Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
У адрозненне ад пазваночных, шырока распаўсюджана меркаванне, што ў насякомых адсутнічаюць палавыя стэроідныя гармоны, якія ўласцівыя самцам. У Anopheles gambiae экдызонавы стэроід 20-гідраксіэкдызон (20E), відаць, эвалюцыянаваў, каб кантраляваць развіццё яйкаклетак пры сінтэзе самкамі2 і выклікаць шлюбны рэфрактэрны перыяд пры палавой перадачы самцамі3. Паколькі развіццё яйкаклетак і спарванне з'яўляюцца важнымі рэпрадуктыўнымі рысамі, разуменне таго, як самкі камароў Anopheles інтэгруюць гэтыя гарманальныя сігналы, можа палегчыць распрацоўку новых праграм барацьбы з малярыяй. Тут мы паказваем, што гэтыя рэпрадуктыўныя функцыі рэгулююцца рознымі палавымі стэроідамі праз складаную сетку ферментаў, якія актывуюць/інактывуюць экдыстэроіды. Мы ідэнтыфікавалі спецыфічны для самцоў акіслены экдызон, 3-дэгідра-20E (3D20E), які абараняе бацькоўства, адключаючы жаночую сэксуальную рэцэптыўнасць пасля палавой перадачы і актывацыі шляхам дэфасфарылявання. Прыкметна, што перанос 3D20E таксама выклікаў экспрэсію рэпрадуктыўных генаў, якія падтрымліваюць развіццё яйкаклетак падчас інфекцыі Plasmodium, забяспечваючы здароўе інфікаваных самак. 20E, атрыманы ад самак, не выклікае палавога адказу. але дазваляе асобінам, якія спарваюцца, адкладаць яйкі пасля таго, як інгібіруюцца 20E-інгібіруючыя кіназы. Ідэнтыфікацыя гэтага спецыфічнага для самцоў стэроіднага гармона насякомых і яго роля ў рэгуляцыі палавой успрымальнасці самак, фертыльнасці і ўзаемадзеяння з плазмодыямі сведчыць аб патэнцыяле зніжэння рэпрадуктыўнага поспеху камароў, якія перадаюць малярыю.
Колькасць выпадкаў малярыі і смяротных выпадкаў зноў расце4 з-за шырока распаўсюджанай устойлівасці да інсектыцыдаў у камароў Anopheles, адзінага пераносчыка малярыйных паразітаў чалавека. Біялогія спарвання гэтых камароў з'яўляецца асабліва прывабнай мішэнню для новых мер па барацьбе з малярыяй, паколькі самкі спарваюцца толькі адзін раз5; стэрыльнасць гэтага адзінкавага спарвання мела б вялікі патэнцыял для скарачэння папуляцыі камароў у палявых умовах.
Жанчыны губляюць сэксуальную здольнасць пасля атрымання ад мужчын стэроідных гармонаў высокага тытра. Даследаванні паказалі, што прычынай цяжкасцей у далейшым спарванні з'яўляецца 20-гідраксіэкдызон (20E), стэроідны гармон, больш вядомы як рэгулятар цыклу лінькі ў лічынкавай стадыі. Здольнасць самцоў сінтэзаваць і пераносіць 20E развілася спецыяльна ў відаў Anopheles, якія ўваходзяць у падрод Cellia7, які распаўсюджаны ў Афрыцы і ўключае найбольш небяспечных пераносчыкаў малярыі, у тым ліку Anopheles gambiae. Гэта асабліва характэрна, таму што ў гэтых відаў самкі таксама выпрацоўваюць 20E пасля кожнага спажывання крыві, і 20E кіруе цыклам оогенезу (гл. спасылку 8). Аднак мала што вядома пра тое, як самкі інтэгруюць сігналы з двух розных крыніц экдызону (перанос самцам і індукцыя харчавання крывёю), не парушаючы пры гэтым сваю ўласную здольнасць да спарвання. Фактычна, калі 20E, які выпрацоўваецца самкамі, выклікае сэксуальную непераноснасць, гэта прывядзе да бясплоддзя ў асобін, якія кормяцца цнатлівай, што з'яўляецца вельмі распаўсюджанай з'явай у гэтых камароў5.
Магчымым тлумачэннем з'яўляецца тое, што самцы A. gambiae пераносяць мадыфікаваны самцовы спецыфічны экдызон, які актывуе сігнальны каскад у жаночых палавых шляхах, што прыводзіць да нестабільнасці спарвання. Аднак, хоць пазваночныя маюць некалькі стэроідных гармонаў, такіх як эстраген і андраген (агляд у спасылцы 9), наколькі нам вядома, андрагенна-зрушаныя стэроіды ў насякомых не былі выяўлены.
Мы паставілі сабе за мэту вызначыць рэпертуар стэроідных гармонаў у дапаможнай залозе самца (MAG) поласпелых A. gambiae ў пошуках магчымых мадыфікуючых стэроідаў. Выкарыстоўваючы высокаэфектыўную вадкасную храматаграфію ў спалучэнні з тандэмнай мас-спектрометрыяй (HPLC-MS/MS) замест менш спецыфічнага метаду, які выкарыстоўваўся раней, мы выявілі экдызон (E) і 20E у гэтай тканіне, што пацвердзіла папярэдні вынік. Аднак узор пераважна складаўся з акісленых фасфараляваных стэроідаў, якія адпавядаюць формуле 3-дэгідра-20E-22-фасфат (3D20E22P)12 (малюнак 1). Іншыя формы ўключаюць 3-дэгідра-20E (3D20E) і 20E-22-фасфат (20E22P). Інтэнсіўнасць сігналу HPLC-MS/MS 3D20E22P была на два парадкі вышэй, чым яго дэфасфараляваная форма, 3D20E, і на тры парадкі вышэй, чым у E і 20E (малюнак 1). Нягледзячы на ​​тое, што ў іншых частках цела і ніжніх рэпрадуктыўных шляхах... (LRT; пашыраныя дадзеныя, мал. 1a). Мы таксама прааналізавалі экдыстэроіды ў нядаўна закрытых (<1 дня) самцоў і самак і выявілі 3D20E і 3D20E22P толькі ў MAG; E, 20E і 20E22P прысутнічалі ў абодвух полаў (пашыраныя дадзеныя, мал. 1b). Гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што дарослыя самцы A. gambiae выпрацоўваюць высокія тытры мадыфікуючых гармонаў у сваіх MAG, якія не сінтэзуюцца самкамі.
MAG і самакі LRT (у тым ліку перадсэрдзяў, насенных пузырьков і параварыума) былі вылучаны з 4-дзённых (4-дзённых) непашкоджаных самцоў і непашкоджаных і спараваных самак (0,5, 3 і 12 гадзін у хвіліну). Экдызон у гэтых тканінах аналізаваўся з дапамогай ВЭЖХ-МС/МС (сярэдняе ± стандартная памылка ў памылцы; няпарны t-крытэрый, двухбаковы, з карэкцыяй на частату ілжывых выяўленняў (FDR); NS, нязначна; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 гадзіны супраць 0,5 гадзіны, P = 0,035; 12 гадзін супраць 3 гадзін, P = 0,0015; 12 гадзін супраць 0,5 гадзіны, P = 0,030. 3D20E22P: 3 гадзіны супраць 0,5 гадзіны, P = 0,25; 12 гадзін супраць 3 гадзін, P = 0,0032; 12 гадзін супраць 0,5 гадзін, P = 0,015). Дадзеныя атрыманы з трох біялагічных паўтораў. Плошча піка для кожнага экдызона, які цікавіць, была разлічана і нармалізавана па колькасці камароў. Экдызон прадстаўлены наступнымі колерамі: E, зялёны; 20E, аранжавы; 20E22P, фіялетавы; 3D20E, сіні; 3D20E22P, ружовы. Устаўка павялічвае маштаб па восі Y, каб паказаць больш нізкія ўзроўні экдызона.
