Прапіёнавая кіслата (ППК), супрацьгрыбковы сродак і распаўсюджаная харчовая дабаўка, паказала, што выклікае анамальнае нейраразвіццё ў мышэй, якое суправаджаецца парушэннем функцыі страўнікава-кішачнага гасцінца, што можа быць выклікана дысбіёзам кішачніка. Сувязь паміж уздзеяннем ППК з ежай і дысбіёзам кішачнай мікрабіёты была выказана меркаванне, але непасрэдна не даследавалася. Тут мы даследавалі звязаныя з ППК змены ў складзе кішачнай мікрабіёты, якія могуць прывесці да дысбіёзу. Кішачныя мікрабіёмы мышэй, якія атрымлівалі неапрацаваную дыету (n=9) і дыету, узбагачаную ППК (n=13), былі секвенаваны з выкарыстаннем метагеномнага секвенавання на вялікія адлегласці для ацэнкі адрозненняў у мікробным складзе і бактэрыяльных метабалічных шляхах. ППК з ежай была звязана са павелічэннем колькасці значных таксонаў, у тым ліку некалькіх відаў Bacteroides, Prevotella і Ruminococcus, прадстаўнікі якіх раней былі ўцягнутыя ў выпрацоўку ППК. Мікрабіёмы мышэй, якія атрымлівалі ўздзеянне ППК, таксама мелі больш шляхоў, звязаных з метабалізмам ліпідаў і біясінтэзам стэроідных гармонаў. Нашы вынікі паказваюць, што ППК можа змяняць кішачную мікрабіёту і звязаныя з ёй метабалічныя шляхі. Гэтыя назіраныя змены паказваюць, што кансерванты, класіфікаваныя як бяспечныя для ўжывання, могуць уплываць на склад мікрабіёты кішачніка і, у сваю чаргу, на здароўе чалавека. Сярод іх P, G або S выбіраецца ў залежнасці ад аналізуемага ўзроўню класіфікацыі. Каб мінімізаваць уплыў ілжыва станоўчых класіфікацый, быў прыняты мінімальны парог адноснай колькасці 1e-4 (1/10 000 прачытанняў). Перад статыстычным аналізам адносная колькасць, паведамленая Брэкенам (fraction_total_reads), была пераўтворана з выкарыстаннем пераўтварэння цэнтраванага лагарыфмічнага суадносін (CLR) (Aitchison, 1982). Метад CLR быў абраны для пераўтварэння дадзеных, таму што ён не залежыць ад маштабу і дастатковы для неразрэджаных набораў дадзеных (Gloor et al., 2017). Пераўтварэнне CLR выкарыстоўвае натуральны лагарыфм. Дадзеныя падліку, паведамленыя Брэкенам, былі нармалізаваны з выкарыстаннем адноснага лагарыфмічнага выразу (RLE) (Anders and Huber, 2010). Лічбы былі атрыманы з выкарыстаннем камбінацыі matplotlib версіі 3.7.1, seaborn версіі 3.7.2 і паслядоўных лагарыфмаў (Gloor et al., 2017). 0.12.2 і стантанатацыі версіі 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Суадносіны Bacillus/Bacteroidetes разлічваліся для кожнага ўзору з выкарыстаннем нармалізаванай колькасці бактэрый. Значэнні, прыведзеныя ў табліцах, акругляюцца да 4 знакаў пасля коскі. Індэкс разнастайнасці Сімпсана разлічваўся з выкарыстаннем скрыпта alpha_diversity.py, які ўваходзіць у пакет KrakenTools версіі 1.2 (Lu et al., 2022). Справаздача Брэкена прадстаўлена ў скрыпце, а індэкс Сімпсана «Si» прадстаўлены для параметра -an. Значныя адрозненні ў колькасці вызначаліся як сярэднія адрозненні CLR ≥ 1 або ≤ -1. Сярэдняя розніца CLR ±1 паказвае на павелічэнне колькасці тыпу ўзору ў 2,7 раза. Знак (+/-) паказвае, ці больш распаўсюджаны таксон у ўзоры PPA і кантрольным узоры адпаведна. Значнасць вызначалася з дапамогай U-крытэрыя Манна-Уітні (Virtanen et al., 2020). Выкарыстоўваўся Statsmodels версіі 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), а для карэкцыі множнага тэставання — працэдура Бенджаміні-Хохберга. У якасці парога для вызначэння статыстычнай значнасці выкарыстоўвалася скарэкціраванае p-значэнне ≤ 0,05.
Мікрабіём чалавека часта называюць «апошнім органам цела», і ён адыгрывае жыццёва важную ролю ў здароўі чалавека (Baquero and Nombela, 2012). У прыватнасці, мікрабіём кішачніка вядомы сваім уплывам на ўсю сістэму і роляй у многіх важных функцыях. Каменсальныя бактэрыі шматлікія ў кішачніку, займаючы мноства экалагічных ніш, выкарыстоўваючы пажыўныя рэчывы і канкуруючы з патэнцыйнымі патагенамі (Jandhyala et al., 2015). Розныя бактэрыяльныя кампаненты мікрабіёты кішачніка здольныя выпрацоўваць неабходныя пажыўныя рэчывы, такія як вітаміны, і спрыяць страваванню (Rowland et al., 2018). Таксама было паказана, што бактэрыяльныя метабаліты ўплываюць на развіццё тканін і ўзмацняюць метабалічныя і імунныя шляхі (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Склад мікрабіёма кішачніка чалавека надзвычай разнастайны і залежыць ад генетычных і экалагічных фактараў, такіх як дыета, пол, лекі і стан здароўя (Kumbhare et al., 2019).
Рацыён маці з'яўляецца найважнейшым кампанентам развіцця плёну і нованароджанага і меркаванай крыніцай злучэнняў, якія могуць уплываць на развіццё (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Адным з такіх цікавых злучэнняў з'яўляецца прапіёнавая кіслата (PPA), пабочны прадукт кароткаланцуговай тоўстай кіслаты, атрыманы ў выніку бактэрыяльнай ферментацыі, і харчовая дабаўка (den Besten et al., 2013). PPA валодае антыбактэрыйнымі і супрацьгрыбковымі ўласцівасцямі і таму выкарыстоўваецца ў якасці харчовага кансерванта і ў прамысловасці для інгібіравання росту цвілі і бактэрый (Wemmenhove et al., 2016). PPA аказвае розныя эфекты ў розных тканінах. У печані PPA аказвае супрацьзапаленчы эфект, уплываючы на экспрэсію цытакінаў у макрафагах (Kawasoe et al., 2022). Гэты рэгуляторны эфект назіраўся і ў іншых імунных клетках, што прыводзіць да зніжэння запалення (Haase et al., 2021). Аднак у мозгу назіраўся супрацьлеглы эфект. Папярэднія даследаванні паказалі, што ўздзеянне PPA выклікае аўтыстычныя паводзіны ў мышэй (El-Ansary et al., 2012). Іншыя даследаванні паказалі, што ППА можа выклікаць гліялёз і актываваць прозапаленчыя шляхі ў мозгу (Abdelli et al., 2019). Паколькі ППА з'яўляецца слабой кіслатой, яна можа дыфузіяваць праз кішачны эпітэлій у кроў і, такім чынам, пераадольваць рэстрыктыўныя бар'еры, у тым ліку гематаэнцэфалічны бар'ер, а таксама плацэнту (Stinson et al., 2019), што падкрэслівае важнасць ППА як рэгуляторнага метабаліту, які выпрацоўваецца бактэрыямі. Нягледзячы на тое, што патэнцыйная роля ППА як фактару рызыкі аўтызму ў цяперашні час даследуецца, яе ўздзеянне на людзей з аўтызмам можа выходзіць за рамкі індукцыі нейронавай дыферэнцыяцыі.
