Імунамадулюючыя метабаліты з'яўляюцца ключавой асаблівасцю мікраасяроддзя пухліны (МПП), але, за некалькімі выключэннямі, іх ідэнтычнасць застаецца ў значнай ступені невядомай. Тут мы прааналізавалі пухліны і Т-клеткі з пухлін і асцыту пацыентаў з серознай карцыномай высокай ступені злаякаснасці (СВСК), каб выявіць метабалом гэтых розных адсекаў МПП. Асцыт і пухлінныя клеткі маюць значныя адрозненні ў метабалітах. У параўнанні з асцытам, Т-клеткі, якія інфільтруюць пухліну, значна ўзбагачаны 1-метылканітамідам (МНК). Нягледзячы на ​​тое, што ўзровень МНК у Т-клетках павышаны, экспрэсія нікацінамід-N-метылтрансферазы (ферменту, які каталізуе перанос метыльных груп ад S-адэназілметыяніну да нікацінаміду) абмежаваная фібрабластамі і пухліннымі клеткамі. Функцыянальна МНК індукуе Т-клеткі вылучаць пухлінны цытакін - фактар ​​некрозу пухліны альфа. Такім чынам, МНК, атрыманы з МПП, спрыяе імуннай рэгуляцыі Т-клетак і ўяўляе сабой патэнцыйную мішэнь імунатэрапіі для лячэння раку чалавека.
Метабаліты, якія ўтвараюцца з пухліны, могуць аказваць значны інгібіруючы ўплыў на супрацьпухлінны імунітэт, і ўсё больш доказаў сведчыць аб тым, што яны таксама могуць служыць ключавой рухаючай сілай прагрэсавання захворвання (1). Акрамя эфекту Варбурга, нядаўнія працы пачалі характарызаваць метабалічны стан пухлінных клетак і яго сувязь з імунным станам мікраасяроддзя пухліны (TME). Даследаванні на мышэйных мадэлях і Т-клетках чалавека паказалі, што метабалізм глутаміна (2), акісляльны метабалізм (3) і метабалізм глюкозы (4) могуць дзейнічаць незалежна на розныя падгрупы імунных клетак. Некалькі метабалітаў у гэтых шляхах інгібіруюць супрацьпухлінную функцыю Т-клетак. Было даказана, што блакада каферменту тэтрагідрабіяптэрыну (BH4) можа пашкодзіць праліферацыю Т-клетак, а павелічэнне BH4 у арганізме можа ўзмацніць супрацьпухлінны імунны адказ, апасродкаваны CD4 і CD8. Акрамя таго, імунасупрэсіўны эфект кінуреніну можа быць кампенсаваны ўвядзеннем BH4 (5). У гліобластоме з мутацыяй ізацыятратдэгідрагеназы (IDH) сакрэцыя энантыяметабалічнага (R)-2-гідраксіглутарату (R-2-HG) інгібіруе актывацыю, праліферацыю і цыталіз Т-клетак (6). Нядаўна было паказана, што метылгліаксаль, пабочны прадукт гліколізу, выпрацоўваецца супрэсарнымі клеткамі міелоіднага паходжання, і перанос метылгліаксалю Т-клеткамі можа інгібіраваць эфектарную функцыю Т-клетак. Пры лячэнні нейтралізацыя метылгліаксалю можа пераадолець актыўнасць супрэсарных клетак міелоіднага паходжання (MDSC) і сінергічна ўзмацніць тэрапію блакады кантрольных кропак у мышэйных мадэлях (7). Гэтыя даследаванні ў сукупнасці падкрэсліваюць ключавую ролю метабалітаў, атрыманых з TME, у рэгуляцыі функцыі і актыўнасці Т-клетак.
Дысфункцыя Т-клетак шырока апісваецца пры раку яечнікаў (8). Часткова гэта звязана з метабалічнымі асаблівасцямі, уласцівымі гіпаксіі і анамальнай васкулярызацыі пухліны (9), што прыводзіць да пераўтварэння глюкозы і трыптафану ў пабочныя прадукты, такія як малочная кіслата і кінурэнін. Празмерны пазаклеткавы лактат зніжае выпрацоўку інтэрферону-γ (IFN-γ) і стымулюе дыферэнцыяцыю міеласупрэсіўных падгруп (10, 11). Спажыванне трыптафану непасрэдна інгібіруе праліферацыю Т-клетак і інгібіруе сігналізацыю рэцэптараў Т-клетак (12-14). Нягледзячы на ​​гэтыя назіранні, шмат даследаванняў, звязаных з імунным метабалізмам, праводзілася ў культуры Т-клетак in vitro з выкарыстаннем аптымізаваных асяроддзяў або абмяжоўвалася гамалагічнымі мадэлямі мышэй in vivo, ні адно з якіх не адлюстроўвае ў поўнай меры гетэрагеннасць ракавых захворванняў чалавека і фізіялагічнага макра- і мікраасяроддзя.
Агульнай рысай раку яечнікаў з'яўляецца распаўсюджванне па брушыне і з'яўленне асцыту. Назапашванне клеткавай вадкасці ў асцыце звязана з запушчанай плынню захворвання і дрэнным прагнозам (15). Паводле паведамленняў, гэты ўнікальны адсек гіпаксічны, мае высокі ўзровень фактару росту эндатэлія сасудаў (VEGF) і індолеаміна-2,3-дыаксігеназы (IDO), а таксама інфільтраваны Т-рэгуляторнымі клеткамі і міелоіднымі інгібіруючымі клеткамі (15-18). Метабалічнае асяроддзе асцыту можа адрознівацца ад метабалічнага асяроддзя самой пухліны, таму перапраграмаванне Т-клетак у брушыневай прасторы застаецца незразумелым. Акрамя таго, ключавыя адрозненні і неаднароднасць паміж асцытам і метабалітамі, якія прысутнічаюць у асяроддзі пухліны, могуць перашкаджаць інфільтрацыі імунных клетак і іх функцыянаванню на пухлінах, і неабходныя далейшыя даследаванні.
Каб вырашыць гэтыя праблемы, мы распрацавалі адчувальны метад падзелу клетак і вадкаснай храматаграфіі з тандэмнай мас-спектрометрыяй (LC-MS/MS) для вывучэння розных тыпаў клетак (у тым ліку CD4+ і CD8+ Т-клетак), а таксама ўнутры і паміж пухлінамі. Яго метабаліты распаўсюджваюцца ў клетках у тым жа асцыце і пухлінным асяроддзі пацыента. Мы выкарыстоўваем гэты метад у спалучэнні з высокамернай праточнай цытаметрыяй і секвенаваннем РНК адзінак клетак (scRNA-seq), каб атрымаць высокаразрознены партрэт метабалічнага статусу гэтых ключавых папуляцый. Гэты метад выявіў значнае павелічэнне ўзроўню 1-метылканікацінаміду (MNA) у пухлінных Т-клетках, а эксперыменты in vitro паказалі, што імунамадулюючы эфект MNA на функцыю Т-клетак раней быў невядомы. У цэлым, гэты метад выяўляе ўзаемныя метабалічныя ўзаемадзеянні паміж пухлінамі і імуннымі клеткамі і дае унікальнае разуменне метабалітаў імуннай рэгуляцыі, што можа быць карысным для лячэння рака яечнікаў з дапамогай імунатэрапіі на аснове Т-клетак. Магчымасці лячэння.
Мы выкарысталі высокамерную праточную цытаметрыю для адначасовай колькаснай ацэнкі паглынання глюкозы [2-(N-(7-нітрафеніл-2-окса-1,3-дыяза-4-іл)аміна)-2-дэзоксіглюкоза (2-NBDG) і мітахондрыяльная актыўнасць [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) — тыповыя маркеры, якія адрозніваюць імунныя клеткі і папуляцыі пухлінных клетак (табліца S2 і малюнак S1A). Гэты аналіз паказаў, што ў параўнанні з Т-клеткамі, асцытныя і пухлінныя клеткі маюць больш высокі ўзровень паглынання глюкозы, але маюць меншыя адрозненні ў мітахондрыяльнай актыўнасці. Сярэдняе паглынанне глюкозы пухліннымі клеткамі [CD45-EpCAM (EpCAM)+] у тры-чатыры разы вышэйшае, чым у Т-клетак, а сярэдняе паглынанне глюкозы CD4+ Т-клеткамі ў 1,2 разы вышэйшае, чым у CD8+ Т-клеткаў, што сведчыць аб тым, што пухлінна-інфільтруючыя лімфацыты (TIL) маюць розныя метабалічныя патрэбы нават у адным і тым жа TME (малюнак 1A). У адрозненне ад гэтага, мітахандрыяльная актыўнасць у пухлінных клетках падобная да актыўнасці CD4+ Т-клетак, і мітахандрыяльная актыўнасць абодвух тыпаў клетак вышэйшая, чым у CD8+ Т-клетак (малюнак 1B). У цэлым, гэтыя вынікі дэманструюць узровень метабалізму. Метабалічная актыўнасць пухлінных клетак вышэйшая, чым у CD4+ Т-клетак, а метабалічная актыўнасць CD4+ Т-клетак вышэйшая, чым у CD8+ Т-клетак. Нягледзячы на ​​гэтыя эфекты паміж тыпамі клетак, няма паслядоўнай розніцы ў метабалічным стане CD4+ і CD8+ Т-клетак або іх адносных прапорцыях у асцыце ў параўнанні з пухлінамі (малюнак 1C). У адрозненне ад гэтага, у фракцыі CD45-клетак доля клетак EpCAM+ у пухліне павялічылася ў параўнанні з асцытам (малюнак 1D). Мы таксама назіралі выразную метабалічную розніцу паміж кампанентамі EpCAM+ і EpCAM-клетак. Клеткі EpCAM+ (пухліна) маюць больш высокае паглынанне глюкозы і мітахандрыяльную актыўнасць, чым клеткі EpCAM-, што значна вышэй, чым метабалічная актыўнасць фібрабластаў у пухлінных клетках пры транскрыптаматычнай эпілепсіі (малюнак 1, E і F).