Каб даследаваць, ці пераносяцца 3D20E22P і 3D20E падчас спарвання, мы прэпаравалі самак БРТ у розныя моманты часу пасля спарвання. Нягледзячы на ​​тое, што экдызон не быў выяўлены ў цнатлівых самцоў, мы назіралі значную колькасць 3D20E22P у БРТ адразу пасля спарвання (0,5 гадзіны пасля спарвання, hpm), якая з часам змяншалася, у той час як узровень 3D20E значна павялічваўся (мал. 1). Выкарыстоўваючы хімічна сінтэзаваны 3D20E у якасці стандарту, мы вызначылі, што ўзровень гэтага стэроіднага гармона ў БРТ падчас спарвання быў як мінімум у 100 разоў вышэйшы за 20E (пашыраныя дадзеныя, табліца 1). Такім чынам, 3D20E22P з'яўляецца асноўным мужчынскім экдызонам, які пераносіцца ў самак БРТ падчас спарвання, і яго дэфасфарыляваная форма, 3D20E, становіцца вельмі распаўсюджанай неўзабаве пасля спарвання. Гэта сведчыць аб важнай ролі апошняга экдызона ў біялогіі самак пасля спарвання.
Пасля стварэння новага набору дадзеных РНК-секвенавання (RNA-seq) (мал. 2a) з выкарыстаннем спецыяльна распрацаванага біяінфарматычнага канвеера мы правялі пошук экдызонкіназы (EcK), экдызонаксідазы (EO) і гена экдызон-аксідазы, які кадуе 20E-мадыфікаваную фасфатазу. EPP экспрэсуецца ў рэпрадуктыўных тканінах. Мы вызначылі адзін кандыдатны ген EPP і два патэнцыйныя гены EcK (EcK1 і EcK2), але не змаглі знайсці добры кандыдатны ген EO. Прыкметна, што асобныя гены EPP экспрэсаваліся на высокім узроўні (98,9-ы перцэнтыль) у гамбійскіх MAG, але не ў жаночых LRT (мал. 2b), насуперак нашым чаканням, паколькі дэфасфарыляванне 3D20E22P адбывалася ў гэтай жаночай тканіне. Такім чынам, мы лічым, што мужчынскі EPP можа перадавацца падчас спарвання. Сапраўды, мы выкарыстоўвалі маркіроўку стабільнымі ізатопамі in vivo, каб замаскіраваць жаночы бялок пасля спарвання, фермент, ідэнтыфікаваны з дапамогай MS у жаночым перадсэрдзі (мал. 2c і дадатковая табліца 1). Прысутнасць ЭПП у MAG і спарваных (але не цнатлівых) самак LRT таксама быў пацверджаны з выкарыстаннем спецыфічных антыцелаў (мал. 2d).
а, Спецыяльна распрацаваны біяінфарматычны канвеер для пошуку ў рэпрадуктыўных тканінах кожнага полу генаў, якія кадуюць EcK, EO і EPP. Лічбы побач са стрэлкамі паказваюць колькасць кандыдатаў мужчынскага і жаночага полу на кожным этапе. Гэты аналіз ідэнтыфікаваў адзін ген EPP (EPP) і адзін ген EcK (EcK1), якія экспрэсуюцца ў самцоў, і адзін ген EcK (EcK2), які экспрэсуецца ў абодвух полаў, але не дае кандыдата ў ген EO.б, Цеплавая карта, якая параўноўвае экспрэсію кандыдатаў у тканінах цнатлівых (V) і спарвальных (M) Anopheles gambiae і Anopheles albicans. Spca, апладненне; MAG, дапаможныя залозы ў самцоў; іншыя часткі цела, у тым ліку грудзі, крылы, ногі, тлушчавыя целы і ўнутраныя органы ў абодвух полаў, а таксама яечнікі ў самак. EcK2 высока экспрэсуецца як у MAG, так і ў перадсэрдзях Гамбіі, у той час як EPP сустракаецца толькі ў MAG.c, Пратэомны аналіз транслакацыі групы эякулята мужчын у перадсэрдзі самак праз 3, 12 і 24 гадзіны ў хвіліну, які паказвае 67 найбольш распаўсюджаных бялкоў. Самак вырошчвалі на дыеце, якая змяшчала 15N для маркіроўкі (і маскіроўкі) усіх бялкоў. Немаркіраваных самцоў спарвалі з маркіраванымі самкамі, а самачныя LRT рассякалі праз 3, 12 і 24 гадзіны ў хвіліну для пратэомнага аналізу (гл. дадатковую табліцу 1 для поўнага спісу эякуляцыйных бялкоў). Устаўка, EPP, Eck1 і EcK2 былі выяўлены ў MAG непарных самцоў шляхам пратэомнага аналізу гэтых тканін.d, EPP быў выяўлены з дапамогай вестэрн-блоттынгу ў MAG і LRT спараваных самак, але не ў непарных самак або самцоў, або ў астатняй частцы цела самкі. Мембраны былі адначасова даследавалі з дапамогай антыцелаў супраць актыну (кантроль загрузкі) і антыцелаў супраць EPP. Усе самцы — цнатлівыя. Глядзіце дадатковы малюнак 1 для атрымання дадзеных з геля. Вестэрн-блот быў праведзены двойчы з падобнымі вынікамі.
Актыўнасць экдыстэроіднай фосфафасфатазы EPP была праверана пасля інкубацыі з дапамогай ВЭЖХ-МС/МС з 3D20E22P, выдзеленым з MAG (пашыраныя дадзеныя, мал. 2a). Акрамя таго, калі мы прыглушылі EPP з дапамогай РНК-апасродкаванай інтэрферэнцыі (RNAi), мы выявілі моцнае зніжэнне актыўнасці фасфатазы ў рэпрадуктыўных тканінах гэтых самцоў (мал. 3a), а самкі, якія спарваліся з самцамі з прыглушаным EPP, паказалі значна меншую долю дэфасфарыляванага 3D20E (мал. 3b), нягледзячы на ​​частковае прыглушэнне генаў (пашыраныя дадзеныя, мал. 2b,c). Наадварот, мы не выявілі істотных змен у суадносінах 20E22P/20E ў тых жа камароў, што можа сведчыць аб тым, што фермент спецыфічны для 3D20E22P (мал. 3b).