Страўнікава-кішачныя сімптомы, такія як дыярэя і завала, часта сустракаюцца ў пацыентаў з нейраразвіццёвымі парушэннямі (Cao et al., 2021). Папярэднія даследаванні паказалі, што мікрабіём пацыентаў з расстройствамі аўтыстычнага спектру (РАС) адрозніваецца ад мікрабіёма здаровых людзей, што сведчыць аб наяўнасці дысбіёзу кішачнай мікрабіёты (Finegold et al., 2010). Падобным чынам, характарыстыкі мікрабіёма пацыентаў з запаленчымі захворваннямі кішачніка, атлусценнем, хваробай Альцгеймера і г.д. таксама адрозніваюцца ад характарыстык здаровых людзей (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Аднак да гэтага часу не ўстаноўлена прычынна-выніковай сувязі паміж мікрабіёмам кішачніка і неўралагічнымі захворваннямі або сімптомамі (Yap et al., 2021), хоць лічыцца, што некалькі відаў бактэрый гуляюць ролю ў некаторых з гэтых захворванняў. Напрыклад, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio і іншыя роды больш распаўсюджаныя ў мікрабіёце пацыентаў з аўтызмам (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Варта адзначыць, што віды некаторых з гэтых родаў, як вядома, валодаюць генамі, звязанымі з выпрацоўкай PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Улічваючы антымікробныя ўласцівасці PPA, павелічэнне яе колькасці можа быць карысным для росту бактэрый, якія выпрацоўваюць PPA (Jacobson et al., 2018). Такім чынам, асяроддзе, багатае на PFA, можа прывесці да змен у мікрабіёце кішачніка, у тым ліку да страўнікава-кішачных патагенаў, якія могуць быць патэнцыйнымі фактарамі, якія прыводзяць да страўнікава-кішачных сімптомаў.
Цэнтральнае пытанне ў даследаваннях мікрабіёма заключаецца ў тым, ці з'яўляюцца адрозненні ў мікробным складзе прычынай або сімптомам асноўных захворванняў. Першым крокам да высвятлення складанай сувязі паміж дыетай, мікрабіёмам кішачніка і неўралагічнымі захворваннямі з'яўляецца ацэнка ўплыву дыеты на мікробны склад. З гэтай мэтай мы выкарысталі метагеномнае секвенаванне з доўгім чытаннем, каб параўнаць мікрабіёмы кішачніка нашчадкаў мышэй, якіх кармілі дыетай, багатай або збедненай ППА. Нашчадкаў кармілі той жа дыетай, што і іх маці. Мы выказалі гіпотэзу, што дыета, багатая ППА, прывядзе да змен у мікробным складзе кішачніка і мікробных функцыянальных шляхах, асабліва тых, якія звязаны з метабалізмам ППА і/або выпрацоўкай ППА.
У гэтым даследаванні выкарыстоўваліся трансгенныя мышы FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), якія пад кантролем глія-спецыфічнага прамотара GFAP павышаюць экспрэсію зялёнага флуарэсцэнтнага бялку (GFP) у адпаведнасці з рэкамендацыямі Камітэта па доглядзе і выкарыстанні жывёл Універсітэта Цэнтральнай Фларыды (UCF-IACUC) (нумар дазволу на выкарыстанне жывёл: PROTO202000002). Пасля адлучэння мышэй размяшчалі індывідуальна ў клетках па 1-5 мышэй кожнага полу ў клетцы. Мышэй кармілі ўволю альбо ачышчанай кантрольнай дыетай (мадыфікаваная адкрытая стандартная дыета, 16 ккал% тлушчу), альбо дыетай з даданнем прапіянату натрыю (мадыфікаваная адкрытая стандартная дыета, 16 ккал% тлушчу, якая змяшчае 5000 ppm прапіянату натрыю). Колькасць выкарыстанага прапіянату натрыю была эквівалентная 5000 мг PFA/кг агульнай вагі корму. Гэта самая высокая канцэнтрацыя PPA, дазволеная для выкарыстання ў якасці харчовага кансерванта. Для падрыхтоўкі да гэтага даследавання бацькоўскіх мышэй кармілі абедзвюма дыетамі на працягу 4 тыдняў да спарвання і працягвалі карміць на працягу ўсёй цяжарнасці маці. Нашчадкаў мышэй [22 мышы, 9 кантрольных (6 самцоў, 3 самкі) і 13 мышэй з групы PPA (4 самцы, 9 самак)] адлучылі ад грудзей, а затым працягвалі карміць тым жа рацыёнам, што і маці, на працягу 5 месяцаў. Нашчадкаў мышэй забівалі ва ўзросце 5 месяцаў, збіралі іх кішачны кал і спачатку захоўвалі ў мікрацэнтрыфужных прабірках аб'ёмам 1,5 мл пры тэмпературы -20°C, а затым пераносілі ў маразільную камеру пры тэмпературы -80°C да знясілення ДНК гаспадара і экстракцыі мікробных нуклеінавых кіслот.
ДНК гаспадара выдалялі згодна з мадыфікаваным пратаколам (Charalampous et al., 2019). Карацей кажучы, фекаліі пераносілі ў 500 мкл InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) і захоўвалі замарожанымі. Апрацоўвалі максімум 1-2 фекальныя асадкі на адну экстракцыю. Затым фекаліі механічна гамагенізавалі з дапамогай пластыкавага песціка ўнутры прабіркі для ўтварэння суспензіі. Цэнтрыфугавалі ўзоры пры 10 000 RCF на працягу 5 хвілін або пакуль узоры не асадкаваліся, затым адсмоктвалі супернатант і рэсуспендавалі асадак у 250 мкл 1× PBS. Дадалі 250 мкл 4,4% раствора сапаніна (TCI, нумар прадукту S0019) да ўзору ў якасці дэтэргента для разрыхлення мембран эўкарыятычных клетак. Узоры акуратна змешвалі да аднароднай масы і інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 10 хвілін. Далей, каб разбурыць эўкарыятычныя клеткі, да ўзору дадалі 350 мкл вады без нуклеаз, інкубавалі на працягу 30 секунд, а затым дадалі 12 мкл 5 М NaCl. Затым узоры цэнтрыфугавалі пры 6000 RCF на працягу 5 хвілін. Адсмоктвайце супернатант і рэсуспендуйце асадак у 100 мкл 1X PBS. Каб выдаліць ДНК гаспадара, дадайце 100 мкл буфера HL-SAN (12,8568 г NaCl, 4 мл 1 М MgCl2, 36 мл вады без нуклеаз) і 10 мкл фермента HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Узоры старанна змяшалі піпеткай і інкубавалі пры тэмпературы 37 °C на працягу 30 хвілін пры 800 аб/мін на Eppendorf™ ThermoMixer C. Пасля інкубацыі цэнтрыфугавалі пры 6000 RCF на працягу 3 хвілін і двойчы прамылі 800 мкл і 1000 мкл 1X PBS. Нарэшце, рэсуспендавалі асадак у 100 мкл 1X PBS.