(A і B) Сярэдняя інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі (MFI) паглынання глюкозы (2-NBDG) (A) і мітахандрыяльная актыўнасць CD4+ Т-клетак (цёмна-чырвоны MitoTracker) (B) Тыповыя графікі (злева) і таблічныя дадзеныя (справа), CD8+ Т-клеткі і EpCAM+CD45-пухлінныя клеткі з асцыту і пухліны. (C) Суадносіны клетак CD4+ і CD8+ (CD3+ Т-клетак) у асцыце і пухліне. (D) Доля пухлінных клетак EpCAM+ у асцыце і пухліне (CD45−). (E і F) Паглынанне глюкозы EpCAM+CD45-пухлінай і EpCAM-CD45-матрыксам (2-NBDG) (E) і мітахандрыяльная актыўнасць (цёмна-чырвоны MitoTracker) (F) Тыповыя графікі (злева) і таблічныя дадзеныя (справа) Асцыт і пухлінныя клеткі. (G) Тыповыя графікі экспрэсіі CD25, CD137 і PD1 з дапамогай праточнай цытаметрыі. (H і I) Экспрэсія CD25, CD137 і PD1 на CD4+ Т-клетках (H) і CD8+ Т-клетках (I). (J і K) Фенатыпы наіўнай, цэнтральнай памяці (Tcm), эфектарнай (Teff) і эфектарнай памяці (Tem) на аснове экспрэсіі CCR7 і CD45RO. Тыповыя выявы (злева) і таблічныя дадзеныя (справа) CD4+ Т-клетак (J) і CD8+ Т-клетак (K) у асцыце і пухлінах. Значэнні P вызначаюцца парным t-крытэрыем (*P<0,05, **P<0,01 і ***P<0,001). Лінія прадстаўляе супастаўленых пацыентаў (n = 6). FMO, флуарэсцэнцыя мінус адзін; MFI, сярэдняя інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі.
Далейшы аналіз выявіў іншыя істотныя адрозненні паміж фенатыпічным статусам высока вырашаных Т-клетак. Актываваная (малюнак 1, G-I) і эфектарная памяць (малюнак 1, J і K) у пухлінах сустракаюцца значна часцей, чым асцыт (доля CD3+ Т-клетак). Падобным чынам, аналіз фенатыпу па экспрэсіі маркераў актывацыі (CD25 і CD137) і маркераў дэплецыі [бялок праграмаванай клетачнай смерці 1 (PD1)] паказаў, што, хоць метабалічныя характарыстыкі гэтых папуляцый адрозніваюцца (малюнак S1, B-E), аднак не назіралася паслядоўных значных метабалічных адрозненняў паміж наіўнымі, эфектарнымі або памяццю падгрупамі (малюнак S1, F-I). Гэтыя вынікі былі пацверджаны з дапамогай метадаў машыннага навучання для аўтаматычнага прызначэння фенатыпаў клетак (21), што дадаткова выявіла наяўнасць вялікай колькасці клетак касцявога мозгу (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) у асцыце пацыента (малюнак S2A). Сярод усіх выяўленых тыпаў клетак гэтая папуляцыя міелоідных клетак прадэманстравала найвышэйшае паглынанне глюкозы і мітахондрыяльную актыўнасць (малюнак S2, B-G). Гэтыя вынікі падкрэсліваюць моцныя метабалічныя адрозненні паміж рознымі тыпамі клетак, якія сустракаюцца ў асцыце і пухлінах у пацыентаў з ГГСК.
Асноўнай праблемай у разуменні метабанамічных характарыстык TIL з'яўляецца неабходнасць вылучэння ўзораў Т-клетак дастатковай чысціні, якасці і колькасці з пухлін. Нядаўнія даследаванні паказалі, што метады сартавання і ўзбагачэння шарыкамі, заснаваныя на праточнай цытаметрыі, могуць прывесці да змен у профілях клеткавых метабалітаў (22-24). Каб пераадолець гэтую праблему, мы аптымізавалі метад узбагачэння шарыкамі для вылучэння і ізаляцыі TIL з хірургічна рэзекаванага рака яечнікаў чалавека перад аналізам з дапамогай LC-MS/MS (гл. Матэрыялы і метады; Малюнак 2А). Каб ацаніць агульны ўплыў гэтага пратаколу на змены метабалітаў, мы параўналі профілі метабалітаў Т-клетак, актываваных здаровымі донарамі пасля вышэйзгаданага этапу падзелу шарыкаў, з клеткамі, якія не былі аддзелены шарыкамі, а заставаліся на лёдзе. Гэты аналіз кантролю якасці паказаў, што існуе высокая карэляцыя паміж гэтымі двума ўмовамі (r = 0,77), і тэхнічная паўтаральнасць групы з 86 метабалітаў мае высокую паўтаральнасць (Малюнак 2B). Такім чынам, гэтыя метады дазваляюць праводзіць дакладны аналіз метабалітаў у клетках, якія праходзяць узбагачэнне тыпу клетак, забяспечваючы тым самым першую платформу з высокім разрозненнем для ідэнтыфікацыі спецыфічных метабалітаў у HGSC, што дазваляе людзям глыбей зразумець спецыфічнасць клетак у праграме палавога метабалізму.
(A) Схематычная дыяграма ўзбагачэння магнітнымі шарыкамі. Перад аналізам з дапамогай LC-MS/MS клеткі пройдуць тры паслядоўныя цыклы ўзбагачэння магнітнымі шарыкамі або застануцца на лёдзе. (B) Уплыў тыпу ўзбагачэння на колькасць метабалітаў. Сярэдняе значэнне трох вымярэнняў для кожнага тыпу ўзбагачэння ± стандартная памылка. Шэрая лінія прадстаўляе суадносіны 1:1. Унутрыкласавая карэляцыя (ICC) паўторных вымярэнняў паказана ў пазнацы восі. NAD, нікацінамідадэніндынуклеатыд. (C) Схематычная дыяграма працоўнага працэсу аналізу метабалітаў пацыента. Асцыт або пухліны збіраюцца ў пацыентаў і крыякансервуюцца. Невялікая частка кожнага ўзору была прааналізавана з дапамогай праточнай цытаметрыі, а астатнія ўзоры прайшлі тры цыклы ўзбагачэння для клетак CD4+, CD8+ і CD45-. Гэтыя фракцыі клетак былі прааналізаваны з дапамогай LC-MS/MS. (D) Цеплавая карта стандартызаванай колькасці метабалітаў. Дэндраграма прадстаўляе кластэрызацыю Уорда па еўклідавых адлегласцях паміж узорамі. (E) Аналіз галоўных кампанент (ГАК) карты метабалітаў узору, які паказвае тры паўторы кожнага ўзору, узоры ад аднаго пацыента злучаны лініяй. (F) ГАК профілю метабалітаў узору, умоўлены пацыентам (г.зн. з выкарыстаннем частковай рэдундантнасці); тып узору абмежаваны выпуклай абалонкай. ГА1 — галоўны кампанент 1; ГА2 — галоўны кампанент 2.
Далей мы ўжылі гэты метад узбагачэння для аналізу 99 метабалітаў у фракцыях клетак CD4+, CD8+ і CD45- ў першасным асцыце і пухлінах шасці пацыентаў з ракам спіннамазгавога склерозу (малюнак 2C, малюнак S3A і табліцы S3 і S4). Папуляцыя, якая нас цікавіць, складае ад 2% да 70% ад зыходнай вялікай выбаркі жывых клетак, і доля клетак значна адрозніваецца ў розных пацыентаў. Пасля падзелу гранул узбагачаная фракцыя, якая нас цікавіць (CD4+, CD8+ або CD45-), складае ў сярэднім больш за 85% усіх жывых клетак ва ўзоры. Гэты метад узбагачэння дазваляе нам аналізаваць папуляцыі клетак з метабалізму пухлінных тканін чалавека, што немагчыма зрабіць з вялікіх узораў. Выкарыстоўваючы гэты пратакол, мы вызначылі, што l-кінурэнін і адэназін, гэтыя два добра характарызаваныя імунасупрэсіўныя метабаліты, былі павышаны ў пухлінных Т-клетках або пухлінных клетках (малюнак S3, B і C). Такім чынам, гэтыя вынікі дэманструюць дакладнасць і здольнасць нашай тэхналогіі падзелу клетак і мас-спектрометрыі знаходзіць біялагічна важныя метабаліты ў тканінах пацыентаў.