а, Зніжэнне актыўнасці фасфатазы ў MAG, выкліканае заглушэннем EPP з выкарыстаннем кантрольных узораў з двухланцуговай EPP РНК (dsEPP) або двухланцуговай GFP РНК (dsGFP). У кожным паўтарэнні выкарыстоўвалася дваццаць пулаў MAG (P = 0,0046, парны t-крытэрый, двухбаковы), прадстаўленых асобнымі кропкамі. б, Самкі, спарваныя з самцамі з заглушаным EPP, мелі значна меншую долю дэфасфарыляванага 3D20E пры 3 hpm (P = 0,0043, няпарны t-крытэрый, двухбаковы), тады як узроўні 20E не змяніліся (P = 0,063, няпарны). t-крытэрый, двухбаковы). Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартная памылка (SEM) з трох пулаў па 13, 16 і 19 самак у кожным.c. Самкі, якія спарваліся з самцамі з прыглушаным EPP, мелі значна вышэйшыя паказчыкі паўторнага спарвання (P = 0,0002, дакладны крытэрый Фішэра, двухбаковы). Самак спачатку прымушалі спарвацца, каб пераканацца ў сваім шлюбным статусе; Праз 2 дні з імі звязаліся іншыя самцы, якія мелі трансгенную сперму, каб ацаніць частату паўторнага спарвання шляхам колькаснага ПЦР-выяўлення трансгена.d У самак, якія атрымлівалі крывяное харчаванне і спарваліся з самцамі з прыглушаным EPP, пладавітасць значна знізілася (P < 0,0001; двухбаковы тэст Манна-Уітні) і колькасць яек была нязначна зніжана (P = 0,088, двухбаковы тэст Манна-Уітні), у той час як частата нерасту не змянілася (P = 0,94, двухбаковы дакладны тэст Фішэра). Ва ўсіх панэлях n азначае колькасць біялагічна незалежных узораў камароў.NS — неістотна.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Далей мы ацанілі, ці важна дэфасфарыляванне экдызону для індукцыі рэзістэнтнасці да спарвання ў самак. Прыкметна, што самкі, якія спарваліся з самцамі з дэфіцытам ЭПП, паўторна спарваліся значна часцей (44,9%), чым кантрольныя самкі (10,4%) пры кантакце з дадатковымі (трансгеннымі) самцамі (мал. 3c). Мы таксама назіралі значнае зніжэнне фертыльнасці (мал. 3d, злева) і нязначнае зніжэнне колькасці яек, адкладзеных гэтымі самкамі (мал. 3d, пасярэдзіне), у той час як працэнт яек, адкладзеных самкамі (яшчэ адна рэакцыя, выкліканая ў самак спарваннем), не змяніўся (мал. 3d, справа). Улічваючы назіраную спецыфічнасць ЭПП для 3D20E22P, гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што актывацыя 3D20E з дапамогай ЭПП, які перадаецца падчас спарвання, можа гуляць важную ролю ў адключэнні рэцэптыўнасці самак да далейшага спарвання, паводзін, якія раней прыпісваліся палавой перадачы 20E. Такім чынам, гэты спецыфічны для самцоў гармон таксама моцна ўплывае на фертыльнасць самак.
Далей мы параўналі актыўнасць 20E і 3D20E ў эксперыментах па ін'екцыях у палаваспелых цнатліўцаў з выкарыстаннем хімічна сінтэзаванага 3D20E (мал. 4a–c) і камерцыйна даступнага 20E. Мы назіралі, што 3D20E быў значна больш эфектыўным, чым 20E, у адключэнні адчувальнасці самак да спарвання пры абедзвюх канцэнтрацыях (мал. 4d). Прыкметна, што палова фізіялагічнага ўзроўню 3D20E ў LRT (1066 пг пасля ін'екцыі супраць 2022 пг пасля спарвання) выклікала долю рэфрактэрных самак, якая была ў 20 разоў вышэйшай за фізіялагічны ўзровень 20E (361 пг пасля ін'екцыі) праз 24 гадзіны пасля ін'екцыі пры найвышэйшай канцэнтрацыі 18 пг пасля спарвання; Пашыраныя дадзеныя (табліца 1). Гэты вынік адпавядае меркаванню, што палавая перадача 20E не выклікае рэфрактэрных перыядаў спарвання, і дадаткова паказвае на 3D20E як на асноўны фактар ​​у забеспячэнні адносін паміж бацькамі і дзецьмі. 3D20E таксама быў значна больш актыўным, чым 20E, у тэстах на адкладку яек у самак-цнатліўцаў (мал. 4e), што сведчыць аб тым, што нармальная хуткасць адкладкі яек, якую мы назіралі пасля частковага заглушэння EPP, была абумоўлена наяўнасцю рэшткавай актыўнасці 3D20E, якая ўсё яшчэ выклікаецца фактарамі, выкліканымі спарваннем, у самак.
(a,b) 3D20E хімічна сінтэзаваны з 20E (a) з вельмі высокай канверсіяй/эфектыўнасцю (дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартная памылка з трох незалежных рэакцый сінтэзу) (b).c, Мас-спектр (ніжняя палова) дакладна адпавядае экдызону, выяўленаму ў спараных самках LRT (верхняя палова).d, у параўнанні з 20E (0,63 мкг, P = 0,02; 0,21 мкг, P < 0,0001; дакладны крытэрый Фішэра, двухбаковы) і 10% этанолам (0,63 мкг, P < 0,0001; 0,21 мкг, P < 0,0001; дакладны крытэрый Фішэра, двухбаковы), у той час як 20E быў значна вышэйшым за кантрольны толькі пры больш высокіх дозах (0,63 мкг, P = 0,0002; 0,21 мкг, P = 0,54; дакладны крытэрый Фішэра, двухбаковы).e, ін'екцыя 3D20E выклікала значна больш высокія паказчыкі нерасту ў некранутых самак, чым у кантрольных групах з 10% этанолам (0,21 мкг, P < 0,0001; 0,13 мкг, P = 0,0003; дакладны крытэрый Фішэра, двухбаковы), у той час як 20E параўноўваўся з кантрольнымі групамі толькі пры больш высокіх дозах (0,21 мкг, P = 0,022; 0,13 мкг, P = 0,0823; дакладны крытэрый Фішэра, двухбаковы). 3D20E выклікаў значна больш высокія паказчыкі нерасту, чым 20E пры больш высокіх дозах (0,21 мкг, P = 0,0019; 0,13 мкг, P = 0,075; дакладны крытэрый Фішэра, двухбаковы). Ва ўсіх панэлях n прадстаўляе колькасць біялагічна незалежных узораў камароў. NS, неістотна. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Дадзеныя атрыманы з трох... паўтараецца.
У папярэдніх даследаваннях мы вызначылі, што палавая перадача стэроідных гармонаў індукуе экспрэсію MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), жаночага рэпрадуктыўнага гена, які абараняе самак A. gambiae ад інфекцыі P. falciparum. Выдаткі на здароўе, выкліканыя 13, самым смяротным паразітам малярыі чалавека. Улічваючы важнасць MISO для рэпрадуктыўнай прыстасаванасці Anopheles у эндэмічных па малярыі раёнах, мы вырашылі вызначыць, які гармон - 3D20E або 20E - выклікае экспрэсію гэтага гена. Мы выявілі, што, хоць ін'екцыя 20E спецыфічна або больш магутна індукуе некаторыя ядзерныя гармональныя рэцэптары (HR), такія як HR3 і HR4, і тыповыя ніжэйшыя стэроідныя мішэні, такія як ёлкагенныя гены Vg14, 15, 16, MISO мацней індукуецца 3D20E (пашыраныя дадзеныя, мал. 3). Такім чынам, палавая перадача гэтага андрагеннага стэроіднага гармона, відаць, індукуе механізмы, якія абараняюць самак ад выдаткаў, выкліканых паразітарнай інфекцыяй. Акрамя таго, 3D20E дыферэнцыяльна ўплывае на абедзве ізаформы. рэцэптар EcR, індукуючы EcR-A і рэпрэсуючы EcR-B, і больш моцна актывуючы іншыя гены, якія індукуюць спарванне, у тым ліку HPX15, які ўплывае на жаночую фертыльнасць. Гэта можа растлумачыць значную бясплоддзе, якое назіраецца ў самак, якія спарваліся з самцамі з прыглушаным EPP (пашыраныя дадзеныя, мал. 3). Гэтыя дадзеныя сведчаць аб існаванні ніжэйшых шляхоў, пераважна актываваных двума гармонамі экдызону, якія могуць ляжаць у аснове спецыфічнай для полу функцыі.