Агульную бактэрыяльную ДНК вылучалі з выкарыстаннем набору для ачысткі геномнай ДНК New England Biolabs Monarch (New England Biolabs, Іпсвіч, Масачусэтс, кат. № T3010L). Стандартная аперацыйная працэдура, якая пастаўляецца з наборам, нязначна мадыфікавана. Перад аперацыяй для канчатковага элюіравання інкубуйце і падтрымлівайце ваду без нуклеаз пры тэмпературы 60°C. Дадайце 10 мкл пратэіназы K і 3 мкл РНКазы A да кожнага ўзору. Затым дадайце 100 мкл буфера для лізісу клетак і акуратна змяшайце. Затым узоры інкубавалі ў Eppendorf™ ThermoMixer C пры тэмпературы 56°C і 1400 абаротаў у хвіліну на працягу не менш за 1 гадзіну і да 3 гадзін. Інкубаваныя ўзоры цэнтрыфугавалі пры 12 000 RCF на працягу 3 хвілін, і супернатант з кожнага ўзору пераносілі ў асобную мікрацэнтрыфужную прабірку аб'ёмам 1,5 мл, якая змяшчала 400 мкл раствора для звязвання. Затым прабіркі імпульсна перамешвалі на працягу 5-10 секунд з інтэрвалам у 1 секунду. Перанясіце ўвесь аб'ём вадкасці кожнага ўзору (прыблізна 600–700 мкл) у фільтруючы картрыдж, змешчаны ў праточную прабірку для збору. Прабіркі цэнтрыфугавалі пры 1000 RCF на працягу 3 хвілін, каб забяспечыць пачатковае звязванне ДНК, а затым цэнтрыфугавалі пры 12 000 RCF на працягу 1 хвіліны для выдалення рэшткавай вадкасці. Калонку з узорам перанеслі ў новую прабірку для збору, а затым прамылі двойчы. Для першага прамывання дадайце 500 мкл прамыўнога буфера ў кожную прабірку. Перавярніце прабірку 3–5 разоў, а затым цэнтрыфугавалі пры 12 000 RCF на працягу 1 хвіліны. Выліце вадкасць з прабіркі для збору і змясціце фільтруючы картрыдж назад у тую ж прабірку. Для другога прамывання дадайце 500 мкл прамыўнога буфера ў фільтр, не пераварочваючы. Узоры цэнтрыфугавалі пры 12 000 RCF на працягу 1 хвіліны. Перанясіце фільтр у прабірку LoBind® аб'ёмам 1,5 мл і дадайце 100 мкл папярэдне нагрэтай вады без нуклеаз. Фільтры інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 1 хвіліны, а затым цэнтрыфугавалі пры 12 000 RCF на працягу 1 хвіліны. Элюяваную ДНК захоўвалі пры тэмпературы -80°C.
Канцэнтрацыю ДНК колькасна вызначалі з дапамогай флуарометра Qubit™ 4.0. ДНК рыхтавалі з выкарыстаннем набору Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (кат. № Q33231) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Размеркаванне даўжыні фрагментаў ДНК вымяралі з дапамогай прыбора Aglient™ 4150 або 4200 TapeStation. ДНК рыхтавалі з выкарыстаннем рэагентаў Agilent™ Genomic DNA Reagents (кат. № 5067-5366) і Genomic DNA ScreenTape (кат. № 5067-5365). Падрыхтоўка бібліятэкі праводзілася з выкарыстаннем набору Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. ДНК секвенавалі з выкарыстаннем секвенара ONT GridION™ Mk1 з праточнай ячэйкай Min106D (R 9.4.1). Налады секвенавання былі наступнымі: высокадакладны набор асноў, мінімальнае значэнне q 9, налада штрых-кода і абрэзка штрых-кода. Узоры секвенавалі на працягу 72 гадзін, пасля чаго дадзеныя базавага выкліку былі адпраўлены для далейшай апрацоўкі і аналізу.
Біяінфарматычная апрацоўка праводзілася з выкарыстаннем раней апісаных метадаў (Greenman et al., 2024). Файлы FASTQ, атрыманыя ў выніку секвенавання, былі падзелены на каталогі для кожнага ўзору. Перад біяінфарматычным аналізам дадзеныя апрацоўваліся з выкарыстаннем наступнага канвеера: спачатку файлы FASTQ узораў былі аб'яднаны ў адзін файл FASTQ. Затым, чытанні карацейшыя за 1000 пар асноў былі адфільтраваны з выкарыстаннем Filtlong версіі 0.2.1, прычым адзіны зменены параметр быў –min_length 1000 (Wick, 2024). Перад далейшай фільтрацыяй якасць чытання кантралявалася з выкарыстаннем NanoPlot версіі 1.41.3 з наступнымі параметрамі: –fastq –plots dot –N50 -o
Для таксанамічнай класіфікацыі прачытаныя і сабраныя кантыгі былі класіфікаваны з выкарыстаннем Kraken2 версіі 2.1.2 (Wood et al., 2019). Генерацыя справаздач і выходных файлаў для прачытаных і зборак адпаведна. Выкарыстоўвайце опцыю –use-names для аналізу прачытаных і зборак. Опцыі –gzip-compressed і –paired пазначаны для сегментаў прачытаных. Адносная колькасць таксонаў у метагеномах была ацэненая з выкарыстаннем Bracken версіі 2.8 (Lu et al., 2017). Спачатку мы стварылі базу дадзеных kmer, якая змяшчае 1000 баз, выкарыстоўваючы bracken-build з наступнымі параметрамі: -d
Анатацыя генаў і ацэнка адноснай колькасці былі выкананы з выкарыстаннем мадыфікаванай версіі пратакола, апісанага Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Спачатку кантыгі даўжынёй менш за 500 пар асноў былі выдалены з усіх зборак з дапамогай SeqKit версіі 2.5.1 (Shen et al., 2016). Затым выбраныя зборкі былі аб'яднаны ў пан-метагеном. Адкрытыя рамкі зчытвання (ORF) былі ідэнтыфікаваны з выкарыстаннем Prodigal версіі 1.0.1 (паралельная версія Prodigal версіі 2.6.3) з наступнымі параметрамі: -d
Спачатку гены былі згрупаваны ў адпаведнасці з ідэнтыфікатарамі арталогаў (KO) Кіёцкай энцыклапедыі генаў і геномаў (KEGG), прызначанымі eggNOG, для параўнання колькасці генных шляхоў. Гены без накаўтаў або гены з некалькімі накаўтамі былі выдалены перад аналізам. Затым была разлічана сярэдняя колькасць кожнага KO на ўзор і праведзены статыстычны аналіз. Гены метабалізму PPA былі вызначаны як любы ген, якому быў прызначаны радок ko00640 у слупку KEGG_Pathway, што паказвае на ролю ў метабалізме прапіянату ў адпаведнасці з KEGG. Гены, ідэнтыфікаваныя як звязаныя з прадукцыяй PPA, пералічаны ў Дадатковай табліцы 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Былі праведзены перастановачныя тэсты для ідэнтыфікацыі генаў метабалізму і прадукцыі PPA, якія былі значна больш распаўсюджаныя ў кожным тыпе ўзору. Для кожнага аналізаванага гена была выканана тысяча перастановак. У якасці парога для вызначэння статыстычнай значнасці выкарыстоўвалася p-значэнне 0,05. Функцыянальныя анатацыі былі прызначаны асобным генам у кластары на аснове анатацый прадстаўнічых генаў у кластары. Таксоны, звязаныя з метабалізмам PPA і/або выпрацоўкай PPA, можна было ідэнтыфікаваць шляхам супастаўлення ідэнтыфікатараў кантыгаў у выходных файлах Kraken2 з тымі ж ідэнтыфікатарамі кантыгаў, якія захаваліся падчас функцыянальнай анатацыі з выкарыстаннем eggNOG. Праверка значнасці была праведзена з выкарыстаннем U-крытэрыя Манна-Уітні, апісанага раней. Карэкцыя на множнае тэставанне была праведзена з выкарыстаннем працэдуры Бенджаміні-Хохберга. У якасці парога для вызначэння статыстычнай значнасці выкарыстоўвалася значэнне p ≤ 0,05.