Наш аналіз таксама выявіў моцнае метабалічнае падзел тыпаў клетак у пацыентаў і паміж імі (малюнак 2D і малюнак S4A). У прыватнасці, у параўнанні з іншымі пацыентамі, пацыент 70 прадэманстраваў іншыя метабалічныя характарыстыкі (малюнак 2E і малюнак S4B), што сведчыць аб тым, што паміж пацыентамі можа існаваць значная метабалічная гетэрагеннасць. Варта адзначыць, што ў параўнанні з іншымі пацыентамі (ад 1,2 да 2 літраў; табліца S1) агульная колькасць асцыту, сабранага ў пацыента 70 (80 мл), была меншай. Кантроль міжпацыентнай гетэрагеннасці падчас аналізу галоўных кампанент (напрыклад, з выкарыстаннем аналізу частковай рэдундантнасці) паказвае паслядоўныя змены паміж тыпамі клетак, і тыпы клетак і/або мікраасяроддзе выразна агрэгаваныя ў адпаведнасці з профілем метабалітаў (малюнак 2F). Аналіз асобных метабалітаў падкрэсліў гэтыя эфекты і выявіў значныя адрозненні паміж тыпамі клетак і мікраасяроддзем. Варта адзначыць, што найбольш экстрэмальным назіраным адрозненнем з'яўляецца MNA, якая звычайна ўзбагачана клеткамі CD45- і клеткамі CD4+ і CD8+, якія інфільтруюць пухліну (малюнак 3A). Для клетак CD4+ гэты эфект найбольш відавочны, і на МНА ў клетках CD8+, відаць, таксама моцна ўплывае навакольнае асяроддзе. Аднак гэта не мае значэння, бо толькі ў трох з шасці пацыентаў можна ацаніць паказчыкі CD8+ пухліны. Акрамя МНА, у розных тыпах клетак асцыту і пухлін іншыя метабаліты, якія дрэнна характарызуюцца пры TIL, таксама адрозніваюцца па багатасці (малюнкі S3 і S4). Такім чынам, гэтыя дадзеныя дэманструюць перспектыўны набор імунамадулюючых метабалітаў для далейшых даследаванняў.
(A) Нармалізаванае ўтрыманне MNA ў клетках CD4+, CD8+ і CD45- з асцыту і пухліны. На скрынкавай дыяграме паказаны медыяна (лінія), міжквартыльны дыяпазон (завеса рамкі) і дыяпазон дадзеных, да 1,5 разоў перавышаючы міжквартыльны дыяпазон (вусікі рамкі). Як апісана ў раздзеле "Матэрыялы і метады для пацыентаў", выкарыстоўвайце значэнне лімы пацыента для вызначэння значэння P (*P<0,05 і **P<0,01). (B) Схематычная дыяграма метабалізму MNA (60). Метабаліты: S-адэнозіл-1-метыянін; SAH, S-адэназін-1-гамацыстэін; NA, нікацінамід; MNA, 1-метылканітанінамід; 2-PY, 1-метыл-2-пірыдон-5-карбаксамід; 4-PY, 1-метыл-4-пірыдон-5-карбаксамід; NR, нікацінамід-рыбоза; NMN, нікацінамід-манануклеатыд. Ферменты (зялёны): NNMT, нікацінамід-N-метылтрансфераза; SIRT, сіртуіны; NAMPT, нікацінамід-фосфарыбазілтрансфераза; AOX1, альдэгідаксідаза 1; NRK, нікацінамід-рыбазідкіназа; NMNAT, нікацінамід-монануклеатыд-адэнілаттрансфераза; Pnp1, пурын-нуклеазід-фосфарылаза. (C) t-SNE scRNA-seq асцыту (шэры) і пухліны (чырвоны; n = 3 пацыенты). (D) Экспрэсія NNMT у розных папуляцыях клетак, ідэнтыфікаваных з дапамогай scRNA-seq. (E) Экспрэсія NNMT і AOX1 у SK-OV-3, нырках эмбрыёна чалавека (HEK) 293T, Т-клетках і Т-клетках, апрацаваных MNA. Паказана згорнутая экспрэсія адносна SK-OV-3. Паказаны характар ​​экспрэсіі з дапамогай SEM (n = 6 здаровых донараў). Значэнні Ct больш за 35 лічацца невыяўляльнымі (UD). (F) Экспрэсія SLC22A1 і SLC22A2 у SK-OV-3, HEK293T, Т-клетках і Т-клетках, апрацаваных 8 мМ MNA. Паказана згорнутая экспрэсія адносна SK-OV-3. Паказаны характар ​​экспрэсіі з дапамогай SEM (n = 6 здаровых донараў). Значэнні Ct больш за 35 лічацца невыяўляльнымі (UD). (G) Змест MNA ў клетках у актываваных здаровых Т-клетках донараў пасля 72 гадзін інкубацыі з MNA. Паказаны характар ​​экспрэсіі з дапамогай SEM (n = 4 здаровыя донары).
МНА ўтвараецца шляхам пераносу метыльнай групы з S-адэназіл-1-метыяніну (SAM) на нікацінамід (NA) з дапамогай нікацінамід-N-метылтрансферазы (NNMT; малюнак 3B). NNMT экспрэсуецца ў розных відах раку чалавека і асацыюецца з праліферацыяй, інвазіяй і метастазаваннем (25-27). Каб лепш зразумець крыніцу MNA ў Т-клетках пры TME, мы выкарысталі scRNA-seq для характарыстыкі экспрэсіі NNMT у розных тыпах клетак у асцыце і пухлінах трох пацыентаў з HGSC (табліца S5). Аналіз прыблізна 6500 клетак паказаў, што ў асцыце і пухлінным асяроддзі экспрэсія NNMT была абмежавана меркаванымі папуляцыямі фібрабластаў і пухлінных клетак (малюнак 3, C і D). Варта адзначыць, што няма відавочнай экспрэсіі NNMT ні ў адной папуляцыі, якая экспрэсуе PTPRC (CD45+) (малюнак 3D і малюнак S5A), што сведчыць аб тым, што MNA, выяўленая ў спектры метабалітаў, была ўведзена ў Т-клеткі. Экспрэсія альдэгідаксідазы 1 (AOX1) пераўтварае MNA ў 1-метыл-2-пірыдон-5-карбаксамід (2-PYR) або 1-метыл-4-пірыдон-5-карбаксамід (4-PYR); малюнак 3B) таксама абмежаваная папуляцыяй фібрабластаў, якія экспрэсуюць COL1A1 (малюнак S5A), што разам сведчыць аб тым, што Т-клеткі не маюць здольнасці да звычайнага метабалізму MNA. Характар ​​экспрэсіі гэтых генаў, звязаных з MNA, быў правераны з выкарыстаннем другога незалежнага набору дадзеных клетак з асцыту пацыентаў з HGSC (малюнак S5B; n = 6) (16). Акрамя таго, колькасны аналіз палімеразнай ланцуговай рэакцыі (qPCR) здаровых донарскіх Т-клетак, апрацаваных MNA, паказаў, што ў параўнанні з кантрольнымі клеткамі пухліны яечнікаў SK-OV-3, NNMT або AOX1 амаль не экспрэсаваліся (малюнак 3E). Гэтыя нечаканыя вынікі паказваюць, што MNA можа сакрэтавацца з фібрабластаў або пухлін у суседнія Т-клеткі пры TME.
Нягледзячы на ​​тое, што сярод кандыдатаў ёсць сямейства арганічных катыённых транспарцёраў з 1 па 3 (OCT1, OCT2 і OCT3), закадаваных сямействам растваральных пераносчыкаў 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 і SLC22A3), патэнцыйныя транспарцёры MNA пакуль не вызначаны (28). КПЦР мРНК з здаровых донарскіх Т-клетак паказала нізкі ўзровень экспрэсіі SLC22A1, але невыяўляльны ўзровень SLC22A2, што пацвярджае, што пра гэта паведамлялася раней у літаратуры (малюнак 3F) (29). У адрозненне ад гэтага, лінія клетак пухліны яечнікаў SK-OV-3 экспрэсавала высокі ўзровень абодвух транспарцёраў (малюнак 3F).
Каб праверыць магчымасць здольнасці Т-клетак паглынаць чужародную MNA, здаровыя донарскія Т-клеткі культывавалі на працягу 72 гадзін у прысутнасці розных канцэнтрацый MNA. Пры адсутнасці экзагеннай MNA клеткавае ўтрыманне MNA немагчыма выявіць (малюнак 3G). Аднак актываваныя Т-клеткі, апрацаваныя экзагеннай MNA, паказалі дозазалежнае павелічэнне ўтрымання MNA ў клетках, да 6 мМ MNA (малюнак 3G). Гэты вынік сведчыць аб тым, што, нягледзячы на ​​нізкі ўзровень экспрэсіі транспарцёраў і адсутнасць асноўнага фермента, адказнага за ўнутрыклетачны метабалізм MNA, TIL усё яшчэ можа паглынаць MNA.