Далей мы праверылі функцыю двух генаў EcK, ідэнтыфікаваных у нашым біяінфарматычным канвееры. Прыглушэнне EcK1 або EcK2 прывяло да значнай смяротнасці ў самцоў (пашыраныя дадзеныя, мал. 4a), што сведчыць аб тым, што фасфараляванне экдызону, і, такім чынам, інактывацыя, важная для выжывання. Паколькі EcK2 экспрэсаваўся на больш высокіх узроўнях, чым EcK1, і быў выяўлены ў MAG з дапамогай пратэомікі (мал. 2b,c і дадатковая табліца 2), мы пацвердзілі яго экдыстэроідную кіназную актыўнасць, інкубуючы яго з 20E, што прывяло да фасфаралявання 20E22P (пашыраныя дадзеныя, мал. 2).4b). Пры выкарыстанні 3D20E у якасці субстрата мы не змаглі выявіць фасфараляваны прадукт 3D20E22P (пашыраныя дадзеныя, мал. 4c), што сведчыць аб тым, што 20E, а не 3D20E, можа быць пераважнай мішэнню EcK2.
Згодна з нашым аналізам РНК-секвенавання, EcK2 таксама высока экспрэсаваўся ў LRT цнатлівых самак, дзе ён выключаўся пасля спарвання (мал. 2b). Мы пацвердзілі гэтыя дадзеныя і вызначылі, што экспрэсія EcK2 не залежыць ад кармлення крывёю (пашыраныя дадзеныя, мал. 5a). Пашыраючы нашы пачатковыя эксперыменты з мас-спектрометрыяй, мы вызначылі, што пік 20E22P быў цесна звязаны з пікам 20E (праз 22-26 гадзін пасля крывавага прыёму ежы; пашыраныя дадзеныя, мал. 5b). Прыглушэнне EcK2 у цнатлівых самак прывяло да 3-кратнага павелічэння адноснага суадносін 20E да 20E22P праз 26 гадзін пасля крывавага прыёму ежы (пашыраныя дадзеныя, малюнкі 2c і 5c), што пацвярджае, што EcK2 таксама фасфаралюе 20E у самак. Прыкметна, што цнатлівыя самак з дэфіцытам EcK2 захавалі поўную сэксуальную рэцэптыўнасць (пашыраныя дадзеныя, мал. 5d,e), што дадаткова сведчыць аб тым, што выпрацоўка 20E самак не выклікае рэфрактэрных перыядаў спарвання. Аднак гэтыя самкі мелі значна... павялічыліся паказчыкі адкладкі яек у параўнанні з кантрольнай групай, прычым больш за 30% нявінных адклалі яйкі (пашыраныя дадзеныя, мал. 5f). Калі ін'екцыі двухланцуговай РНК Eck2 (dsEcK2) праводзіліся пасля кармлення крывёю, нераст не адбываўся, і ў гэты момант пік 20E з-за праглынання крыві зніжаўся. У цэлым, гэтыя вынікі пацвярджаюць мадэль, згодна з якой 20E, якая выпрацоўваецца пасля смактання крыві, можа выклікаць нераст, але толькі тады, калі блок нерасту (EcK2 і, магчыма, іншыя фактары) выключаецца спарваннем. Ні ін'екцыі 20E, ні 3D20E не інгібіравалі экспрэсію EcK2 у нявінных (пашыраныя дадзеныя, мал. 5g), што сведчыць аб тым, што іншыя фактары апасродкуюць інгібіраванне гэтай кіназы. Аднак узроўняў 20E пасля кармлення крывёю было недастаткова, каб выклікаць дыскамфорт пры спарванні, але яны былі эфектыўна выкліканы высокімі тытрамі 3D20E, якія перадаюцца палавым шляхам.
Нашы вынікі даюць важнае разуменне механізмаў, якія рэгулююць рэпрадуктыўны поспех A. gambiae. З'явілася мадэль, у якой самцы эвалюцыянавалі і сінтэзуюць высокія тытры 3D20E, спецыфічнага для самцоў мадыфікаванага экдызону, які забяспечвае бацькоўства, зніжаючы адчувальнасць самак да далейшага спарвання. У той жа час гэтыя пераносчыкі малярыі таксама развілі эфектыўную сістэму для актывацыі 3D20E ў самак у адказ на палавую перадачу спецыфічнага для самцоў EPP. Наколькі нам вядома, гэта першы прыклад стэроіднай гармональнай сістэмы, у якой дамінуюць самцы і самкі, якая выконвае унікальную і важную функцыю ў насякомых. Спецыфічная для самцоў функцыя экдызону была пастулявана, але канчаткова не даказаная. Напрыклад, у значнай ступені абвергнутая гіпотэза 18 заключаецца ў тым, што гэтыя функцыі могуць выконвацца папярэднікам 20E E1. Добра вядома, што ў дразафілы монандрыя запускаецца палавой перадачай малых палавых пептыдаў 19,20, якія ўзаемадзейнічаюць з нейронамі, якія інервуюць жаночы рэпрадуктыўны тракт, праз спецыфічныя рэцэптары палавых пептыдаў 21,22. Патрабуецца далейшая праца для вызначэння сігнальных каскадаў ніжэй па плыні. кантралююцца 3D20E ў самак A. gambiae і вызначыць, ці могуць гэтыя каскады захоўвацца паміж камарамі і дразафіламі.
Улічваючы важную ролю 3D20E ў фертыльнасці і паводзінах самак, выяўленую ў нашым даследаванні, шляхі, якія вядуць да сінтэзу і актывацыі 3D20E, адкрываюць новыя магчымасці для будучых стратэгій барацьбы з камарамі, такіх як стварэнне канкурэнтаздольных стэрыльных самцоў у стратэгіях тэхналогіі стэрыльных насякомых, якія выкарыстоўваюцца для выпуску ў дзікую прыроду або для імітацыі 3D20E ў гульнях з цнатлівасцю. Спецыфічная для самцоў функцыя 3D20E, магчыма, развілася, калі A. gambiae і іншыя віды Cellia набылі здольнасць каагуляваць сваю сперму ў шлюбныя коркі, бо гэта дазваляе эфектыўна перадаваць вялікую колькасць гармонаў і ферментаў, якія актывуюць гармоны. У сваю чаргу, эвалюцыя 3D20E, якая рэалізуе монандрыю, забяспечвае механізм для самак (праз высокую экспрэсію MISO), каб спрыяць іх рэпрадуктыўнай прыстасаванасці ў раёнах з высокай распаўсюджанасцю малярыі, што ўскосна спрыяе перадачы плазмодыяў. Улічваючы, што было паказана, што самка 20E аказвае значны ўплыў на выжыванне і рост P. falciparum у самак камароў Anopheles,24 шляхі стэроідных гармонаў як самцоў, так і самак цяпер з'яўляюцца ключавымі аспектамі ўзаемадзеяння камароў і паразітаў.
Штамы A. gambiae G3 вырошчваліся ў стандартных умовах для насякомых (26-28 °C, адносная вільготнасць 65-80%, фотаперыяд светлавога/цёмнага сонца 12:12 гадзін). Лічынак кармілі парашкападобным кормам для рыб (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets і Tetra Pond Sticks у суадносінах 7:7:2). Дарослых камароў кармілі ўволю 10% растворам дэкстрозы і штотыднёвай крывёю чалавека (кампаненты крыві для даследавання). Дзеці-камары былі атрыманы шляхам падзелу палоў на стадыі лялячкі пасля вывучэння канцоў пад мікраскапіяй. Самцы, якія нясуць трансген DsRed, былі апісаны раней.