Разнастайнасць мікрабіёма кішачніка мышэй ацэньвалі з дапамогай індэкса разнастайнасці Сімпсана. Істотных адрозненняў паміж кантрольнымі ўзорамі і ўзорамі PPA з пункту гледжання родавай і відавой разнастайнасці не назіралася (p-значэнне для роду: 0,18, p-значэнне для віду: 0,16) (Малюнак 1). Мікробны склад затым параўноўвалі з дапамогай аналізу галоўных кампанент (PCA). На малюнку 2 паказана кластарызацыя ўзораў па іх тыпах, што сведчыць аб наяўнасці адрозненняў у відавым складзе мікрабіёмаў паміж узорамі PPA і кантрольнымі ўзорамі. Гэтая кластарызацыя была менш выяўленай на ўзроўні роду, што сведчыць аб тым, што PPA уплывае на пэўныя бактэрыі (Дадатковы малюнак 1).
Малюнак 1. Альфа-разнастайнасць родаў і відавы склад мікрабіёма кішачніка мышэй. Рамкавыя дыяграмы, якія паказваюць індэксы разнастайнасці Сімпсана родаў (A) і відаў (B) у PPA і кантрольных узорах. Значнасць вызначалася з дапамогай U-крытэрыя Манна-Уітні, а множная карэкцыя праводзілася з выкарыстаннем працэдуры Бенджаміні-Хохберга. ns, p-значэнне не было значным (p>0,05).
Малюнак 2. Вынікі аналізу галоўных кампанент складу мікрабіёма кішачніка мышэй на ўзроўні віду. Графік аналізу галоўных кампанент паказвае размеркаванне ўзораў па іх першых двух галоўных кампанентах. Колеры паказваюць тып узору: мышы, якія атрымлівалі PPA, маюць фіялетавы колер, а кантрольныя мышы — жоўты. Галоўныя кампаненты 1 і 2 адкладзены на восі x і восі y адпаведна і выражаны як іх растлумачаны каэфіцыент дысперсіі.
Выкарыстоўваючы дадзеныя падліку, трансфармаваныя з дапамогай RLE, назіралася значнае зніжэнне сярэдняга суадносін бактэрыяльных бактерій і бацыл у кантрольнай групе і мышэй PPA (кантроль: 9,66, PPA: 3,02; p-значэнне = 0,0011). Гэта адрозненне было абумоўлена большай колькасцю бактэрыяльных бактерій у мышэй PPA ў параўнанні з кантрольнай групай, хоць розніца не была значнай (сярэдні CLR кантрольнай групы: 5,51, сярэдні CLR PPA: 6,62; p-значэнне = 0,054), у той час як колькасць бактэрыяльных бактерій была падобнай (сярэдні CLR кантрольнай групы: 7,76, сярэдні CLR PPA: 7,60; p-значэнне = 0,18).
Аналіз колькасці таксанамічных членаў мікрабіёма кішачніка паказаў, што 1 тып і 77 відаў істотна адрозніваліся паміж узорамі PPA і кантрольнымі ўзорамі (Дадатковая табліца 2). Колькасць 59 відаў ва ўзорах PPA была значна вышэйшай, чым у кантрольных узорах, у той час як колькасць толькі 16 відаў у кантрольных узорах была вышэйшай, чым ва ўзорах PPA (Малюнак 3).
Малюнак 3. Розніца ў колькасці таксонаў у мікрабіёме кішачніка мышэй PPA і кантрольных мышэй. Дыяграмы вулканаў паказваюць адрозненні ў колькасці родаў (A) або відаў (B) паміж узорамі PPA і кантрольнымі ўзорамі. Шэрыя кропкі паказваюць на адсутнасць істотнай розніцы ў колькасці таксонаў. Каляровыя кропкі паказваюць значныя адрозненні ў колькасці (p-значэнне ≤ 0,05). 20 найбуйнейшых таксонаў з найбольшымі адрозненнямі ў колькасці паміж тыпамі ўзораў паказаны чырвоным і светла-сінім колерамі (кантрольныя ўзоры і ўзоры PPA) адпаведна. Жоўтыя і фіялетавыя кропкі былі як мінімум у 2,7 разы больш распаўсюджаныя ў кантрольных узорах або ўзорах PPA, чым у кантрольных. Чорныя кропкі прадстаўляюць таксоны са значна рознай колькасцю, з сярэднімі адрозненнямі CLR ад -1 да 1. Значэнні P былі разлічаны з выкарыстаннем U-крытэрыя Манна-Уітні і скарэкціраваны для шматразовага тэставання з выкарыстаннем працэдуры Бенджаміні-Хохберга. Выдзеленыя тлустым шрыфтам сярэднія адрозненні CLR паказваюць значныя адрозненні ў колькасці.
Пасля аналізу мікробнага складу кішачніка мы правялі функцыянальную анатацыю мікрабіёма. Пасля фільтрацыі генаў нізкай якасці ва ўсіх узорах было выяўлена ў агульнай складанасці 378 355 унікальных генаў. Трансфармаваная колькасць гэтых генаў была выкарыстана для аналізу галоўных кампанент (PCA), і вынікі паказалі высокую ступень кластэрызацыі тыпаў узораў на аснове іх функцыянальных профіляў (малюнак 4).