Спектр метабалітаў у Т-клетках пацыентаў і эксперыменты па паглынанні MNA in vitro павялічваюць верагоднасць таго, што фібрабласты, звязаныя з ракам (CAF), вылучаюць MNA, і пухлінныя клеткі могуць рэгуляваць фенатып і функцыю TIL. Каб вызначыць уплыў MNA на Т-клеткі, здаровыя донарскія Т-клеткі былі актываваны in vitro ў прысутнасці або адсутнасці MNA, і была ацэнена іх праліферацыя і прадукцыя цытакінаў. Праз 7 дзён дадання MNA ў найвышэйшай дозе колькасць падвойвання папуляцыі была ўмерана зніжана, у той час як актыўнасць захоўвалася пры ўсіх дозах (малюнак 4A). Акрамя таго, лячэнне экзагенным MNA прывяло да павелічэння долі CD4+ і CD8+ Т-клетак, якія экспрэсуюць фактар ​​некрозу пухліны-α (TNFα; малюнак 4B). Наадварот, унутрыклетачная прадукцыя IFN-γ была значна зніжана ў CD4+ Т-клетках, але не ў CD8+ Т-клетках, і не было выяўлена істотных змен у інтэрлейкіне 2 (IL-2; малюнак 4, C і D). Такім чынам, імунаферментны аналіз (ІФА) супернатантаў з гэтых культур Т-клетак, апрацаваных MNA, паказаў значнае павелічэнне TNFα, зніжэнне IFN-γ і адсутнасць змяненняў у IL-2 (Малюнак 4, E-G). Зніжэнне IFN-γ сведчыць аб тым, што MNA можа гуляць ролю ў інгібіраванні супрацьпухліннай актыўнасці Т-клетак. Для мадэлявання ўплыву MNA на цытатаксічнасць, апасродкаваную Т-клеткамі, здаровыя монануклеарныя клеткі перыферычнай крыві (PBMC) донара прадукуюць хімерныя клеткі антыгеннага рэцэптара Т (FRα-CAR-T), накіраваныя на рэцэптар фалійнай кіслаты α і CAR-T (GFP), рэгуляваныя зялёным флуарэсцэнтным бялком (GFP) -CAR-T. Клеткі CAR-T культывавалі на працягу 24 гадзін у прысутнасці MNA, а затым сумесна культывавалі з клеткамі пухліны яечнікаў чалавека SK-OV-3, якія экспрэсуюць рэцэптар фалійнай кіслаты α, у суадносінах эфектара да мішэні 10:1. Апрацоўка MNA прывяла да значнага зніжэння актыўнасці забойства клетак FRα-CAR-T, што было падобна на клеткі FRα-CAR-T, апрацаваныя адэназінам (малюнак 4H).
(A) Агульная колькасць жыццяздольных клетак і падваенне папуляцыі (PD) непасрэдна з культуры на 7-ы дзень. Гістаграма прадстаўляе сярэдняе значэнне + SEM шасці здаровых донараў. Прадстаўляе дадзеныя як мінімум з n = 3 незалежных эксперыментаў. (B - D) CD3/CD28 і IL-2 выкарыстоўваліся для актывацыі Т-клетак пры адпаведных канцэнтрацыях MNA на працягу 7 дзён. Перад аналізам клеткі стымулявалі PMA/іяноміцынам з GolgiStop на працягу 4 гадзін. Экспрэсія TNFα (B) у Т-клетках. Прыклад выявы (злева) і таблічныя дадзеныя (справа) экспрэсіі TNFα ў жывых клетках. Экспрэсія IFN-γ (C) і IL-2 (D) у Т-клетках. Экспрэсія цытакінаў вымяралася праточнай цытаметрыяй. Гістаграма прадстаўляе сярэдняе значэнне (n = 6 здаровых донараў) + SEM. Выкарыстоўвайце аднабаковы дысперсійны аналіз і паўторныя вымярэнні (*P<0,05 і **P<0,01) для вызначэння значэння P. Прадстаўляе дадзеныя як мінімум з n = 3 незалежных эксперыментаў. (E да G) CD3/CD28 і IL-2 выкарыстоўваліся для актывацыі Т-клетак пры адпаведных канцэнтрацыях MNA на працягу 7 дзён. Асяроддзе збіралі да і пасля 4 гадзін стымуляцыі PMA/іяноміцынам. Канцэнтрацыі TNFα (E), IFN-γ (F) і IL-2 (G) вымяралі з дапамогай ELISA. Слупковая дыяграма прадстаўляе сярэдняе значэнне (n = 5 здаровых донараў) + SEM. Значэнне P вызначалася з дапамогай аднабаковага дысперсійнага аналізу і паўторных вымярэнняў (*P<0,05). Пункцірная лінія паказвае мяжу выяўлення. (H) Аналіз лізісу клетак. Клеткі FRα-CAR-T або GFP-CAR-T апрацоўвалі адэназінам (250 мкМ) або MNA (10 мМ) на працягу 24 гадзін або пакідалі неапрацаванымі (Ctrl). Вымяралі працэнт гібелі клетак SK-OV-3. Значэнне P вызначалася з дапамогай t-крытэрыя Уэлча (*P<0,5 і **P<0,01).
Каб атрымаць механістычнае разуменне рэгуляцыі экспрэсіі TNFα, якая залежыць ад MNA, былі ацэнены змены ў мРНК TNFα Т-клетак, апрацаваных MNA (малюнак 5A). Здаровыя донарскія Т-клеткі, апрацаваныя MNA, паказалі двухразовае павелічэнне ўзроўню транскрыпцыі TNFα, што сведчыць аб залежнасці MNA ад рэгуляцыі транскрыпцыі TNFα. Каб даследаваць гэты магчымы рэгуляторны механізм, два вядомыя транскрыпцыйныя фактары, якія рэгулююць TNFα, а менавіта актываваны ядзерны фактар ​​Т-клетак (NFAT) і спецыфічны бялок 1 (Sp1), былі ацэнены ў адказ на звязванне MNA з праксімальным прамотарам TNFα (30). Прамотар TNFα змяшчае 6 ідэнтыфікаваных сайтаў звязвання NFAT і 2 сайты звязвання Sp1, якія перакрываюцца ў адным месцы [-55 пар асноў (п.н.) ад 5'-кэпа] (30). Імунапрэцыпітацыя храмаціну (ChIP) паказала, што пры апрацоўцы MNA звязванне Sp1 з прамотарам TNFα павялічылася ў тры разы. Уключэнне NFAT таксама павялічылася і набыло важнасць (малюнак 5B). Гэтыя дадзеныя паказваюць, што MNA рэгулюе экспрэсію TNFα праз транскрыпцыю Sp1 і ў меншай ступені экспрэсію NFAT.
(A) У параўнанні з Т-клеткамі, культываванымі без MNA, кратнае змяненне экспрэсіі TNFα ў Т-клетках, апрацаваных MNA. Паказана карціна экспрэсіі з дапамогай SEM (n = 5 здаровых донараў). Прадстаўляе дадзеныя як мінімум з n = 3 незалежных эксперыментаў. (B) Прамотар TNFα Т-клетак, апрацаваных з 8 мМ MNA або без яго пасля таго, як NFAT і Sp1 былі аб'яднаны з (Ctrl) і стымуляцыяй PMA/іяноміцынам на працягу 4 гадзін. Імунаглабулін G (IgG) і H3 выкарыстоўваліся ў якасці адмоўнага і станоўчага кантролю для імунапрэцыпітацыі адпаведна. Колькасная ацэнка ChIP паказала, што звязванне Sp1 і NFAT з прамотарам TNFα ў клетках, апрацаваных MNA, павялічылася ў некалькі разоў у параўнанні з кантролем. Прадстаўляе дадзеныя як мінімум з n = 3 незалежных эксперыментаў. Значэнне P вызначалася некалькімі t-крытэрыямі (*** P <0,01). (C) У параўнанні з асцытам HGSC, Т-клеткі (нецытатаксічныя) прадэманстравалі павышаную экспрэсію TNF у пухліне. Колеры прадстаўляюць розных пацыентаў. Адлюстраваныя клеткі былі выпадковым чынам адабраны да 300 і змененыя, каб абмежаваць перавышэнне (** Padj = 0,0076). (D) Прапанаваная мадэль MNA для рака яечнікаў. MNA выпрацоўваецца ў пухлінных клетках і фібрабластах у TME і паглынаецца Т-клеткамі. MNA павялічвае звязванне Sp1 з прамотарам TNFα, што прыводзіць да павелічэння транскрыпцыі TNFα і выпрацоўкі цытакінаў TNFα. MNA таксама выклікае зніжэнне IFN-γ. Інгібіраванне функцыі Т-клетак прыводзіць да зніжэння здольнасці да знішчэння і паскарэння росту пухліны.
Згодна з паведамленнямі, TNFα мае франтальныя і зваротна-залежныя супрацьпухлінныя і супрацьпухлінныя эфекты, але ён мае добра вядомую ролю ў стымуляванні росту і метастазіравання рака яечнікаў (31-33). Згодна з паведамленнямі, канцэнтрацыя TNFα ў асцыце і пухлінных тканінах у пацыентаў з ракам яечнікаў вышэйшая, чым у дабраякасных тканінах (34-36). З пункту гледжання механізму, TNFα можа рэгуляваць актывацыю, функцыю і праліферацыю лейкацытаў і змяняць фенатып ракавых клетак (37, 38). У адпаведнасці з гэтымі высновамі, дыферэнцыяльны аналіз экспрэсіі генаў паказаў, што TNF значна павышаўся ў Т-клетках у пухлінных тканінах у параўнанні з асцытам (малюнак 5C). Павелічэнне экспрэсіі TNF было выяўлена толькі ў папуляцыях Т-клетак з нецытатаксічным фенатыпам (малюнак S5A). Увогуле, гэтыя дадзеныя пацвярджаюць меркаванне, што MNA мае двайны імунасупрэсіўны і пухлінны эфект пры раку яечнікаў яечнікаў.
