спектрометр з лінейнай іоннай пасткай-арбітрапай; Thermo Fisher Scientific). У MS-ўсталёўцы напружанне капілярнай крыніцы было ўстаноўлена на ўзроўні 4,5 кВ, а тэмпература пераноснага капіляра падтрымлівалася на ўзроўні 300°C. Напружанне на капіляры і напружанне на лінзе трубкі былі ўстаноўлены на ўзроўні 15 В і 50 В адпаведна. Дадзеныя МС былі атрыманы ў рэжыме станоўчых іёнаў (разрозненне 60 000; дакладнасць масы 10 частак на мільён) у дыяпазоне мас 300/m/z пры суадносінах маса/зарад (m/z) 3000. Дадзеныя МС/МС атрымліваюцца праз іённую пастку ў LTQ Orbitrap XL [першыя 3 лічбы, ад якіх залежаць даныя, дысацыяцыя, выкліканая сутыкненнем (CID)].
МД-мадэляванне было выканана з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння GROMACS (52) і сілавога поля MARTINI 2 (53-55). Затым для пабудовы біслоя, які змяшчае дыолеоілфасфатыдылхалін (DOPC) і Cer C18 або DOPC і Cer C26, быў выкарыстаны Membrane Builder (56, 57) з графічнага інтэрфейсу CHARMM. Тапалогія і каардынаты Cer C26 атрымліваюцца з DXCE шляхам выдалення лішніх шарыкаў з хваста сфінгазіну. Выкарыстоўвайце апісаны ніжэй працэс для балансавання падвойнага слоя і яго запуску, затым выкарыстоўвайце апошнія каардынаты сістэмы для пабудовы сістэмы, якая змяшчае Emp24. Трансмембранны дамен дрожджаў Emp24 (рэшткі 173-193) быў пабудаваны ў выглядзе α-спіралі з выкарыстаннем інструмента візуальнай МД (VMD) для малекулярнай структуры (58). Затым, пасля выдалення перакрываючыхся ліпідаў, бялок быў груба грануляваны і ўстаўлены ў біслой з выкарыстаннем графічнага інтэрфейсу CHARMM. Канчатковая сістэма змяшчае 1202 DOPC і 302 Cer C26 або 1197 DOPC і 295 Cer C18 і Emp24. Іанізуйце сістэму да канцэнтрацыі 0,150 М. Для двух двухслаёвых кампазіцый былі зроблены чатыры незалежныя паўторы.
Ліпідны біслой балансуецца з дапамогай працэсу CHARMM GUI, які ўключае мінімізацыю, а затым балансаванне 405 000 крокаў, дзе абмежаванні пазіцыі паступова памяншаюцца і ліквідуюцца, а крок па часе павялічваецца з 0,005 пс да 0,02 пс. Пасля ўраўнаважвання ён стварае 6 мкс з крокам па часе 0,02 пс. Пасля ўстаўкі Emp24 выкарыстоўвайце той жа працэс CHARMM GUI для мінімізацыі і балансавання сістэмы, а затым запусціце яе на працягу 8 секунд у прадукцыйным рэжыме.
Ва ўсіх сістэмах падчас працэсу балансавання ціск кантралюецца барастатам Берэндсена (59), а падчас вытворчага працэсу ціск кантралюецца барастатам Парынела-Рахмана (60). Ва ўсіх выпадках сярэдні ціск складае 1 бар, і выкарыстоўваецца паўізатропная схема злучэння ціску. У працэсе балансавання і вытворчасці выкарыстоўваецца тэрмастат (61) з перакаліброўкай хуткасці для злучэння тэмпературы часціц бялку, ліпідаў і растваральніка адпаведна. На працягу ўсёй аперацыі мэтавая тэмпература складае 310 К. Несувязкавае ўзаемадзеянне разлічваецца шляхам стварэння спісу пар з выкарыстаннем схемы Верле з буфернай дапушчальнасцю 0,005. Кулонаўскі член разлічваецца з выкарыстаннем поля рэакцыі і адлегласці адсячэння 1,1 нм. Член Ван-дэр-Ваальса выкарыстоўвае схему адсячэння з адлегласцю адсячэння 1,1 нм, а схема адсячэння Верле выкарыстоўваецца для патэнцыяльнага дрэйфу (62).