Малюнак 4. Вынікі PCA з выкарыстаннем функцыянальнага профілю мікрабіёма кішачніка мышэй. Графік PCA паказвае размеркаванне ўзораў па іх першых двух асноўных кампанентах. Колеры паказваюць тып узору: мышы, якія атрымлівалі PPA, маюць фіялетавы колер, а кантрольныя мышы — жоўты. Асноўныя кампаненты 1 і 2 адкладзены на восі x і восі y адпаведна і выражаны як іх растлумачаны каэфіцыент дысперсіі.
Далей мы вывучылі колькасць накаўтаў KEGG у розных тыпах узораў. Усяго было выяўлена 3648 унікальных накаўтаў, з якіх 196 былі значна больш распаўсюджаныя ў кантрольных узорах, а 106 — ва ўзорах PPA (малюнак 5). У кантрольных узорах было выяўлена 145 генаў, а ва ўзорах PPA — 61 ген, прычым іх колькасць значна адрознівалася. Шляхі, звязаныя з метабалізмам ліпідаў і амінацукроў, былі значна больш узбагачаныя ва ўзорах PPA (дадатковая табліца 3). Шляхі, звязаныя з метабалізмам азоту і сістэмамі рэле серы, былі значна больш узбагачаныя ў кантрольных узорах (дадатковая табліца 3). Колькасць генаў, звязаных з метабалізмам амінацукроў/нуклеатыдаў (ko:K21279) і метабалізмам іназітолфасфату (ko:K07291), была значна вышэйшай ва ўзорах PPA (малюнак 5). Кантрольныя ўзоры мелі значна больш генаў, звязаных з метабалізмам бензаату (ko:K22270), метабалізмам азоту (ko:K00368) і гліколізам/глюканеагенезам (ko:K00131) (малюнак 5).
Мал. 5. Розніца ў колькасці кішачных атопаў (KO) у мікрабіёме кішачніка мышэй PPA і кантрольнай групы. Вулканічны графік паказвае адрозненні ў колькасці функцыянальных груп (KO). Шэрыя кропкі паказваюць KO, колькасць якіх істотна не адрознівалася паміж тыпамі ўзораў (p-значэнне > 0,05). Каляровыя кропкі паказваюць значныя адрозненні ў колькасці (p-значэнне ≤ 0,05). 20 KO з найбольшымі адрозненнямі ў колькасці паміж тыпамі ўзораў паказаны чырвоным і светла-сінім колерамі, што адпавядае кантрольным узорам і ўзорам PPA адпаведна. Жоўтыя і фіялетавыя кропкі паказваюць KO, якія былі як мінімум у 2,7 разы больш распаўсюджаныя ў кантрольных узорах і ўзорах PPA адпаведна. Чорныя кропкі паказваюць KO са значна рознай колькасцю, з сярэднімі адрозненнямі CLR паміж -1 і 1. Значэнні P былі разлічаны з выкарыстаннем U-крытэрыя Манна-Уітні і скарэкціраваны для множных параўнанняў з выкарыстаннем працэдуры Бенджаміні-Хохберга. NaN паказвае, што KO не належыць да шляху ў KEGG. Тлустым шрыфтам выдзелены сярэднія значэнні розніцы CLR паказваюць значныя адрозненні ў колькасці. Падрабязную інфармацыю пра шляхі, да якіх належаць пералічаныя KO, гл. у Дадатковай табліцы 3.
Сярод анатаваных генаў 1601 ген меў значна розную колькасць паміж тыпамі ўзораў (p ≤ 0,05), прычым кожны ген быў як мінімум у 2,7 раза больш распаўсюджаны. З гэтых генаў 4 гены былі больш распаўсюджаныя ў кантрольных узорах, а 1597 генаў - больш распаўсюджаныя ва ўзорах PPA. Паколькі PPA валодае антымікробнымі ўласцівасцямі, мы даследавалі колькасць генаў метабалізму і прадукцыі PPA паміж тыпамі ўзораў. Сярод 1332 генаў, звязаных з метабалізмам PPA, 27 генаў былі значна больш распаўсюджаныя ў кантрольных узорах, а 12 генаў - больш распаўсюджаныя ва ўзорах PPA. Сярод 223 генаў, звязаных з вытворчасцю PPA, 1 ген быў значна больш распаўсюджаны ва ўзорах PPA. Малюнак 6А дадаткова дэманструе больш высокую колькасць генаў, якія ўдзельнічаюць у метабалізме PPA, са значна большай колькасцью ў кантрольных узорах і вялікімі памерамі эфекту, у той час як на малюнку 6B вылучаны асобныя гены са значна большай колькасцью, якая назіралася ва ўзорах PPA.
Мал. 6. Дыферэнцыяльная колькасць генаў, звязаных з PPA, у мікрабіёме кішачніка мышэй. Вулканічныя дыяграмы паказваюць адрозненні ў колькасці генаў, звязаных з метабалізмам PPA (A) і выпрацоўкай PPA (B). Шэрыя кропкі паказваюць гены, колькасць якіх істотна не адрознівалася паміж тыпамі ўзораў (p-значэнне > 0,05). Каляровыя кропкі паказваюць значныя адрозненні ў колькасці (p-значэнне ≤ 0,05). 20 генаў з найбольшымі адрозненнямі ў колькасці паказаны чырвоным і светла-сінім колерамі (кантрольныя ўзоры і ўзоры PPA) адпаведна. Колькасць жоўтых і фіялетавых кропак была як мінімум у 2,7 разы большай у кантрольных узорах і ўзорах PPA, чым у кантрольных узорах. Чорныя кропкі прадстаўляюць гены са значна рознай колькасцю, з сярэднімі адрозненнямі CLR паміж -1 і 1. Значэнні P былі разлічаны з выкарыстаннем U-крытэрыя Манна-Уітні і скарэкціраваны для множных параўнанняў з выкарыстаннем працэдуры Бенджаміні-Хохберга. Гены адпавядаюць рэпрэзентатыўным генам у нелішнім каталогу генаў. Назвы генаў складаюцца з сімвала KEGG, які абазначае ген KO. Тлустыя сярэднія адрозненні CLR паказваюць істотна розную колькасць. Працяжнік (-) паказвае, што ў базе дадзеных KEGG няма сімвала для гэтага гена.
Таксоны з генамі, звязанымі з метабалізмам і/або вытворчасцю PPA, былі ідэнтыфікаваны шляхам супастаўлення таксанамічнай ідэнтычнасці кантыгаў з ідэнтыфікатарам кантыга гена. На ўзроўні роду было выяўлена, што 130 родаў маюць гены, звязаныя з метабалізмам PPA, і 61 род мае гены, звязаныя з вытворчасцю PPA (Дадатковая табліца 4). Аднак ні адзін род не паказаў істотных адрозненняў у колькасці (p > 0,05).