Флуарэсцэнтнае маркіраванне на аснове праточнай цытаметрыі стала асноўным метадам вывучэння метабалізму TIL. Гэтыя даследаванні паказалі, што ў параўнанні з лімфацытамі перыферычнай крыві або Т-клеткамі з другасных лімфоідных органаў, мышыны і чалавечы TIL маюць больш высокую тэндэнцыю да паглынання глюкозы (4, 39) і паступовую страту мітахондрыяльнай функцыі (19, 40). Нягледзячы на ​​тое, што ў гэтым даследаванні мы назіралі падобныя вынікі, ключавой распрацоўкай з'яўляецца параўнанне метабалізму пухлінных клетак і TIL з адной і той жа рэзекаванай пухліннай тканіны. У адпаведнасці з некаторымі з гэтых папярэдніх паведамленняў, пухлінныя (CD45-EpCAM+) клеткі з асцыту і пухлін маюць больш высокае паглынанне глюкозы, чым CD8+ і CD4+ Т-клеткі, што пацвярджае, што высокае паглынанне глюкозы пухліннымі клеткамі можна параўнаць з Т-клеткамі. Канцэпцыя канкурэнцыі Т-клетак. TME. Аднак мітахондрыяльная актыўнасць пухлінных клетак вышэйшая, чым у CD8+ Т-клетак, але мітахондрыяльная актыўнасць падобная да актыўнасці CD4+ Т-клетак. Гэтыя вынікі пацвярджаюць новую тэму аб тым, што акісляльны метабалізм важны для пухлінных клетак (41, 42). Яны таксама мяркуюць, што CD8+ Т-клеткі могуць быць больш успрымальнымі да акісляльнай дысфункцыі, чым CD4+ Т-клеткі, або што CD4+ Т-клеткі могуць выкарыстоўваць крыніцы вугляроду, акрамя глюкозы, для падтрымання мітахондрыяльнай актыўнасці (43, 44). Варта адзначыць, што мы не назіралі ніякай розніцы ў паглынанні глюкозы або мітахондрыяльнай актыўнасці паміж эфектарамі CD4+ Т, эфектарнымі Т-клеткамі памяці і цэнтральнымі Т-клеткамі памяці ў асцыце. Аналагічна, стан дыферэнцыяцыі CD8+ Т-клетак у пухлінах не мае нічога агульнага са зменамі ў паглынанні глюкозы, што падкрэслівае значную розніцу паміж Т-клеткамі, культываванымі in vitro, і чалавечай TIL in vivo (22). Гэтыя назіранні былі таксама пацверджаны выкарыстаннем непрадузятага аўтаматычнага размеркавання папуляцыі клетак, якое дадаткова паказала, што клеткі CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ з больш высокім паглынаннем глюкозы і мітахондрыяльнай актыўнасцю, чым пухлінныя клеткі, распаўсюджаныя, але маюць метабалічна актыўную папуляцыю клетак. Гэтая папуляцыя можа прадстаўляць меркаваную субпапуляцыю міелоідных клетак-супрэсараў або плазмацытоідных дендрытных клетак, выяўленых пры аналізе scRNA-seq. Нягледзячы на ​​тое, што абедзве гэтыя з'явы былі выяўлены ў пухлінах яечнікаў чалавека [45], яны ўсё яшчэ патрабуюць далейшага вывучэння, каб апісаць гэтую міелоідную субпапуляцыю.
Нягледзячы на ​​тое, што метады, заснаваныя на праточнай цытаметрыі, могуць высветліць агульныя адрозненні ў метабалізме глюкозы і акісляльным метабалізме паміж тыпамі клетак, дакладныя метабаліты, якія выпрацоўваюцца глюкозай або іншымі крыніцамі вугляроду для мітахондрыяльнага метабалізму ў TME, пакуль не вызначаны. Аднясенне наяўнасці або адсутнасці метабалітаў да пэўнай падгрупы TIL патрабуе ачысткі папуляцыі клетак з выдаленай тканіны. Такім чынам, наш метад узбагачэння клетак у спалучэнні з мас-спектрометрыяй можа даць уяўленне аб метабалітах, якія дыферэнцыяльна ўзбагачаны ў Т-клетках і папуляцыях пухлінных клетак у адпаведных узорах пацыентаў. Нягледзячы на ​​тое, што гэты метад мае перавагі перад сартаваннем клетак, актываваным флуарэсцэнцыяй, некаторыя бібліятэкі метабалітаў могуць быць закрануты з-за ўласцівай стабільнасці і/або хуткай хуткасці абнаўлення (22). Тым не менш, наш метад дазволіў ідэнтыфікаваць два распазнаныя імунасупрэсіўныя метабаліты, адэназін і кінурэнін, паколькі яны значна адрозніваюцца паміж тыпамі ўзораў.
Наш метабаномны аналіз пухлін і падтыпаў TIL дае больш поўнае разуменне ролі метабалітаў у метабалітычным метабалічным эпітэліяльным ... Нягледзячы на ​​ўмераны агульны ўзровень TIL, экспрэсія NNMT у CAF цесна звязана з мезенхімальным падтыпам Атласа геному раку (TCGA), які асацыюецца з дрэнным прагнозам (27, 46, 47). Нарэшце, экспрэсія фермента AOX1, які адказвае за дэградацыю MNA, таксама абмежаваная папуляцыяй CAF, што сведчыць аб адсутнасці ў Т-клетках здольнасці метабалізаваць MNA. Гэтыя вынікі пацвярджаюць ідэю аб тым, што, хоць для пацверджання гэтай адкрыцці неабходныя далейшыя даследаванні, высокі ўзровень MNA ў Т-клетках можа сведчыць аб наяўнасці імунасупрэсіўнага мікраасяроддзя CAF.
Улічваючы нізкі ўзровень экспрэсіі транспарцёраў MNA і невыяўляльныя ўзроўні ключавых бялкоў, якія ўдзельнічаюць у метабалізме MNA, прысутнасць MNA ў Т-клетках з'яўляецца нечаканай. Ні NNMT, ні AOX1 не маглі быць выяўлены з дапамогай аналізу scRNA-seq і мэтавай ПЛР дзвюх незалежных кагорт. Гэтыя вынікі паказваюць, што MNA не сінтэзуецца Т-клеткамі, а паглынаецца з навакольнага TME. Эксперыменты in vitro паказваюць, што Т-клеткі маюць тэндэнцыю назапашваць экзагенную MNA.
Нашы даследаванні in vitro паказалі, што экзагенны MNA індукуе экспрэсію TNFα ў Т-клетках і ўзмацняе звязванне Sp1 з прамотарам TNFα. Нягледзячы на ​​тое, што TNFα мае як супрацьпухлінныя, так і супрацьпухлінныя функцыі, пры раку яечнікаў TNFα можа спрыяць росту раку яечнікаў (31-33). Нейтралізацыя TNFα ў культуры клетак пухліны яечнікаў або ліквідацыя сігналу TNFα ў мышэйных мадэлях можа палепшыць выпрацоўку запаленчых цытакінаў, апасродкаваных TNFα, і інгібіраваць рост пухліны (32, 35). Такім чынам, у гэтым выпадку MNA, атрыманы з TME, можа дзейнічаць як прозапаленчы метабаліт праз TNFα-залежны механізм праз аўтакрынную пятлю, тым самым спрыяючы ўзнікненню і распаўсюджванню раку яечнікаў (31). Зыходзячы з гэтай магчымасці, блакада TNFα вывучаецца як патэнцыйны тэрапеўтычны сродак для раку яечнікаў (37, 48, 49). Акрамя таго, MNA пагаршае цытатаксічнасць CAR-T-клетак да клетак пухліны яечнікаў, што з'яўляецца дадатковым доказам імунасупрэсіі, апасродкаванай MNA. У сукупнасці гэтыя вынікі сведчаць аб мадэлі, у якой пухліны і клеткі CAF сакрэтуюць MNA ў пазаклеткавы TME. Дзякуючы (i) стымуляцыі росту раку яечнікаў, выкліканай TNF, і (ii) інгібіраванню цытатаксічнай актыўнасці Т-клетак, выкліканай MNA, гэта можа мець двайны эфект на пухліну (малюнак 5D).
У заключэнне, шляхам ужывання камбінацыі хуткага ўзбагачэння клетак, секвенавання асобных клетак і метабалічнага прафілявання, гэта даследаванне выявіла велізарныя імунаметабаломічныя адрозненні паміж пухлінамі і асцытычнымі клеткамі ў пацыентаў з плоскоклеточным ракам галавы і галавы. Гэты ўсебаковы аналіз паказаў, што існуюць адрозненні ў паглынанні глюкозы і мітахондрыяльнай актыўнасці паміж Т-клеткамі, і ідэнтыфікаваў MNA як неклетачны аўтаномны імунны рэгуляторны метабаліт. Гэтыя дадзеныя ўплываюць на тое, як TME ўплывае на метабалізм Т-клетак у ракавых захворваннях чалавека. Нягледзячы на ​​тое, што паведамлялася пра прамую канкурэнцыю за пажыўныя рэчывы паміж Т-клеткамі і ракавымі клеткамі, метабаліты таксама могуць выступаць у якасці ўскосных рэгулятараў, спрыяючы прагрэсаванню пухліны і, магчыма, падаўляючы эндагенныя імунныя рэакцыі. Далейшае апісанне функцыянальнай ролі гэтых рэгуляторных метабалітаў можа адкрыць альтэрнатыўныя стратэгіі для ўзмацнення супрацьпухліннага імуннага адказу.