Эксперыменты па прымусовым спарванні праводзіліся ў адпаведнасці з раней апісанымі пратаколамі. Для натуральнага спарвання 4-дзённых нявінных самак утрымлівалі ў суадносінах 1:3 з поласпелымі нявіннымі самцамі на працягу двух начэй. У эксперыментах, у якіх самцам уводзілі dsEPP, сумеснае ўтрыманне ў клетках супадала з 3-4 днямі пасля ін'екцыі, калі актыўнасць фасфатазы была максімальна прыглушана (пашыраныя дадзеныя, мал. 2b).
Тканкі камароў, пакінутыя трупы (астатняя частка цела) або ўсё цела рассякалі ў 100% метаноле і гамагенізавалі з дапамогай бідэра (шкляныя шарыкі 2 мм, 2400 аб/мін, 90 сек). Колькасць тканін і аб'ём метанолу былі наступнымі: астатняя частка цела - 50 у 1000 мкл; MAG, 50-100 па 80 мкл; самкі LRT, 25-50 па 80 мкл. Асадак падвяргалі другой экстракцыі метанолам з такім жа аб'ёмам метанолу. Клетачныя рэшткі выдалялі цэнтрыфугаваннем. Метанол з абедзвюх экстракцый аб'ядноўвалі і сушылі пад патокам азоту, затым рэсуспендавалі ў наступных аб'ёмах 80% метанолу ў вадзе: астатняя частка цела - 50 мкл; MAG і самкі LRT, 30 мкл.
Узоры аналізавалі на мас-спектрометры (ID-X, Thermo Fisher), падлучаным да прыбора вадкаснага хроматографа (Vanquish, Thermo Fisher). 5 мкл узору ўводзілі на калонку памерам 3 мкм, 100 × 4,6 мм (Inspire C8, Dikma), якая падтрымлівалася пры тэмпературы 25 °C. Рухомымі фазамі для вадкаснага хроматографа былі A (вада, 0,1% мурашыная кіслата) і B (ацэтанітрыл, 0,1% мурашыная кіслата). Градыент вадкаснага хроматографа быў наступным: 5% B на працягу 1 хвіліны, затым павялічваўся да 100% B на працягу 11 хвілін. Пасля 8 хвілін пры 100% калонку зноў ураўнаважвалі пры 5% B на працягу 4 хвілін. Хуткасць патоку складала 0,3 мл/мін. Іанізацыя ў крыніцы MS ажыццяўлялася шляхам награвальнай электрараспыляльнай іанізацыі ў станоўчым і адмоўным рэжымах.
Мас-спектрометр вымярае дадзеныя ў дыяпазоне m/z ад 350 да 680 з дазволам 60 000 у рэжыме поўнай мас-спектрометрыі. Дадзеныя мас-спектрометрыі былі атрыманы для [M + H]+ (усе мішэні), [M - H2O + H]+ (усе мішэні) і [M - H]- (фасфарыляваныя мішэні). Дадзеныя мас-спектрометрыі былі выкарыстаны для пацверджання экдызонавых уласцівасцей мішэняў, для якіх не было стандарту. Для ідэнтыфікацыі экдыстэроідаў, якія не з'яўляюцца мішэнямі, былі прааналізаваны дадзеныя мас-спектрометрыі для ўсіх пікаў ВЭЖХ з адноснай колькасцю >15%. Колькасна вызначце з выкарыстаннем стандартных крывых, створаных з чыстых стандартаў (20E, 3D20E), каб вылічыць абсалютныя колькасці або развядзенні аднаго канкрэтнага ўзору (усе астатнія мішэні) для вылічэння іх эквівалентнасці колькасцям, выяўленым у аднаго самца. Для 3D20E колькасная ацэнка была праведзена з выкарыстаннем сумы наступных аддуктаў: ​​[M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Дадзеныя былі выняты і колькасна вызначаны з дапамогай Tracefinder (версія 4.1). Дадзеныя MS/MS былі прааналізаваны з дапамогай Xcalibur (версія 4.4). МС-спектры E, 20E і 3D20E былі параўнаны з адпаведнымі стандартамі. 3D20E22P быў прааналізаваны шляхам дэрыватызацыі з рэагентам Жырара. 20E22P быў прааналізаваны па суадносінах m/z.
3D20E22P быў ачышчаны з MAG. Ачыстка праводзілася ў аналітычным маштабе з выкарыстаннем ультраэфектыўнага вадкаснага храматографа (Acquity, Waters) з квадрупольным мас-дэтэктарам (QDa, Acquity, Waters) у тых жа ўмовах вадкаснай хроматографіі, што і пры аналізе ВЭЖХ-МС/МС. Збор фракцый запускаўся, калі m/z, адпаведнае 3D20E22P, выяўлялася пры тым жа часе ўтрымання, што і раней. Чысціню экстрагаваных злучэнняў затым правяралі з дапамогай ВЭЖХ-МС/МС, як апісана вышэй.
Агульную РНК экстрагавалі з 10-12 рэпрадуктыўных тканін або іншых частак цела (без галоў) з выкарыстаннем рэагента TRI (Thermo Fisher) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. РНК апрацоўвалі TURBO DNase (Thermo Fisher). кДНК сінтэзавалі з выкарыстаннем зваротнай транскрыптазы віруса мышынай лейкеміі Молони (M-MLV RT; Thermo Fisher) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Праймеры для колькаснай ПЦР з зваротнай транскрыпцыяй (RT-qPCR; Extended Data Table 2) былі апублікаваныя раней24 або распрацаваны з выкарыстаннем Primer-BLAST26, прычым перавага аддавалася прадуктам памерам 70-150 пар асноў, якія ахопліваюць экзон-экзонныя злучэнні або асобныя экзоны з дапамогай пар праймераў. Узоры кДНК з трох-чатырох біялагічных паўтораў разводзілі ў чатыры разы вадой для RT-qPCR. Колькасная ацэнка праводзілася ў 15 мкл паўторных рэакцый, якія змяшчалі 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймеры і 5 мкл разведзенай кДНК. Рэакцыі праводзілі на сістэме ПЦР у рэжыме рэальнага часу QuantStudio 6 Pro (Thermo Фішэр), а дадзеныя былі сабраны і прааналізаваны з выкарыстаннем праграмы Design and Analysis (версія 2.4.3). Як паказана ў гэтым даследаванні, адносныя колькасці былі нармалізаваны адносна рыбасомнага гена RpL19 (AGAP004422), экспрэсія якога істотна не змянялася пры кармленні крывёю 27 або спарванні 3.
Якасць РНК правяралася з дапамогай біяаналізатара Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent). Бібліятэкі парных канцоў Illumina былі падрыхтаваны і прааналізаваны ў Інстытуце Брода Масачусецкага тэхналагічнага інстытута і Гарварда. Секвенаванне счытванняў было выраўнавана з геномам A. gambiae (штам PEST, версія 4.12) з выкарыстаннем HISAT2 (версія 2.0.5) з параметрамі па змаўчанні. Счытванні з паказчыкамі якасці мапіравання (MAPQ) <30 былі выдалены з выкарыстаннем Samtools (версія 1.3.1). Колькасць счытванняў, адлюстраваных на гены, была падлічана з выкарыстаннем htseq-count (версія 0.9.1) з параметрамі па змаўчанні. Нармалізаваная колькасць счытванняў была разлічана, а дыферэнцыяльная экспрэсія генаў прааналізавана з выкарыстаннем пакета DESeq2 (версія 1.28.1) у R (версія 4.0.3).