На відавым узроўні было выяўлена, што 144 віды бактэрый маюць гены, звязаныя з метабалізмам ППА, і 68 відаў бактэрый маюць гены, звязаныя з выпрацоўкай ППА (Дадатковая табліца 5). Сярод метабалізмаў ППА восем бактэрый прадэманстравалі значнае павелічэнне колькасці паміж тыпамі ўзораў, і ўсе прадэманстравалі значныя змены ў эфекце (Дадатковая табліца 6). Усе выяўленыя метабалізмы ППА са значнымі адрозненнямі ў колькасці былі больш распаўсюджаныя ва ўзорах ППА. Класіфікацыя на відавым узроўні выявіла прадстаўнікоў родаў, якія істотна не адрозніваліся паміж тыпамі ўзораў, у тым ліку некалькі відаў Bacteroides і Ruminococcus, а таксама Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus і Alcaligenes polymorpha. Сярод бактэрый, якія выпрацоўваюць ППА, чатыры бактэрыі прадэманстравалі значныя адрозненні ў колькасці паміж тыпамі ўзораў. Віды са значнымі адрозненнямі ў колькасці ўключалі Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis і Ruminococcus bovis.
У гэтым даследаванні мы вывучылі ўплыў уздзеяння PPA на мікрабіёту кішачніка мышэй. PPA можа выклікаць розныя рэакцыі ў бактэрый, паколькі яна выпрацоўваецца пэўнымі відамі, выкарыстоўваецца ў якасці крыніцы ежы іншымі відамі або мае антымікробны эфект. Такім чынам, яе даданне ў кішачнае асяроддзе праз харчовыя дабаўкі можа мець розныя эфекты ў залежнасці ад талерантнасці, успрымальнасці і здольнасці выкарыстоўваць яе ў якасці крыніцы пажыўных рэчываў. Адчувальныя віды бактэрый могуць быць ліквідаваны і заменены тымі, якія больш устойлівыя да PPA або здольныя выкарыстоўваць яе ў якасці крыніцы ежы, што прыводзіць да змен у складзе мікрабіёты кішачніка. Нашы вынікі выявілі значныя адрозненні ў мікробным складзе, але не паўплывалі на агульную мікробную разнастайнасць. Найбольшыя эфекты назіраліся на відавым узроўні, прычым больш за 70 таксонаў значна адрозніваліся па колькасці паміж PPA і кантрольнымі ўзорамі (Дадатковая табліца 2). Далейшая ацэнка складу ўзораў, якія падвяргаліся ўздзеянню PPA, выявіла большую гетэрагеннасць мікробных відаў у параўнанні з непадвярганымі ўздзеянню ўзорамі, што сведчыць аб тым, што PPA можа паляпшаць характарыстыкі росту бактэрый і абмяжоўваць бактэрыяльныя папуляцыі, якія могуць выжываць у асяроддзях, багатых на PPA. Такім чынам, ППА можа выбарачна выклікаць змены, а не выклікаць шырокамаштабнае парушэнне разнастайнасці кішачнай мікрабіёты.
Раней было паказана, што харчовыя кансерванты, такія як PPA, змяняюць колькасць кампанентаў мікрабіёма кішачніка, не ўплываючы на агульную разнастайнасць (Nagpal et al., 2021). Тут мы назіралі найбольш яркія адрозненні паміж відамі Bacteroidetes у межах тыпу Bacteroidetes (раней вядомых як Bacteroidetes), якія былі значна ўзбагачаны ў мышэй, якія падвяргаліся ўздзеянню PPA. Павелічэнне колькасці відаў Bacteroides звязана з павелічэннем дэградацыі слізі, што можа павялічыць рызыку інфекцыі і спрыяць запаленню (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Адно даследаванне паказала, што нованароджаныя самцы мышэй, якія атрымлівалі Bacteroides fragilis, праяўлялі сацыяльную паводзіны, якая нагадвае расстройства аўтыстычнага спектру (РАС) (Carmel et al., 2023), а іншыя даследаванні паказалі, што віды Bacteroides могуць змяняць імунную актыўнасць і прыводзіць да аўтаімуннай запаленчай кардыяміяпатыі (Gil-Cruz et al., 2019). Віды, якія адносяцца да родаў Ruminococcus, Prevotella і Parabacteroides, таксама значна павялічыліся ў мышэй, якія падвяргаліся ўздзеянню PPA (Coretti et al., 2018). Некаторыя віды Ruminococcus звязаны з такімі захворваннямі, як хвароба Крона, праз выпрацоўку прозапаленчых цытакінаў (Henke et al., 2019), у той час як віды Prevotella, такія як Prevotella humani, звязаны з метабалічнымі захворваннямі, такімі як гіпертанія і адчувальнасць да інсуліну (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Нарэшце, мы выявілі, што суадносіны Bacteroidetes (раней вядомых як Firmicutes) да Bacteroidetes было значна ніжэйшым у мышэй, якія падвяргаліся ўздзеянню PPA, чым у кантрольных мышэй з-за большай агульнай колькасці відаў Bacteroidetes. Раней было паказана, што гэтае суадносіны з'яўляецца важным паказчыкам кішачнага гамеастазу, і парушэнні гэтага суадносін былі звязаны з рознымі захворваннямі (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), у тым ліку з запаленчымі захворваннямі кішачніка (Stojanov et al., 2020). У цэлым, віды тыпу Bacteroidetes, відаць, найбольш моцна пакутуюць ад падвышанага ўзроўню ППА ў ежы. Гэта можа быць звязана з больш высокай талерантнасцю да ППА або здольнасцю выкарыстоўваць ППА ў якасці крыніцы энергіі, што, як было паказана, праўда прынамсі для аднаго віду, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Акрамя таго, уздзеянне ППА на маці можа палепшыць развіццё плёну, робячы кішачнік нашчадкаў мышэй больш успрымальным да каланізацыі Bacteroidetes; аднак дызайн нашага даследавання не дазволіў правесці такую ацэнку.