Узоры пацыентаў і клінічныя дадзеныя былі атрыманы праз рэпазітар тканін пухлін раку Брытанскай Калумбіі, сертыфікаваны Канадскай сеткай рэпазітараў тканін. Згодна з пратаколам, зацверджаным Камітэтам па этыцы даследаванняў раку Брытанскай Калумбіі і Універсітэтам Брытанскай Калумбіі (H07-00463), усе ўзоры і клінічныя дадзеныя пацыентаў атрымалі інфармаваную пісьмовую згоду або афіцыйна адмовіліся ад сваёй згоды. Узоры захоўваюцца ў сертыфікаваным BioBank (BRC-00290). Падрабязныя характарыстыкі пацыентаў паказаны ў табліцах S1 і S5. Для крыякансервацыі скальпель выкарыстоўваецца для механічнага раскладання ўзору пухліны пацыента, а затым праціскаецца праз 100-мікронны фільтр для атрымання суспензіі адной клеткі. Асцыт пацыента цэнтрыфугавалі пры 1500 абаротаў у хвіліну на працягу 10 хвілін пры 4°C для асаджэння клетак і выдалення супернатанту. Клеткі, атрыманыя з пухліны і асцыту, крыякансервавалі ў 50% інактываванай цяплом сыроватцы чалавека AB (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) і 10% дыметылсульфаксідзе. Гэтыя захаваныя суспензіі асобных клетак размарозілі і выкарысталі для метабаломікі і вызначэння метабалітаў, апісаных ніжэй.
Поўнае асяроддзе складаецца з 0,22 мкм адфільтраванага 50:50 RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 мМ L-глутаміна (Thermo Fisher Scientific), дапоўненага 10% інактываванай цяплом сыроваткай чалавека AB (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ L-глутамінам (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x растворам пеніцыліну-стрэптаміцыну (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) і 50 мкМБ-меркаптаэтанолу. AimV (Invitrogen) дапоўнены 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) і 2 мМ L-глутамінам (Thermo Fisher Scientific). Буфер для афарбоўвання праточнага цытаметра складаўся з 0,22 мкм адфільтраванага фасфатна-буфернага фізіялагічнага раствора (PBS; Invitrogen), дапоўненага 3% інактываванай цяплом сыроваткай чалавека AB (Sigma). Буфер для ўзбагачэння клетак складаецца з 0,22 мкм адфільтраванага PBS і дапоўненага 0,5% інактываванай награваннем сыроваткі чалавека AB (Sigma-Aldrich).
У поўным асяроддзі пры тэмпературы 37°C клеткі афарбоўвалі 10 нМ MT DR і 100 мкМ 2-NBDG на працягу 30 хвілін. Затым клеткі афарбоўвалі фарбавальнікам жыццяздольнасці eF506 пры тэмпературы 4°C на працягу 15 хвілін. Рэсуспендуйце клеткі ў буферы для фарбавання FC Block (eBioscience) і Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), развядзіце ў буферы для фарбавання праточнай цытаметрыі (згодна з інструкцыямі вытворцы) і інкубуйце на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Афарбуйце клеткі наборам антыцелаў (табліца S2) у буферы для фарбавання праточнай цытаметрыі пры тэмпературы 4°C на працягу 20 хвілін. Перад аналізам рэсуспендуйце клеткі ў буферы для фарбавання праточнай цытаметрыі (Cytek Aurora; канфігурацыя 3L-16V-14B-8R). Для аналізу дадзеных падліку клетак выкарыстоўвайце SpectroFlo і FlowJo V10, а для стварэння дадзеных — GraphPad Prism 8. Сярэдняя інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі (MFI) 2-NBDG і MT DR была лагарыфмічна нармалізавана, а затым для статыстычнага аналізу быў выкарыстаны парны t-крытэрый, каб улічыць супадаючых пацыентаў. Выдаліце ​​з аналізу ўсе папуляцыі з менш чым 40 падзеямі; увядзіце значэнне MFI, роўнае 1, для любых адмоўных значэнняў перад выкананнем статыстычнага аналізу і візуалізацыі дадзеных.
Каб дапоўніць стратэгію ручнога гейтынгу вышэйзгаданай панэлі працэсу, мы выкарысталі поўную анатацыю з дапамогай дрэва абмежаванняў формы (FAUST) (21) для аўтаматычнага прызначэння клетак папуляцыі пасля выдалення мёртвых клетак у FlowJo. Мы ўручную кіруем вынікам, каб аб'яднаць папуляцыі, якія, здаецца, размеркаваны няправільна (аб'яднанне PD1+ з PD1-пухліннымі клеткамі), і захаваныя папуляцыі. Кожны ўзор утрымлівае ў сярэднім больш за 2% клетак, усяго 11 папуляцый.
Для аддзялення PBMC ад прадуктаў падзелу лейкацытаў выкарыстоўвалі цэнтрыфугаванне ў градыенце шчыльнасці з фіколам (STEMCELL Technologies). CD8+ Т-клеткі вылучалі з PBMC з дапамогай CD8 MicroBeads (Miltenyi) і размнажалі ў поўным асяроддзі з дапамогай TransAct (Miltenyi) на працягу 2 тыдняў у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Клеткі вытрымлівалі 5 дзён у поўным асяроддзі, якое змяшчала IL-7 (10 нг/мл; PeproTech), а затым паўторна стымулявалі з дапамогай TransAct. На 7-ы дзень, у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы, для ўзбагачэння клетак у трох паслядоўных раўндах выкарыстоўвалі чалавечыя CD45 MicroBeads (Miltenyi). Клеткі падзялілі на аліквоты для аналізу праточнай цытаметрыяй (як апісана вышэй), і адзін мільён клетак падзялілі на аліквоты тры разы для аналізу LC-MS/MS. Узоры апрацоўвалі з дапамогай LC-MS/MS, як апісана ніжэй. Мы ацанілі значэнне адсутнага метабаліту з іённым лікам 1000. Кожны ўзор нармалізуецца па агульнай колькасці іонаў (TIC), лагарыфмічна пераўтвараецца і аўтаматычна нармалізуецца ў MetaboAnalystR перад аналізам.
Суспензію асобных клетак кожнага пацыента размарожвалі і фільтравалі праз фільтр 40 мкм у поўнае асяроддзе (як апісана вышэй). Згодна з пратаколам вытворцы, для ўзбагачэння ўзораў клеткамі CD8+, CD4+ і CD45- (на лёдзе) выкарыстоўвалі тры паслядоўныя раўнды станоўчай селекцыі з дапамогай магнітнага падзелу з выкарыстаннем MicroBeads (Miltenyi). Карацей кажучы, клеткі рэсуспендавалі ў буферы для ўзбагачэння клетак (як апісана вышэй) і падлічвалі. Клеткі інкубавалі з чалавечымі шарыкамі CD8, чалавечымі шарыкамі CD4 або чалавечымі шарыкамі CD45 (Miltenyi) пры тэмпературы 4°C на працягу 15 хвілін, а затым прамывалі буферам для ўзбагачэння клетак. Узор прапускалі праз калонку LS (Miltenyi), і збіралі станоўчыя і адмоўныя фракцыі. Каб скараціць працягласць і максымізаваць этап аднаўлення клетак, фракцыя CD8 затым выкарыстоўвалася для другога раўнда ўзбагачэння CD4+, а фракцыя CD4 - для наступнага ўзбагачэння CD45. Трымайце раствор на лёдзе на працягу ўсяго працэсу падзелу.
Для падрыхтоўкі ўзораў для аналізу метабалітаў клеткі адзін раз прамывалі ледзяным растворам солі, і да кожнага ўзору дадавалі 1 мл 80% метанолу, затым перамешвалі на віхравой ванне і замарожвалі ў вадкім азоце. Узоры падвяргалі тром цыклам замарожвання-размарожвання і цэнтрыфугавалі пры 14 000 абаротаў у хвіліну на працягу 15 хвілін пры 4°C. Супернатант, які змяшчае метабаліты, выпарвалі да поўнага высыхання. Метабаліты паўторна растваралі ў 50 мкл 0,03% мурашынай кіслаты, перамешвалі на віхравой ванне, а затым цэнтрыфугавалі для выдалення рэшткаў.
Экстрагуйце метабаліты, як апісана вышэй. Перанясіце супернатант у бутэльку для высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі для метабаломных даследаванняў. Выкарыстоўвайце пратакол выпадковай апрацоўкі для апрацоўкі кожнага ўзору аднолькавай колькасцю клетак, каб прадухіліць эфекты партыі. Мы правялі якасную ацэнку глабальных метабалітаў, раней апублікаваную на трайным квадрупольным мас-спектрометры AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Храматаграфічны аналіз і інтэграцыя плошчы пікаў былі выкананы з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння MultiQuant версіі 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Для ацэнкі значэння адсутнага метабаліту выкарыстоўвалася колькасць іонаў 1000, а TIC кожнага ўзору — для разліку нармалізаванай плошчы піка кожнага выяўленага метабаліту з мэтай карэкцыі змяненняў, унесеных інструментальным аналізам пры апрацоўцы ўзору. Пасля нармалізацыі TIC для лагарыфмічнага пераўтварэння і аўтаматычнага маштабавання лініі нормы выкарыстоўваецца MetaboAnalystR(51) (параметр па змаўчанні). Мы выкарыстоўвалі PCA з пакетам vegan R для правядзення даследчыцкага аналізу адрозненняў метабалома паміж тыпамі ўзораў і аналіз частковай рэдундантнасці для аналізу пацыентаў. Выкарыстоўвалі метад Уорда для пабудовы дендраграмы цеплавой карты для кластарызацыі еўклідавай адлегласці паміж узорамі. Мы выкарыстоўвалі ліму (52) па стандартызаванай колькасці метабалітаў для ідэнтыфікацыі дыферэнцыяльна распаўсюджаных метабалітаў па ўсім тыпу клетак і мікраасяроддзі. Каб спрасціць тлумачэнне, мы выкарыстоўваем параметр сярэдняга групавога значэння для ўказання мадэлі і разглядаем тыпы клетак у мікраасяроддзі як кожную групу (n = 6 груп); для тэсту значнасці мы правялі тры паўторныя вымярэнні для кожнага метабаліту. Каб пазбегнуць ілжывай рэплікацыі, пацыент быў уключаны ў якасці перашкоды ў дызайн лімы. Каб праверыць адрозненні ў метабалітах паміж рознымі пацыентамі, мы карэктавалі мадэль лімы, уключыўшы пацыентаў фіксаваным чынам. Мы паведамляем пра значнасць загадзя зададзенага кантрасту паміж тыпам клетак і мікраасяроддзем Padj <0,05 (папраўка Бенджаміні-Хохберга).