Гены-кандыдаты, якія мадыфікуюць экдызон, былі ідэнтыфікаваны шляхам папярэдняга пошуку ў геноме A. gambiae з выкарыстаннем алгарытму PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) з выкарыстаннем значэнняў параметраў па змаўчанні з наступнымі паслядоўнасцямі бялкоў запыту: з Bombyx mori (нумар дадання NP_001038956.1), Musca domestica (нумар дадання XP_005182020.1, XP_005175332.1 і XP_011294434.1) і Microplitis demolitor (нумар дадання XP_008552646.1 і XP_008552645.1) EcK з B. mori (нумар дадання NP_001036900), Drosophila melanogaster (нумар дадання NP_651202), Apis mellifera (нумар далучэння XP_394838) і Acyrthosiphon pisum (нумар далучэння XP_001947166); і EPP ад B. mori (нумар далучэння XP_001947166) NP_001177919.1 і NP_001243996.1) і EO ад D. melanogaster (нумар далучэння NP_572986.1) (крок 1). Далей, хіты фільтруюцца на аснове высокай экспрэсіі мРНК (>100 фрагментаў/кілабазных экзонаў на мільён картаваных прачытанняў (FPKM) або >85%) у рэпрадуктыўнай тканіне (самкі LRT або MAG) у Гамбіі (крок 2). Для паляпшэння спецыфічнасці мы адабралі кандыдатныя ферменты, якія таксама экспрэсуюцца ў рэпрадуктыўнай тканіне A. albimanus, віду Anopheles, які не сінтэзуе і не пераносіць экдызон падчас спарвання. Гены-кандыдаты былі адфільтраваны на аснове нізкай экспрэсіі (<100 FPKM або <85-ы перцэнтыль) у рэпрадуктыўнай тканіне A. albimanus (этап 3). У якасці канчатковага фільтра (этап 4) гены-кандыдаты павінны задавальняць хаця б аднаму з наступных патрабаванняў: (1) значна павышаная экспрэсія пасля спарвання (P < 0,05) згодна з аналізам дыферэнцыяльна экспрэсаваных генаў і (2) у нерэпрадуктыўных тканінах (< 85 % або <100 FPKM).
Мы мадыфікавалі раней апісаныя метады 28, 29, 30, каб дасягнуць ізатопнага маркіравання ўсяго арганізма. Карацей кажучы, дзікі тып Saccharomyces cerevisiae тыпу II (YSC2, Sigma) быў пратэставаны ў азоцістай аснове дрожджаў (BD Difco, DF0335), якая змяшчала (вага/аб'ём) 2% глюкозы (G7528, Sigma), 1,7% культуральнага асяроддзя без амінакіслот і сульфату амонію і 5% 15N сульфату амонію (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) у якасці адзінай крыніцы азоту. Дрожджы былі атрыманы шляхам цэнтрыфугавання, а лічынкі камароў кармілі ўволю да акукання. Дадавалі рыбную муку (0,5 мг на 300 лічынак) для прадухілення смяротнасці чацвёртага ўзросту. Затым у эксперыментах па спарванні з немаркаванымі самцамі выкарыстоўваліся толькі самкі для аналізу пратэома самцоў, перанесенага падчас спарвання.
4-6-дзённых некранутых самак з меткай 15N прымушалі спарвацца з некранутымі самцамі адпаведнага ўзросту. Паспяховае спарванне пацвярджалася выяўленнем спароўвальных коркаў пад эпіфлуарэсцэнтнай мікраскапіяй. Праз 3, 12 і 24 гадзіны ў хвіліну перадсэрдзі 45-55 спарвальных самак рассякалі ў 50 мкл буфера бікарбанату амонія (pH 7,8) і гамагенізавалі песцікам. Гамагенат цэнтрыфугавалі, а супернатант змешвалі з 50 мкл 0,1% RapiGest (186001860, Waters) у 50 мМ бікарбанаце амонія. Супернатант і асадак з кожнага ўзору замарожвалі на сухім лёдзе і адпраўлялі на ноч у лабараторыю MacCoss ва Універсітэце Вашынгтона, дзе была завершана падрыхтоўка ўзору для LC-MS/MS. Рэсуспендавалі асадак у 50 мкл 0,1% RapiGest у 50 мМ бікарбанаце амонія і апрацоўвалі ультрагукам на вадзяной лазні. Канцэнтрацыю бялку ў асадку і супернатанце вымяралі з дапамогай BCA. У аналізе ўзоры былі адноўлены 5 мМ дытыятрэйтолам (DTT; Sigma), алкілаваны 15 мМ ёдаацэтамідам (Sigma) і інкубаваны пры тэмпературы 37 °C (1:0:50) на працягу 1 гадзіны ў суадносінах трыпсінізацыі:трыпсін:субстрат). RapiGest быў лізаваны даданнем 200 мМ HCl, а затым інкубаваны пры тэмпературы 37 °C на працягу 45 хвілін і цэнтрыфугаваны пры 14 000 абаротаў у хвіліну на працягу 10 хвілін пры 4 °C для выдалення дэтрымаў. Узоры былі прамыты двухрэжымнай цвёрдафазнай экстракцыяй (картрыджы Oasis MCX, Waters) і рэсуспендаваны ў 0,1% мурашынай кіслаце да канчатковай канцэнтрацыі бялку 0,33 мкг/мкл-1. Немаркіраваныя MAG-пратэомы былі аналагічна прааналізаваны ў самцоў-незалежных. Для кожнага ўзору былі прааналізаваны два аналітычныя паўторы. Далей 1 мкг кожнага быў прааналізаваны з выкарыстаннем 25-см калоны з плаўленым крэмніем 75 мкм і 4-см... Фрыт-пастка з плаўленага крэмнезёму Kasil1 (PQ), запоўненая смалой з абаротнай фазай Jupiter C12 (Phenomenex), і вадкасная храматаграфія на працягу 180 хвілін. Дайджэсты ўзораў – MS/MS праводзіліся на мас-спектрометры Q-Exactive HF (Thermo Fisher) з сістэмай nanoACQUITY UPLC (Waters). Дадзеныя, звязаныя з атрыманнем дадзеных, атрыманыя для кожнага прабегу, былі пераўтвораны ў фармат mzML з выкарыстаннем Proteowizard (версія 3.0.20287) і Comet31 (версія 3.2) у базе дадзеных FASTA, якая змяшчае бялковыя паслядоўнасці Anopheles gambiae (VectorBase версія 54), Anopheles coluzzi. Пошук быў праведзены па Mali-NIH (VectorBase версія 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, сакавік 2021 г.), RNA-секвенаванні A. gambiae і трохкадравых трансляцыях вядомых забруджвальнікаў чалавека. FDR, супастаўленыя з пептыднай картай, былі вызначаны з выкарыстаннем Percolator32 (версія 3.05) з парогам 0,01, і пептыды былі сабраны ў ідэнтыфікатары бялкоў з выкарыстаннем парсімоніі бялкоў у Limelight33 (версія 2.2.0). Адносная колькасць бялку ацэньвалася з выкарыстаннем нармалізаванага каэфіцыента спектральнай колькасці (NSAF), разлічанага для кожнага бялку ў кожным прабегу, як апісана раней. NSAF адносна кожнага бялку быў усреднены па ўзорах з двух розных біялагічных паўтораў. Маркіроўка 15N паспяхова маскіравала жаночы пратэом, хоць невялікая колькасць немаркіраванага бялку магла быць выяўлена ў маркіраваных цнатлівых пробах. Мы зафіксавалі выяўленне зніжэння мужчынскага бялку (1-5 спектры) у неапрацаваных жаночых пробах толькі ў тэхнічных прабегах, дзе неапрацаваныя ўзоры аналізаваліся пасля самцовых/спарвальных пробаў, у выніку «пераносу» ВЭЖХ. Часам бялкі, выяўленыя як «забруджвальнікі» з маркіраваных цнатлівых проб, пералічаны ў дадатковай табліцы 1.