Метагеномная ацэнка зместу выявіла значныя адрозненні ў колькасці генаў, звязаных з метабалізмам і выпрацоўкай ППА, прычым у мышэй, якія атрымлівалі ППА, назіралася большая колькасць генаў, адказных за выпрацоўку ППА, у той час як у мышэй, якія не атрымлівалі ППА, назіралася большая колькасць генаў, адказных за метабалізм ППА (Малюнак 6). Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што ўплыў ППА на мікробны склад можа быць не толькі абумоўлены яго выкарыстаннем, інакш колькасць генаў, звязаных з метабалізмам ППА, павінна была б паказваць большую колькасць у мікрабіёме кішачніка мышэй, якія атрымлівалі ППА. Адно з тлумачэнняў заключаецца ў тым, што ППА апасродкуе колькасць бактэрый у першую чаргу праз свае антымікробныя эфекты, а не праз выкарыстанне бактэрыямі ў якасці пажыўнага рэчыва. Папярэднія даследаванні паказалі, што ППА інгібіруе рост Salmonella Typhimurium дозазалежным чынам (Jacobson et al., 2018). Уздзеянне больш высокіх канцэнтрацый ППА можа прывесці да адбору бактэрый, якія ўстойлівыя да яго антымікробных уласцівасцей і не абавязкова здольныя метабалізаваць або выпрацоўваць яго. Напрыклад, некалькі відаў Parabacteroides прадэманстравалі значна большую колькасць ва ўзорах PPA, але генаў, звязаных з метабалізмам або вытворчасцю PPA, не было выяўлена (дадатковыя табліцы 2, 4 і 5). Акрамя таго, прадукцыя PPA як пабочнага прадукту ферментацыі шырока распаўсюджана сярод розных бактэрый (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Большая бактэрыяльная разнастайнасць можа быць прычынай большай колькасці генаў, звязаных з метабалізмам PPA, у кантрольных узорах (Averina et al., 2020). Акрамя таго, прагназавалася, што толькі 27 (2,14%) з 1332 генаў звязаны выключна з метабалізмам PPA. Многія гены, звязаныя з метабалізмам PPA, таксама ўдзельнічаюць у іншых метабалічных шляхах. Гэта дадаткова сведчыць аб тым, што колькасць генаў, якія ўдзельнічаюць у метабалізме PPA, была вышэйшай у кантрольных узорах; гэтыя гены могуць функцыянаваць у шляхах, якія не прыводзяць да ўтылізацыі або ўтварэння PPA ў якасці пабочнага прадукту. У гэтым выпадку толькі адзін ген, звязаны з утварэннем PPA, прадэманстраваў значныя адрозненні ў колькасці паміж тыпамі ўзораў. У адрозненне ад генаў, звязаных з метабалізмам ППА, маркерныя гены для выпрацоўкі ППА былі выбраны, таму што яны непасрэдна ўдзельнічаюць у бактэрыяльным шляху выпрацоўкі ППА. У мышэй, якія падвяргаліся ўздзеянню ППА, ва ўсіх відаў было выяўлена значнае павелічэнне колькасці і здольнасці выпрацоўваць ППА. Гэта пацвярджае прагноз аб тым, што ППА будуць адбіраць прадуцэнтаў ППА і, такім чынам, прадказваюць павелічэнне здольнасці выпрацоўваць ППА. Аднак колькасць генаў не абавязкова карэлюе з экспрэсіяй генаў; такім чынам, хоць колькасць генаў, звязаных з метабалізмам ППА, вышэйшая ў кантрольных узорах, хуткасць экспрэсіі можа адрознівацца (Shi et al., 2014). Каб пацвердзіць сувязь паміж распаўсюджанасцю генаў, якія выпрацоўваюць ППА, і выпрацоўкай ППА, неабходныя даследаванні экспрэсіі генаў, якія ўдзельнічаюць у выпрацоўцы ППА.
Функцыянальная анатацыя метагеномаў PPA і кантрольных узораў выявіла некаторыя адрозненні. PCA-аналіз зместу генаў выявіў дыскрэтныя кластары паміж PPA і кантрольнымі ўзорамі (малюнак 5). Кластэрызацыя ўнутры ўзораў паказала, што змест кантрольных генаў быў больш разнастайным, у той час як узоры PPA кластэрызаваліся разам. Кластэрызацыя па змесце генаў была параўнальная з кластэрызацыяй па відавым складзе. Такім чынам, адрозненні ў колькасці шляхоў адпавядаюць зменам у колькасці канкрэтных відаў і штамаў у іх. Ва ўзорах PPA два шляхі са значна большай колькасцю былі звязаны з метабалізмам амінацукроў/нуклеатыдаў (ko:K21279) і некалькімі шляхамі метабалізму ліпідаў (ko:K00647, ko:K03801; Дадатковая табліца 3). Вядома, што гены, звязаныя з ko:K21279, асацыююцца з родам Bacteroides, адным з родаў са значна большай колькасцю відаў ва ўзорах PPA. Гэты фермент можа пазбегнуць імуннай рэакцыі, экспрэсуючы капсульныя поліцукрыды (Wang et al., 2008). Гэта можа тлумачыць павелічэнне колькасці Bacteroidetes, якое назіраецца ў мышэй, якія падвяргаліся ўздзеянню PPA. Гэта дапаўняе павышаны сінтэз тоўстых кіслот, які назіраецца ў мікрабіёме PPA. Бактэрыі выкарыстоўваюць шлях FASIIko:K00647 (fabB) для выпрацоўкі тоўстых кіслот, якія могуць уплываць на метабалічныя шляхі гаспадара (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), а змены ў метабалізме ліпідаў могуць гуляць ролю ў нейраразвіцці (Yu et al., 2020). Іншым шляхам, які дэманструе павелічэнне колькасці ва ўзорах PPA, быў біясінтэз стэроідных гармонаў (ko:K12343). З'яўляецца ўсё больш доказаў таго, што існуе адваротная залежнасць паміж здольнасцю мікрабіёты кішачніка ўплываць на ўзровень гармонаў і знаходзіцца пад уплывам гармонаў, так што павышаны ўзровень стэроідаў можа мець наступствы для здароўя (Tetel et al., 2018).
Гэта даследаванне мае абмежаванні і мае шэраг меркаванняў. Важным адрозненнем з'яўляецца тое, што мы не праводзілі фізіялагічныя ацэнкі жывёл. Таму немагчыма зрабіць непасрэдную выснову аб тым, ці звязаны змены ў мікрабіёме з якім-небудзь захворваннем. Яшчэ адзін фактар, які трэба ўлічваць, заключаецца ў тым, што мышэй у гэтым даследаванні кармілі тым жа рацыёнам, што і іх маці. Будучыя даследаванні могуць вызначыць, ці паляпшае пераход з дыеты, багатай на PPA, на дыету без PPA яго ўплыў на мікрабіём. Адным з абмежаванняў нашага даследавання, як і многіх іншых, з'яўляецца абмежаваны памер выбаркі. Нягледзячы на тое, што можна зрабіць абгрунтаваныя высновы, большы памер выбаркі забяспечыў бы большую статыстычную магутнасць пры аналізе вынікаў. Мы таксама асцярожна ставімся да высноў аб сувязі паміж зменамі ў мікрабіёме кішачніка і любым захворваннем (Yap et al., 2021). Змешвальныя фактары, у тым ліку ўзрост, пол і дыета, могуць істотна паўплываць на склад мікраарганізмаў. Гэтыя фактары могуць растлумачыць супярэчнасці, якія назіраюцца ў літаратуры адносна сувязі мікрабіёма кішачніка са складанымі захворваннямі (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Напрыклад, было паказана, што ў жывёл і людзей з РАС колькасць прадстаўнікоў роду Bacteroidetes альбо павялічваецца, альбо памяншаецца (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Падобным чынам, даследаванні складу кішачніка ў пацыентаў з запаленчымі захворваннямі кішачніка выявілі як павелічэнне, так і памяншэнне ў адных і тых жа таксонах (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Каб абмежаваць уплыў гендэрнай прадузятасці, мы імкнуліся забяспечыць роўнае прадстаўніцтва палоў, каб адрозненні, хутчэй за ўсё, былі абумоўлены дыетай. Адной з праблем функцыянальнай анатацыі з'яўляецца выдаленне лішніх паслядоўнасцей генаў. Наш метад кластэрызацыі генаў патрабуе 95% ідэнтычнасці паслядоўнасці і 85% падабенства даўжыні, а таксама 90% пакрыцця выраўноўвання, каб ліквідаваць ілжывую кластэрызацыю. Аднак у некаторых выпадках мы назіралі COG з аднолькавымі анатацыямі (напрыклад, MUT) (мал. 6). Патрабуюцца далейшыя даследаванні, каб вызначыць, ці з'яўляюцца гэтыя артолагі асобнымі, звязанымі з пэўнымі родамі, ці гэта абмежаванне падыходу кластарызацыі генаў. Яшчэ адным абмежаваннем функцыянальнай анатацыі з'яўляецца патэнцыйная няправільная класіфікацыя; бактэрыяльны ген mmdA - вядомы фермент, які ўдзельнічае ў сінтэзе прапіянату, але KEGG не звязвае яго з метабалічным шляхам прапіянату. Наадварот, артолагі scpB і mmcD звязаныя. Вялікая колькасць генаў без пазначаных накаўтаў можа прывесці да немагчымасці ідэнтыфікацыі генаў, звязаных з PPA, пры ацэнцы колькасці генаў. Будучыя даследаванні будуць карысныя з метатранскрыптомнага аналізу, які можа даць больш глыбокае разуменне функцыянальных характарыстык мікрабіёты кішачніка і звязаць экспрэсію генаў з патэнцыйнымі наступнымі эфектамі. Для даследаванняў, якія ўключаюць спецыфічныя нейраразвіццёвыя засмучэнні або запаленчыя захворванні кішачніка, неабходныя фізіялагічныя і паводніцкія ацэнкі жывёл, каб звязаць змены ў складзе мікрабіёма з гэтымі засмучэннямі. Дадатковыя даследаванні з перасадкай мікрабіёма кішачніка мышам, свабодным ад мікробаў, таксама былі б карыснымі, каб вызначыць, ці з'яўляецца мікрабіём рухаючай сілай або характарыстыкай захворвання.