Пасля ўзбагачэння энергіяй з выкарыстаннем набору для выдалення мёртвых клетак Miltenyi (жыццяздольнасць >80%) было праведзена секвенаванне транскрыптомаў адзінкавых клетак на ўсіх жывых замарожаных узорах асцыту і пухлін з выкарыстаннем пратаколу экспрэсіі генаў 10x 5′. Былі прааналізаваны пяць выпадкаў з супадаючымі пухлінамі і асцытам, хоць нізкая жыццяздольнасць аднаго ўзору пухліны перашкодзіла яго ўключэнню. Каб дасягнуць некалькіх адбораў пацыентаў, мы аб'ядналі ўзоры кожнага пацыента ў палосах 10-кратнага хромавага кантролера і асобна прааналізавалі асцыт і ўчасткі пухліны. Пасля секвенавання [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; у сярэднім 73 488 і 41 378 счытванняў на клетку для пухліны і асцыту адпаведна]], мы выкарыстоўвалі CellSNP і Vireo (53) (на аснове CellSNP як Агульны чалавечы SNP (VCF), прадстаўлены GRCh38, мае прысвоены ідэнтычнасць донара. Мы выкарыстоўваем SNPRelate для вызначэння найбліжэйшай ідэнтычнасці (IBS) генатыпнага статусу пацыента (IBS), выключаючы непрызначаныя клеткі і клеткі, ідэнтыфікаваныя як дуплексы, і супадаючыя донары паміж узорамі асцыту і пухліны (54). На падставе гэтай задачы мы захавалі тры выпадкі з багатым прадстаўленнем клетак у пухліне і асцыце для далейшага аналізу. Пасля выканання этапу масавай фільтрацыі ў ўпакоўцы BioConductor scater (55) і scran (56) гэта дало 6975 клетак (2792 і 4183 клеткі з пухліны і асцыту адпаведна) для аналізу. Мы выкарыстоўваем кластэрызацыю Лувена (57) агульнай сеткі бліжэйшых суседзяў (SNN) на аснове адлегласці Жаккара да клетак кластара па экспрэсіі. Кластары былі ўручную анатаваны да меркаваных тыпаў клетак на аснове экспрэсіі маркерных генаў і візуалізаваны з дапамогай t-SNE. Цытаксічныя Т-клеткі вызначаюцца экспрэсіяй CD8A і GZMA, за выключэннем субкластэраў з нізкай экспрэсіяй рыбасомнага бялку. Мы атрымалі доступ да апублікаваных дадзеных Ізара і інш. (16), у тым ліку да іх убудавання t-SNE, якія могуць кантраляваць перакрыццё экспрэсіі паміж маркерамі імунных клетак і экспрэсіяй NNMT.
PBMC былі аддзелены ад прадуктаў падзелу лейкацытаў (STEMCELL Technologies) шляхам цэнтрыфугавання ў градыентнай шчыльнасці Ficoll. Клеткі CD3+ былі вылучаны з PBMC з выкарыстаннем CD3-кулікаў (Miltenyi). У прысутнасці або адсутнасці MNA, клеткі CD3+ былі актываваны звязаным з пласцінай CD3 (5 мкг/мл), растваральным CD28 (3 мкг/мл) і IL-2 (300 адз./мл; Proleukin). У апошні дзень экспансіі жыццяздольнасць (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) і праліферацыя (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ацэньваліся з дапамогай праточнай цытаметрыі. Ацаніце эфектарную функцыю, стымулюючы клеткі PMA (20 нг/мл) і іонаміцынам (1 мкг/мл) з дапамогай GolgiStop на працягу 4 гадзін і кантралюйце CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) і TNFα-флуарэсцэінізатыяцыянат (FITC) (MAb11, BD). Стымулюйце клеткі qPCR і ChIP PMA (20 нг/мл) і іонаміцынам (1 мкг/мл) на працягу 4 гадзін. Супернатант ELISA збіралі да і пасля стымуляцыі PMA (20 нг/мл) і іонаміцынам (1 мкг/мл) на працягу 4 гадзін.
Выконвайце пратакол вытворцы для вылучэння РНК з дапамогай набору RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Выкарыстоўвайце QIAshredder (QIAGEN) для гамагенізацыі ўзору. Выкарыстоўвайце набор High Capacity RNA to cDNA (Thermo Fisher Scientific) для сінтэзу камплементарнай ДНК (кДНК). Выкарыстоўвайце TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) для колькаснай ацэнкі экспрэсіі генаў (у адпаведнасці з пратаколам вытворцы) з наступнымі зондамі: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [гліцэральдэгід-3-фасфат вадароду (GAPDH)] і Hs01010726_m1 (SLC22A2). Узоры былі прааналізаваны на сістэме ПЛР у рэжыме рэальнага часу StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) у хуткасным аптычным 96-лункавым рэакцыйным пласціне MicroAmp (Applied Biosystems) з аптычнай плёнкай MicroAmp. Любое значэнне Ct, якое перавышае 35, лічыцца вышэйшым за парог выяўлення і пазначаецца як невыяўляльнае.
Выканайце ChIP, як апісана раней (58). Карацей кажучы, клеткі апрацоўвалі фармальдэгідам (канчатковая канцэнтрацыя 1,42%) і інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 10 хвілін. Выкарыстоўвайце дадатковы буфер для набракання (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl і 0,1% NP-40) на лёдзе на працягу 10 хвілін, затым рэсуспендуйце ў буферы для імунапрэцыпітацыі, як апісана (58). Затым узор апрацоўвалі ультрагукам з наступнымі цыкламі: 10 цыклаў (20 1-секундных імпульсаў) і статычны час 40 секунд. Інкубуйце імунаглабулін G класа ChIP (Cell Signaling Technology; 1 мкл), гістон H3 (Cell Signaling Technology; 3 мкл), NFAT (Invitrogen; 3 мкл) і SP1 (Cell Signaling Technology; 3 мкл) антыцелы з узорам пры 4°C, страсянайце на працягу ночы. Інкубуйце гранулы бялку А (Thermo Fisher Scientific) з узорам пры тэмпературы 4°C пры лёгкім страсяненні на працягу 1 гадзіны, затым выкарыстоўвайце гранулы chelex (Bio-Rad) для ўзбагачэння ДНК і пратэіназу K (Thermo Fisher) для пераварвання бялку. Прамотар TNFα быў выяўлены з дапамогай ПЛР: прамы, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; наадварот, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (прадукт 207 пар асноў). Выявы былі атрыманы з дапамогай Image Lab (Bio-Rad) і колькасна вызначаны з дапамогай праграмнага забеспячэння ImageJ.
Супернатант клетачнай культуры збіралі, як апісана вышэй. Вызначэнне праводзілі ў адпаведнасці з працэдурамі вытворцы набораў для выяўлення TNFα і IL-2 (Invitrogen) і IFN-γ (Abcam). Згодна з пратаколам вытворцы, супернатант разводзілі ў суадносінах 1:100 для выяўлення TNFα і IL-2 і 1:3 для выяўлення IFN-γ. Для вымярэння паглынання пры 450 нм выкарыстоўвалі шматлабельны счытвальнік EnVision 2104 (PerkinElmer).
PBMC былі аддзеленыя ад прадуктаў падзелу лейкацытаў (STEMCELL Technologies) з дапамогай цэнтрыфугавання ў градыентнай шчыльнасці Ficoll. Клеткі CD3+ былі вылучаны з PBMC з выкарыстаннем CD3-кулікаў (Miltenyi). У прысутнасці або адсутнасці MNA, клеткі CD3+ актываваліся звязаным з пласцінай CD3 (5 мкг/мл), растваральным CD28 (3 мкг/мл) і IL-2 (300 адз./мл; Proleukin) на працягу 3 дзён. Праз 3 дні клеткі збіралі і прамывалі 0,9% фізіялагічным растворам, а асадак замарожвалі. Падлік клетак праводзілі з дапамогай праточнай цытаметрыі (Cytek Aurora; канфігурацыя 3L-16V-14B-8R) з выкарыстаннем 123count eBeads.