Два антыгенныя пептыды, QTTDRVAPAPDQQQ (у межах ізатыпу PA) і MESDGTTPSGDSEQ (у межах ізатыпу PA і PB) у Genscript. Два пептыды былі аб'яднаны, затым кан'югаваны з бялком-носьбітам KLH і ўведзены ў новазеландскія трусы. Трусаў забівалі пасля чацвёртай ін'екцыі, і агульны IgG быў вылучаны шляхам афіннай ачысткі. IgG ад найбольш спецыфічнага да EPP труса выкарыстоўвалі для далейшага вестэрн-блотынгу.
Для вестэрн-блотынгу асобна дадавалі MAG (n = 10, дзе n азначае колькасць біялагічна незалежных узораў камароў) і самак LRT (n = 30) ад 4-дзённых некранутых самцоў і некранутых або прымусова спарваных самак (<10 пасля спарвання). Буфер для экстракцыі бялку (50 мМ Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% дэзоксіхалату натрыю; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1× кактэйль інгібітараў пратэаз (Roche)). Узоры гамагенізавалі адразу пасля дысекцыі з дапамогай бідэра (шкляныя шарыкі 2 мм, 2400 аб/мін, 90 сек). Нерастваральныя рэшткі выдалялі цэнтрыфугаваннем пры 20 000 g пры 4 °C. Бялкі колькасна вызначалі з дапамогай аналізу Брэдфарда (Bio-Rad). Затым 20 мкг бялку MAG, 40 мкг бялку LRT і 20 мкг рэшткавага бялку дэнатуравалі і аддзялялі на 10%. Біс-Трыс NuPAGE з выкарыстаннем MOPS-буфера. Бялкі пераносілі на полівінілідэнфтарыдныя мембраны з выкарыстаннем сістэмы пераносу iBlot2 (Thermo Fisher). Мембраны двойчы прамывалі ў 1× PBS-T (0,1% Tween-20 у PBS), а затым блакіравалі ў блакіруючым буферы Odyssey (Li-Cor) на працягу 1 гадзіны пры 22°C. Мембраны страсяналі на працягу ночы пры 4°C з карыстальніцкімі полікланальнымі першаснымі антыцеламі труса супраць EPP (1:700 у блакіруючым буферы) і моноклональнымі першаснымі антыцеламі пацука супраць актыну MAC237 (Abeam; 1:4000). Мембраны прамывалі PBS-T, а затым інкубавалі з другаснымі антыцеламі (аслінымі антыцеламі супраць труса 800CW і казлінымі антыцеламі супраць пацука 680LT (Li-Cor), абодва 1:20 000) у блакіруючым буферы, які змяшчае 0,01% SDS і 0,2% Tween-20 на працягу 1 гадзіны пры 22°C. Мембраны прамывалі PBS-T. і візуалізаваныя з дапамогай сканера Odyssey CLx. Здымкі былі сабраны і апрацаваны ў Image Studio (версія 5.2). Канкрэтная паласа, якая адпавядае ізаформе EPP-RA (82 кДа), не была выяўлена.
Кадавальныя вобласці EPP (ізаформа AGAP002463-RB, якая змяшчае дамен гістыдынавай фасфатазы, пошук кансерватыўных даменаў NCBI 34) і EcK2 (AGAP002181) былі кланаваны ў плазміду pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); праймеры пералічаны ў пашыранай табліцы дадзеных 2. Восем лінкераў GS4 (тандемна) былі ўстаўлены перад C-канцавой меткай 6xHis канструкцыі pET-21a(+)-EcK2. Рэкамбінантныя вавёркі былі атрыманы з выкарыстаннем рэакцыі сінтэзу бялку E. coli без клетак NEBExpress (New England BioLabs). Рэкамбінантныя вавёркі былі ачышчаны з выкарыстаннем спін-калон NEBExpress Ni (New England BioLabs). Кантрольны бялок дыгідрафаларэдуктазы (DHFR) быў атрыманы з выкарыстаннем ДНК-матрыцы з набору NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Вавёркі захоўваліся ў 50% гліцэрыне ў PBS пры тэмпературы -20 °C да 3 месяцаў.
Фасфатазная актыўнасць EPP і тканевых экстрактаў вымяралася з выкарыстаннем 4-нітрафенілфасфату (pNPP; Sigma-Aldrich). Рэакцыйны буфер утрымліваў 25 мМ Tris, 50 мМ воцатнай кіслаты, 25 мМ Bis-Tris, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA і 1 мМ DTT. Тканіна гамагенізавалася ў рэакцыйным буферы, а клетачны рэшткі выдаляліся цэнтрыфугаваннем. Рэакцыю ініцыявалі, дадаўшы фермент або тканевы экстракт да рэакцыйнага буфера, які змяшчае 2,5 мг/мл pNPP. Рэакцыйную сумесь інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы ў цемры, і колькасць pNP, пераўтворанага з pNPP, вызначалі колькасна, вымяраючы паглынанне пры 405 нм у розны час.
Для праверкі актыўнасці EcK in vitro бялок інкубавалі з 0,2 мг 20E або 3D20E ў 200 мкл буфера (pH 7,5), які змяшчае 10 мМ HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 мМ АТФ і 10 мМ MgCl2 на працягу 2 гадзін пры тэмпературы 27°C. Рэакцыю спынялі даданнем 800 мкл метанолу, затым астуджалі пры тэмпературы -20°C на працягу 1 гадзіны, а затым цэнтрыфугавалі пры 20 000 g на працягу 10 хвілін пры 4°C. Затым супернатант аналізавалі з дапамогай ВЭЖХ-МС/МС. Для награвальнай інактывацыі бялкоў, якія выкарыстоўваліся ў кантрольнай групе, бялкі інкубавалі ў 50% гліцэрыне ў PBS на працягу 20 хвілін пры тэмпературы 95°C.
Для вызначэння актыўнасці EPP in vitro бялок інкубавалі з 3D20E22P (эквівалентна колькасці, выяўленай у 18 парах MAG, ачышчаных з дапамогай ВЭЖХ-МС/МС) у 100 мкл буфера (pH 7,5), які змяшчае 25 мМ Tris, 50 мМ воцатнай кіслаты, 25 мМ Bis-Tris, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA і 1 мМ DTT на працягу 3 гадзін пры тэмпературы 27 °C. Рэакцыю спынялі даданнем 400 мкл метанолу і астуджалі пры -20 °C на працягу 1 гадзіны, затым цэнтрыфугавалі пры 20 000 g на працягу 10 хвілін пры 4 °C. Супернатант аналізавалі з дапамогай ВЭЖХ-МС/МС.