Карацей кажучы, мы паказалі, што харчовая ППА з'яўляецца фактарам змены складу кішачнай мікрабіёты. ППА - гэта кансервант, зацверджаны FDA, які шырока сустракаецца ў розных прадуктах харчавання і пры працяглым уздзеянні можа прывесці да парушэння нармальнай кішачнай мікрафлоры. Мы выявілі змены ў колькасці некалькіх бактэрый, што сведчыць аб тым, што ППА можа ўплываць на склад кішачнай мікрабіёты. Змены ў мікрабіёце могуць прывесці да змен узроўняў пэўных метабалічных шляхоў, што можа прывесці да фізіялагічных змен, якія маюць значэнне для здароўя гаспадара. Неабходныя далейшыя даследаванні, каб вызначыць, ці можа ўплыў харчовай ППА на мікробны склад прывесці да дысбіёзу або іншых захворванняў. Гэта даследаванне закладвае аснову для будучых даследаванняў таго, як уплыў ППА на склад кішачніка можа ўплываць на здароўе чалавека.
Наборы даных, прадстаўленыя ў гэтым даследаванні, даступныя ў анлайн-рэпазіторыях. Назва рэпазіторыя і рэгістрацыйны нумар: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Гэта даследаванне на жывёлах было ўхвалена Камітэтам па доглядзе за жывёламі і іх выкарыстанні пры Цэнтральным універсітэце Фларыды (UCF-IACUC) (нумар дазволу на выкарыстанне жывёл: PROTO202000002). Гэта даследаванне адпавядае мясцовым законам, правілам і патрабаванням установы.
НГ: Канцэптуалізацыя, курыраванне дадзеных, фармальны аналіз, даследаванне, метадалогія, праграмнае забеспячэнне, візуалізацыя, напісанне тэксту (арыгінальны чарнавік), напісанне тэксту (рэцэнзія і рэдагаванне). ЛА: Канцэптуалізацыя, курыраванне дадзеных, метадалогія, рэсурсы, напісанне тэксту (рэцэнзія і рэдагаванне). SH: Фармальны аналіз, праграмнае забеспячэнне, напісанне тэксту (рэцэнзія і рэдагаванне). SA: Даследаванне, напісанне тэксту (рэцэнзія і рэдагаванне). Галоўны суддзя: Даследаванне, напісанне тэксту (рэцэнзія і рэдагаванне). SN: Канцэптуалізацыя, адміністраванне праекта, рэсурсы, кантроль, напісанне тэксту (рэцэнзія і рэдагаванне). TA: Канцэптуалізацыя, адміністраванне праекта, кантроль, напісанне тэксту (рэцэнзія і рэдагаванне).
Аўтары заявілі, што не атрымлівалі фінансавай падтрымкі для даследавання, напісання і/або публікацыі гэтага артыкула.
Аўтары заяўляюць, што даследаванне праводзілася пры адсутнасці якіх-небудзь камерцыйных або фінансавых адносін, якія маглі б быць вытлумачаны як патэнцыйны канфлікт інтарэсаў. не дастасоўна.
Усе меркаванні, выказаныя ў гэтым артыкуле, належаць выключна аўтарам і не абавязкова адлюстроўваюць погляды іх устаноў, выдаўцоў, рэдактараў або рэцэнзентаў. Выдавец не гарантуе і не падтрымлівае любыя прадукты, ацэненыя ў гэтым артыкуле, або любыя заявы, зробленыя іх вытворцамі.
Дадатковыя матэрыялы да гэтага артыкула можна знайсці ў інтэрнэце: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абдэлі Л.С., Самсам А., Насер С.А. (2019). Прапіёнавая кіслата выклікае гліялёз і нейразапаленне, рэгулюючы шлях PTEN/AKT пры расстройствах аўтыстычнага спектру. Навуковыя справаздачы 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Эйтчысан, Дж. (1982). Статыстычны аналіз дадзеных аб складзе. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ан Дж., Квон Х., Кім Ю. Дж. (2023). Суадносіны фірмікутаў і бактэрыёідэтаў як фактар рызыкі раку малочнай залозы. Часопіс клінічнай медыцыны, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андэрс С., Хубер У. (2010). Дыферэнцыяльны аналіз экспрэсіі дадзеных падліку паслядоўнасцей. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI і інш. (2013). Мікрабіёта фекаліяў і метабалом у дзяцей з аўтызмам і первазіўным парушэннем развіцця, не ўдакладненым інакш. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверына О.В., Коўтун А.С., Палякова С.І., Савілава А.М., Рэбрыкаў Д.В., Даніленка В.Н. (2020). Бактэрыяльныя нейраметалічныя характарыстыкі кішачнай мікрабіёты ў дзяцей ранняга ўзросту з расстройствамі аўтыстычнага спектру. Часопіс медыцынскай мікрабіялогіі 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакера Ф., Номбела К. (2012). Мікрабіём як орган чалавека. Клінічная мікрабіялогія і інфекцыя 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баўр Т., Дзюррэ П. (2023). Новыя даследаванні фізіялогіі бактэрый, якія выпрацоўваюць прапіёнавую кіслату: Anaerotignum propionicum і Anaerotignum neopropionicum (раней Clostridium propionicum і Clostridium neopropionicum). Мікраарганізмы 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Харчаванне маці і развіццё плёну. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., і Hochberg, J. (1995). Кантроль узроўню ілжыва станоўчых вынікаў: практычны і эфектыўны падыход да шматразовага тэставання. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Час публікацыі: 18 красавіка 2025 г.