З дапамогай VMD даўжыня хвалі адсячэння паміж фасфатнымі шарыкамі DOPC або кераміднымі шарыкамі AM1 і бялком складае 0,7 нм, і разлічваецца колькасць ліпідаў, якія ўзаемадзейнічаюць з бялком. Згодна з наступнай формулай, разлічыце каэфіцыент узбагачэння-знясілення (DE), як паказана ў (63): каэфіцыент DE = (колькасць агульных ліпідаў у бялку 0,7) у бялку 0,7 (колькасць Cer у агульных ліпідах)
Паведамляецца значэнне ў выглядзе сярэдняга, а палоскі памылак — гэта чатыры незалежныя копіі размеркавання памылак (SE). Статыстычная значнасць фактара DE разлічваецца з дапамогай t-крытэрыя [(сярэдняе размеркаванне DE-фактар-1)/SE]. Разлічыце значэнне P па аднабаковым размеркаванні.
Для разліку 2D-карты латэральнай шчыльнасці сістэмы, якая змяшчае Emp24, на працягу апошніх 250 нс крывой была выкарыстана праграма GROMACS. Каб атрымаць карту ўзбагачэння/знясілення цэраміду, карта шчыльнасці цер дзеліцца на суму карты цер і DOPC, а затым дзеліцца на канцэнтрацыю цер у арганізме. Выкарыстоўваецца тая ж шкала каляровай карты.
Дадатковыя матэрыялы да гэтага артыкула можна знайсці па спасылцы http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Гэты артыкул знаходзіцца ў адкрытым доступе і распаўсюджваецца ў адпаведнасці з умовамі ліцэнзіі Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, якая дазваляе выкарыстанне, распаўсюджванне і прайграванне на любым носьбіце, калі канчатковае выкарыстанне не мае камерцыйнай выгады, і перадумовай з'яўляецца правільнасць арыгінальнага твора. Спасылка.
Заўвага: Мы просім вас падаць свой адрас электроннай пошты толькі для таго, каб чалавек, якога вы рэкамендуеце для старонкі, ведаў, што вы хочаце, каб ён бачыў ліст, і што гэта не спам. Мы не будзем фіксаваць ніякіх адрасоў электроннай пошты.
Гэтае пытанне выкарыстоўваецца для праверкі таго, ці з'яўляецеся вы наведвальнікам, і для прадухілення аўтаматычнай рассылкі спаму.
Сафія Радрыгес-Гальярда, Кадзуо Курокава, Сусана Сабіда-Бозо, Алехандра Картэс · Гомес (Alejandro Cortes-Gomez), Ацуко Ікеда (Ацуко Ікеда), Валерыя Зоні (Валерыя Зоні), Ауксіліадора Агілера-Рамэра, Ана Марыя Перэс -Лінера), Серхіа Лопес (Серхіа Лопес), Міха Вага (Miho Waga), Місако Арман (Misako Arman), Міяка Рыман (Miyako Riman), Проу Акіра, Стэфана Фані, Акіхіка Накано, Мануэль Муніс
Трохмерная візуалізацыя ў рэжыме рэальнага часу з высокім разрозненнем паказвае важнасць даўжыні кераміднага ланцуга для сартавання бялкоў у селектыўных выходных сайтах.
Сафія Радрыгес-Гальярда, Кадзуо Курокава, Сусана Сабіда-Бозо, Алехандра Картэс · Гомес (Alejandro Cortes-Gomez), Ацуко Ікеда (Ацуко Ікеда), Валерыя Зоні (Валерыя Зоні), Ауксіліадора Агілера-Рамэра, Ана Марыя Перэс -Лінера), Серхіа Лопес (Серхіа Лопес), Міха Вага (Miho Waga), Місако Арман (Misako Arman), Міяка Рыман (Miyako Riman), Проу Акіра, Стэфана Фані, Акіхіка Накано, Мануэль Муніс
Трохмерная візуалізацыя ў рэжыме рэальнага часу з высокім разрозненнем паказвае важнасць даўжыні кераміднага ланцуга для сартавання бялкоў у селектыўных выходных сайтах.
©2020 Амерыканская асацыяцыя садзейнічання развіццю навукі. усе правы абаронены. AAAS з'яўляецца партнёрам HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.