ПЦР-фрагменты для EPP (362 пар асноў), EcK1 (AGAP004574, 365 пар асноў) і EcK2 (556 пар асноў) былі ампліфікаваны з кДНК, падрыхтаванай з трупаў камароў змешанага полу без галавы. ПЦР-фрагмент кантрольнага eGFP (495 пар асноў) быў ампліфікаваны з раней апісанага pCR2.1-eGFP; ПЦР-праймеры пералічаны ў пашыранай табліцы дадзеных 2. ПЦР-фрагмент быў устаўлены паміж інвертаванымі прамотарамі T7 на плазмідзе pL4440. Плазмідныя канструкцыі былі атрыманы з кампетэнтнай E. coli NEB 5-α (New England Biolabs) і правераны шляхам секвенавання ДНК перад выкарыстаннем (гл. дадатковыя дадзеныя 1 для паслядоўнасці ўстаўкі). Праймеры, якія адпавядаюць прамотару T7 (пашыраная табліца дадзеных 2), былі выкарыстаны для ампліфікацыі ўстаўкі з плазміды на аснове pL4440. Памер прадукту ПЦР быў пацверджаны электрафарэзам у агарозным гелі. dsRNA была транскрыбавана з ПЦР-матрыц з выкарыстаннем набору Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) і ачышчана ў адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы з мадыфікацыямі, апісанымі раней.
Для ін'екцыі дцРНК 1380 нг дцРНК (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) уводзілі ў канцэнтрацыі 10 нг нл-1 у грудную клетку дарослых самцоў або самак (Nanoject III, Drummond) на працягу 1 дня пасля эклозіі. Узроўні знішчэння генаў вызначалі як мінімум у трох біялагічных паўторах шляхам экстракцыі РНК, сінтэзу кДНК і RT-qPCR. Для ін'екцыі экдызону 4-дзённым або 6-дзённым самкам, якія атрымлівалі крывёю нявінныя або нявінныя крывёю, уводзілі 0,13, 0,21 або 0,63 мкг 20E або 3D20E (Nanoject III, Drummond) у канцэнтрацыях 1,3, 2,1 адпаведна ў залежнасці ад эксперыментальнага дызайну або 6,3 нг нл-1. Уводзілі 100 нл 10% (аб'ём/аб'ём) этанолу ў вадзе; 100 нл 3D20E22P у 10% этаноле (эквівалентна 75% ад колькасці, знойдзенай у пары MAG). Камары былі выпадковым чынам размеркаваны ў групу ін'екцый.
Для нераставых аналізаў 3-дзённых самак кармілі ўволю чалавечай крывёю. Выдалілі часткова адкормленых або неадкормленых камароў. У залежнасці ад апрацоўкі, самак змяшчалі ў асобныя нераставыя кубкі на чатыры ночы не менш чым праз 48 гадзін пасля прыёму крыві. Яйкі падлічвалі пад стэрэаскопам (Stemi 508, Zeiss); у спаржаных самак яйкі, з якіх вылупіліся лічынкі, лічыліся апладнелымі.
Для выпрабаванняў на спарванне самкам давалі не менш за 2 дні ў залежнасці ад апрацоўкі, каб развіць рэзістэнтнасць да спарвання, і пасля гэтага ў тую ж клетку падсаджвалі самцоў дзікага тыпу таго ж узросту. Праз дзве ночы аплодненыя пузыркі самак былі рассячаны, і геномная ДНК была вызвалена шляхам замарожвання-адтавання і апрацоўкі ультрагукам у буферы, які змяшчае 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA і 25 мМ NaCl (pH 8,2). Узоры інкубавалі з пратэіназай K (0,86 мкг мкл-1) на працягу 15 хвілін пры 55°C, а затым 10 хвілін пры 95°C. Прэпараты неачышчанай геномнай ДНК былі разведзены ў 10 разоў і падвергнуты ПЛР-дэтэкцыі паслядоўнасцей Y-храмасомы; праймеры пералічаны ў пашыранай табліцы дадзеных 2. Адсутнасць паслядоўнасці Y-храмасомы сведчыць аб адсутнасці спарвання.
Для даследаванняў паўторнага спарвання самак, якіх прымусова спарвалі, даследавалі на наяўнасць парных коркаў, каб пацвердзіць статус спарвання, і давалі 2 дні для развіцця ўстойлівасці да спарвання ў адсутнасць самцоў, як апісана раней36. Самцоў з трансгеннай спермай DsRed затым уводзілі ў клеткі самак. Праз дзве ночы апладняльныя бурбалкі выдзялялі з самак, рыхтавалі геномную ДНК, як апісана вышэй, і падвяргалі яе выяўленню трансгена DsRed з дапамогай ПЛР; праймеры пералічаны ў пашыранай табліцы дадзеных 2. Адсутнасць трансгена DsRed сведчыла аб тым, што паўторнага спарвання не адбылося.
3D20E быў сінтэзаваны, як апісана раней37. Коратка, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) растварылі ў 10 мл вады, а затым дадалі 30 мг плацінавага чорнага (у выглядзе парашка, Sigma-Aldrich). У рэакцыйную сумесь бесперапынна прапускалі лёгкі струмень O2, якую перамешвалі пры пакаёвай тэмпературы. Праз 6 гадзін дадалі 30 мл метанолу, каб спыніць рэакцыю. Сумесь цэнтрыфугавалі для выдалення часціц каталізатара. Супернатант выпарвалі дасуха ў вакууме пры пакаёвай тэмпературы. Высушаны прадукт рэакцыі растварылі ў 10% этаноле і метаноле для ін'екцый для аналізу ВЭЖХ-МС/МС. Каэфіцыент канверсіі (з 20E у 3D20E) склаў прыблізна 97% (мал. 4b), а спектр МС сінтэзаванага 3D20E супадаў са спектрам, выяўленым у спарваных самак (мал. 4c).
Легенда змяшчае канкрэтныя звесткі аб праведзеных статыстычных тэстах. Для выканання дакладнага тэсту Фішэра, тэсту Мантэля-Кокса і t-тэсту Стьюдэнта выкарыстоўваўся GraphPad (версія 9.0). Тэсты Кокрана-Мантэля-Хензеля праводзіліся з выкарыстаннем карыстальніцкага скрыпта R (даступнага па адрасе https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Размеркаванне дадзеных правяралася на нармальнасць з выкарыстаннем тэсту Шапіра-Уілка з парогам значнасці 0,05. Калі дадзеныя не праходзілі тэст на нармальнасць, праводзіўся тэст Манна-Уітні. Дадзеныя выжывальнасці аналізаваліся з выкарыстаннем тэсту Мантэля-Кокса. Для правядзення аналізу дыферэнцыяльнай экспрэсіі на ўзроўні генаў RNA-seq выкарыстоўваўся пакет DESeq2 (версія 1.28.1). Гарызантальная паласа на графіку прадстаўляе медыяну. У якасці парога для ўсіх тэстаў выкарыстоўвалася значэнне значнасці P = 0,05.
Больш падрабязную інфармацыю пра дызайн даследавання можна знайсці ў анатацыі дакладу аб даследаванні прыроды, спасылка на які ёсць у гэтым артыкуле.
Дадзеныя пратэомікі MS былі перададзены ў кансорцыум ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) праз рэпазітар партнёраў PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) з ідэнтыфікатарам набору даных PXD032157.
Набор даных RNA-seq захоўваецца ў Комплекснай бібліятэцы экспрэсіі генаў (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) пад серыйным запісам GSE198665.
Дадатковыя наборы дадзеных, атрыманыя і/або прааналізаваныя падчас бягучага даследавання, могуць быць атрыманы ад адпаведных аўтараў па разумным запыце. У гэтым артыкуле прадстаўлены зыходныя дадзеныя.
Дэ Луф, А. Экдыстэроіды: забытыя палавыя стэроіды насякомых? Мужчынскі: Black Box. Навука пра насякомых. 13, 325–338 (2006).
Рэдферн, CPF 20-гідраксіэкдызон і развіццё яечнікаў у Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).