Экстрагуйце метабаліты, як апісана вышэй. Высушаны экстракт быў адноўлены ў канцэнтрацыі 4000 клеткавых эквівалентаў/мкл. Аналізуйце ўзор з дапамогай храматаграфіі з адваротнай фазай (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія) і калонкі CORTECS T3 (2,1×150 мм, памер часціц 1,6 мкм, памер пор 120 Å; #186008500, Waters). Палярны мас-спектрометр (6470, Agilent), у якім іанізацыя электрараспыленнем працуе ў станоўчым рэжыме. Рухомая фаза А - гэта 0,1% мурашынай кіслаты (у H2O), рухомая фаза В - гэта 90% ацэтанітрылу, 0,1% мурашынай кіслаты. Градыент ВХ складае ад 0 да 2 хвілін для 100% А, ад 2 да 7,1 хвіліны для 99% В і ад 7,1 да 8 хвілін для 99% В. Затым зноў ураўнаважыць калонку рухомай фазай А пры хуткасці патоку 0,6 мл/мін на працягу 3 хвілін. Хуткасць патоку складае 0,4 мл/мін, а камеру калонкі награваюць да 50°C. Выкарыстоўвайце чысты хімічны стандарт MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Норт-Ёрк, Антарыё, Канада) для вызначэння часу ўтрымання (RT) і пераўтварэння (RT = 0,882 хвіліны, пераўтварэнне 1 = 137→94,1, пераўтварэнне 2 = 137→92, пераўтварэнне 3 = 137→78). Калі ўсе тры пераходы адбываюцца пры правільным часе ўтрымання, пераход 1 выкарыстоўваецца для колькаснага вызначэння, каб забяспечыць спецыфічнасць. Стандартная крывая MNA (Toronto Research Chemical Company) была пабудавана шляхам шасці паслядоўных развядзенняў асноўнага раствора (1 мг/мл) для атрымання стандартаў з канцэнтрацыяй 0,1, 1,0, 10 і 100 нг/мл і 1,0 і 10 мкг/мл адпаведна. Мяжа выяўлення складае 1 нг/мл, а лінейны адказ знаходзіцца ў дыяпазоне ад 10 нг/мл да 10 мкг/мл. Кожная ін'екцыя двух мікралітраў узору і стандарту выкарыстоўваецца для аналізу вадкаснай хроматографіяй/мас-спектрометрыяй (LC/MS), і змешаны кантрольны ўзор якасці праводзіцца кожныя восем ін'екцый для забеспячэння стабільнасці аналітычнай платформы. Адказы MNA ўсіх узораў клетак, апрацаваных MNA, знаходзіліся ў межах лінейнага дыяпазону аналізу. Аналіз дадзеных праводзіўся з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння для колькаснага аналізу MassHunter (версія 9.0, Agilent).
Канструкцыя αFR-CAR другога пакалення была ўзятая з працы Сонга і інш. (59). Карацей кажучы, канструкцыя змяшчае наступныя кампаненты: лідзіруючую паслядоўнасць CD8a, спецыфічны для αFR аднаканцовы варыябельны фрагмент чалавека, шарнірную і трансмембранную вобласці CD8a, унутрыклетачны дамен CD27 і ўнутрыклетачны дамен CD3z. Поўная паслядоўнасць CAR была сінтэзавана з дапамогай GenScript, а затым кланавана ў экспрэсійны вектар лентывіруса другога пакалення перад экспрэсійнай касетай GFP, якая выкарыстоўвалася для ацэнкі эфектыўнасці трансдукцыі.
Лентывірус атрымліваюць шляхам трансфекцыі клетак HEK293T [Амерыканская калекцыя тыповых культур (ATCC)], вырошчваюць у мадыфікаваным асяроддзі Ігла Дульбека, якое змяшчае 10% фетальнай бычынай сыроваткі (FBS) і 1% PenStrep, з выкарыстаннем вектара CAR-GFP і ўпаковачных плазмід (psPAX2 і pMD2.G, Addgene) выкарыстоўваюць ліпафекцыйны амін (Sigma-Aldrich). Супернатант, які змяшчае вірус, збіраюць праз 48 і 72 гадзіны пасля трансфекцыі, фільтруюць і канцэнтруюць ультрацэнтрыфугаваннем. Захоўваюць канцэнтраваны вірусны супернатант пры тэмпературы -80°C да трансдукцыі.
PBMC аддзяляюць ад прадуктаў падзелу лейкацытаў здаровых донараў (STEMCELL Technologies) шляхам цэнтрыфугавання ў градыентнай шчыльнасці Ficoll. Для вылучэння клетак CD8+ з PBMC выкарыстоўвайце мікрашарыкі CD8 з станоўчай селекцыяй (Miltenyi). Стымулюйце Т-клеткі з дапамогай TransAct (Miltenyi) і ў асяроддзі TexMACS [Miltenyi; з даданнем 3% інактываванай цяплом сыроваткі чалавека, 1% PenStrep і IL-2 (300 адз./мл)]. Праз дваццаць чатыры гадзіны пасля стымуляцыі Т-клеткі трансдукуюць лентывірусам (10 мкл канцэнтраванага віруснага супернатанту на 106 клетак). Праз 1-3 дні пасля трансдукцыі на Cytek Aurora (на FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) ацэньвайце экспрэсію GFP клетак, каб прадэманстраваць эфектыўнасць трансдукцыі не менш за 30%.
Клеткі CAR-T культывавалі на працягу 24 гадзін у асяроддзі Immunocult (STEMCELL Technologies; з даданнем 1% PenStrep) пры наступных умовах: неапрацаваныя, апрацаваныя 250 мкМ адэназіну або 10 мМ MNA. Пасля папярэдняй апрацоўкі клеткі CAR-T прамывалі PBS і аб'ядноўвалі з 20 000 клетак SK-OV-3 [ATCC; у асяроддзі McCoy 5A (Sigma-Aldrich), дададзеным 10% FBS і 1% PenStrep пры 10: Суадносіны эфектара да мішэні, роўнае 1, ампліфікавалі ў трох экзэмплярах у дапоўненым асяроддзі Immunocult. Клеткі SK-OV-3 і клеткі SK-OV-3, лізаваныя дыгіталісавым сапанінам (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich), выкарыстоўвалі ў якасці адмоўнага і станоўчага кантролю адпаведна. Пасля 24 гадзін сумеснага культывавання супернатант збіралі, і вымяралі лактатдэгідрагеназу (LDH) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Супернатант ЛДГ разводзілі ў буферы ЛДГ у суадносінах 1:50. Працэнт забойства вымяралі па наступнай формуле: працэнт забойства = працэнт карэкцыі / максімальная хуткасць забойства х 100%, дзе працэнт карэкцыі = толькі сумесная культура Т-клетак, а максімальная хуткасць забойства = станоўчы кантроль - адмоўны кантроль.
Як апісана ў тэксце або матэрыялах і метадах, для статыстычнага аналізу выкарыстоўвайце GraphPad Prism 8, Microsoft Excel або R версіі 3.6.0. Калі ў аднаго пацыента сабрана некалькі ўзораў (напрыклад, асцыт і пухліна), мы выкарыстоўваем парны t-крытэрый або ўключаем пацыента як выпадковы эфект у лінейную або абагульненую мадэль, па меры неабходнасці. Для метабаломнага аналізу тэст на важнасць праводзіцца ў трох паўторах.
Дадатковыя матэрыялы да гэтага артыкула можна знайсці па спасылцы http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Гэты артыкул знаходзіцца ў адкрытым доступе і распаўсюджваецца ў адпаведнасці з умовамі ліцэнзіі Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, якая дазваляе выкарыстанне, распаўсюджванне і прайграванне на любым носьбіце, калі канчатковае выкарыстанне не мае камерцыйнай выгады, і перадумовай з'яўляецца правільнасць арыгінальнага твора. Спасылка.
Заўвага: Мы просім вас падаць свой адрас электроннай пошты толькі для таго, каб чалавек, якога вы рэкамендуеце для старонкі, ведаў, што вы хочаце, каб ён бачыў ліст, і што гэта не спам. Мы не будзем фіксаваць ніякіх адрасоў электроннай пошты.
Гэтае пытанне выкарыстоўваецца для праверкі таго, ці з'яўляецеся вы наведвальнікам, і для прадухілення аўтаматычнай рассылкі спаму.
Марыса К. Кілгур (Marisa K. Kilgour), Сара Макферсан (Sarah MacPherson), Ларэн Г. Захарыяс (Lauren G. Zacharias), Эбігейл Элі Арыс Г. Уотсан (H. Watson), Джон Стэг (John Stagg), Брэд Х. Нэльсан (Brad H. Nelson), Ральф Дж. Дэ Беллардзіні (Ralph J. Дэ Берардзініс), Расэл Г. Джонс (Russell G. Jones), Фінеас Т. Гамільтан (Phineas T.
МНА спрыяе імунасупрэсіі Т-клетак і ўяўляе сабой патэнцыйную мішэнь імунатэрапіі для лячэння раку ў чалавека.
Марыса К. Кілгур (Marisa K. Kilgour), Сара Макферсан (Sarah MacPherson), Ларэн Г. Захарыяс (Lauren G. Zacharias), Эбігейл Элі Арыс Г. Уотсан (H. Watson), Джон Стэг (John Stagg), Брэд Х. Нэльсан (Brad H. Nelson), Ральф Дж. Дэ Беллардзіні (Ralph J. Дэ Берардзініс), Расэл Г. Джонс (Russell G. Jones), Фінеас Т. Гамільтан (Phineas T.
МНА спрыяе імунасупрэсіі Т-клетак і ўяўляе сабой патэнцыйную мішэнь імунатэрапіі для лячэння раку ў чалавека.
©2021 Амерыканская асацыяцыя садзейнічання развіццю навукі. усе правы абаронены. AAAS з'яўляецца партнёрам HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.